استكشاف العمل الدوائي والآلية الجزيئية للساليدروسيد في تثبيط تكاثر خلايا MCF-7 وهجرتها

Summary

يصف هذا البروتوكول استراتيجية شاملة لتقييم العمل الدوائي وآلية الساليدروسيد في تثبيط تكاثر خلايا MCF-7 وهجرتها.

Abstract

يحتوي Salidroside (Sal) على أنشطة دوائية مضادة للسرطان ومضادة لنقص الأكسجين ومضادة للالتهابات. ومع ذلك ، فقد تم توضيح آلياته الأساسية المضادة لسرطان الثدي بشكل غير كامل. ومن ثم ، يهدف هذا البروتوكول إلى فك تشفير إمكانات Sal في تنظيم مسار PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 في الانتشار الخبيث لخلايا سرطان الثدي البشري MCF-7. أولا ، تم تقييم النشاط الدوائي ل Sal ضد MCF-7 بواسطة CCK-8 ومقايسات خدش الخلية. علاوة على ذلك ، تم قياس مقاومة خلايا MCF-7 عن طريق مقايسات الهجرة وغزو Matrigel. بالنسبة لموت الخلايا المبرمج ومقايسات الدورة ، تمت معالجة خلايا MCF-7 في خطوات مع الملحق V-FITC / PI ومجموعات الكشف عن تلطيخ دورة الخلية لتحليلات قياس التدفق الخلوي ، على التوالي. تم فحص مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) و Ca²⁺ بواسطة DCFH-DA و Fluo-4 AM تلطيخ المناعي. تم تحديد أنشطة Na + -K + -ATPase و Ca^{2 +} -ATPase باستخدام المجموعات التجارية المقابلة. تم تحديد مستويات البروتين والتعبير الجيني في موت الخلايا المبرمج ومسار PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 باستخدام تحليلات اللطخة الغربية و qRT-PCR ، على التوالي. وجدنا أن علاج سال حد بشكل كبير من انتشار وهجرة وغزو خلايا MCF-7 ذات التأثيرات المعتمدة على الجرعة. وفي الوقت نفسه ، أجبرت إدارة سال أيضا خلايا MCF-7 بشكل كبير على الخضوع لموت الخلايا المبرمج وإيقاف دورة الخلية. أظهرت اختبارات التألق المناعي أن سال حفز بشكل ملحوظ إنتاج ROS و Ca²⁺ في خلايا MCF-7. أكدت بيانات أخرى أن سال عزز مستويات التعبير عن البروتينات المؤيدة لموت الخلايا المبرمج ، باكس ، بيم ، كاسباز المشقوق -9/7/3 ، والجينات المقابلة لها. باستمرار ، قلل تدخل سال بشكل بارز من التعبير عن بروتينات Bcl-2 و p-PI3K / PI3K و p-AKT / AKT و mTOR و HIF-1α و FoxO1 والجينات المقابلة لها. في الختام ، يمكن استخدام Sal كمركب مشتق من الأعشاب لعلاج سرطان الثدي ، لأنه قد يقلل من الانتشار الخبيث والهجرة وغزو خلايا MCF-7 عن طريق تثبيط مسار PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

Introduction

كواحد من أكثر أنواع السرطان التي يتم تشخيصها شيوعا والأورام الخبيثة الأكثر شيوعا ، تشير أحدث الإحصاءات إلى ظهور 2.3 مليون حالة من سرطان الثدي حول العالم بحلول عام 2020 ، وهو ما يمثل 11.7٪ من جميع حالات السرطان¹. تشمل الأعراض الشائعة لسرطان الثدي إيلام الثدي وخزه ، وكتل الثدي والألم ، وإفرازات الحلمة ، وتآكل الجلد أو غائرته ، وتضخم الغدد الليمفاوية الإبطية ^1,2. والأمر الأكثر إثارة للقلق هو أن عدد الحالات الجديدة ومعدل الإصابة الإجمالي بسرطان الثدي مستمران في الزيادة بمعدل هائل كل عام ، وهو ما يمثل 6.9٪ من الوفيات المرتبطة بالسرطان¹. في الوقت الحاضر ، لا يزال التدخ....

Protocol

تم الحصول على خلايا MCF-7 المستخدمة في هذه الدراسة من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).

1. ثقافة الخلية

1. قم بزراعة خلايا MCF-7_{في جو CO} 2 مرطب بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية مع DMEM يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ بنسلين (10000 وحدة / مل) / ستربتومايسين (10000 ميكروغرام / مل) (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: تم استخدام الخلايا التي تغطي 90٪ من قاع الطبق للتجربة وتم تعيينها في المجموعات التالية: مجموعة التحكم ، مجموعة دوكسوروبيسين هيدروكلوريد (DXR ، 5 ميكرومتر) ، ومجموعات سال (20 ميكرومتر ، 40 ميكرومتر ، و 80 ميكرومتر) ، أو مجموعة التحكم ، LY294002 (10 ميكرومتر ، مثبط ل PI3K) ، مجموعة Sal (....

النتائج

آثار سال على تثبيط الانتشار الزائد وتأخير التئام الجروح في خلايا MCF-7
للتحقق من إمكانات Sal ضد سرطان الثدي ، اختبرنا أولا خصائصه المضادة للسرطان باستخدام سمية تكاثر الخلايا وفحوصات الخدش لخط خلايا سرطان الثدي البشري MCF-7. تم تحضين هذه الخلايا بشكل مشترك مع سلسلة تركيز من Sal (5-320 μM) ل?.......

Discussion

يصيب سرطان الثدي الأفراد من جميع الأعمار ويسبب عبئا جسديا وعقليا لا يحصى وضغطا اقتصاديا كبيرا¹. كما اجتذب سرطان الثدي ، مع زيادة معدلات المراضة والوفيات كل عام ، اهتماما عالميا من حيث البحث عن علاجات مركبة عشبية فعالة تتجاوز العلاجات التقليدية ^4,5

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin/streptomycin	HyClone	SV30010
AKT antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YT0185
Annexin V-FITC/PI kit	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	AP101
Automatic microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax iD5
Bax antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#5023
BCA kit	Biosharp Life Sciences	BL521A
Bcl-2 antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#15071
Bim antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#2933
Ca2+–ATPase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A070-4-2
Cell counting kit-8	Biosharp Life Sciences	BS350B
Cell cycle staining kit	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	CCS012
cleaved caspase-3	Cell Signaling Technology, Inc.	#9661
cleaved caspase-7	Cell Signaling Technology, Inc.	#8438
cleaved caspase-9	Cell Signaling Technology, Inc.	#20750
Crystal violet solution	Beyotime Biotechnology	C0121
DMEM high glucose culture medium	Servicebio Technology Co., Ltd.	G4510
Doxorubicin hydrochloride	MedChemExpress	HY-15142
ECL chemiluminescent solution	Biosharp Life Sciences	BL520B
Fetal bovine serum	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	164210
Flow cytometer	BD	FACSCanto
Fluo-4 AM	Beyotime Biotechnology	S1060
FoxO1 antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	70-GAR0072
GraphPad Prism software	La Jolla	Version 6.0
HIF-1α antibody	Affinity Biosciences	BF8002
Human breast cancer cell line MCF-7	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	CL-0149
Loading buffer	Biosharp Life Sciences	BL502B
LY294002	MedChemExpress	HY-10108
Matrigel	Thermo	356234
mTOR antibody	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11405
Na+–K+–ATPase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A070-2-2
Optical microscope	Olympus	IX71PH
p-AKT antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YP0006
PI3K antibody	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11525
p-PI3K antibody	Affinity Biosciences	AF3241
Quantitative western blot imaging system	Touch Image Pro	eBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit	Servicebio Technology Co., Ltd.	G3330-100
ROS assay kit	Beyotime Biotechnology	S0033S	DCFH-DA fluorescence probe is included here
Salidroside	Chengdu Herbpurify Co., Ltd.	H-040
SDS-PAGE kit	Servicebio Technology Co., Ltd.	G2003-50T
Total RNA isolation kit	Foregene	RE-03014
Trypsin	HyClone	SH30042.01
β-actin	Affinity Biosciences	AF7018