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要約

現在のプロトコルはMCF-7セル拡散および移動の禁止のサリドロシドの薬理学の行為そしてメカニズムを評価するための広範囲の作戦を記述する。

要約

サリドロシド(Sal)には、抗発がん性、抗低酸素性、および抗炎症性の薬理活性が含まれています。.しかし、その根底にある抗乳がんメカニズムは不完全にしか解明されていません。それ故に、このプロトコルは人間の乳癌MCF-7セルの悪性増殖のPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1細道の調整のSalの潜在性を解読するように意図した。まず、MCF-7に対するSalの薬理活性をCCK-8および細胞スクラッチアッセイによって評価した。さらに、MCF-7細胞の耐性は、遊走およびマトリゲル浸潤アッセイによって測定されました。細胞アポトーシスおよびサイクルアッセイでは、MCF-7細胞をそれぞれアネキシンV-FITC/PIおよびフローサイトメトリー解析用の細胞周期染色検出キットを用いて段階的に処理しました。活性酸素種(ROS)およびCa2+のレベルをDCFH-DAおよびFluo-4 AM免疫蛍光染色によって調べました。Na+-K+-ATPaseおよびCa2+-ATPaseの活性は、対応する市販キットを用いて測定した。アポトーシスおよびPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1経路におけるタンパク質および遺伝子発現レベルは、それぞれウェスタンブロットおよびqRT-PCR解析を用いてさらに決定された。Sal処理は、用量依存的な効果でMCF-7細胞の増殖、遊走、および浸潤を有意に制限することがわかりました。一方、サル投与は、MCF-7細胞を劇的にアポトーシスと細胞周期停止に追いやった。免疫蛍光試験では、SalがMCF-7細胞におけるROSおよびCa2+産生を観察的に刺激することが示されました。さらなるデータにより、Salはアポトーシス促進性タンパク質であるBax、Bim、切断されたカスパーゼ-9/7/3、およびそれらに対応する遺伝子の発現レベルを促進することが確認されました。一貫して、Sal介入は、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α、およびFoxO1タンパク質およびそれらに対応する遺伝子の発現を顕著に減少させた。結論として、Salは、PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1経路を阻害することにより、MCF-7細胞の悪性増殖、遊走、および浸潤を減少させる可能性があるため、乳がんを治療するための潜在的なハーブ由来の化合物として使用できます。

概要

最も一般的に診断されるがんの1つであり、最も一般的な悪性腫瘍の1つである乳がんは、最新の統計によると、2020年までに世界中で230万例が発生し、全がん症例の11.7%を占めています1。乳がんの一般的な症状には、乳房の圧痛とうずき、乳房のしこりと痛み、乳頭の分泌物、びらんまたはくぼんだ皮膚、および腋窩リンパ節の肥大が含まれます1,2。さらに憂慮すべきことに、乳がんの新規患者数と全体的な発生率は毎年圧倒的な速度で増加し続けており、がん関連死の6.9%を占めています1。現在、乳がんの介入は、化学療法、手術、放射線療法、および包括的な治療が中心です。治療は患者の再発率と死亡率を効果的に低下させることができますが、長期治療の適用はしばしば多剤耐性、広範囲の脱毛、吐き気と嘔吐を引き起こし、深刻な精神的および心理的負担を引き起こします2,3。特に、乳がんによる多臓器転移の潜在的なリスクは、薬物療法の新しいハーブ源を探すことを人々に強いています4,5。

ホスホイノシチド3キナーゼ(PI3K)を介したシグナル伝達は、複数の遺伝子の発現に影響を与えるスプライシングを介して、乳がんの増殖、増殖、および生存に関与しています6。PI3Kの下流シグナルセンシングタンパク質として、プロテインキナーゼB(AKT)が哺乳類のラパマイシン標的(mTOR)タンパク質と結合して乳がんをさらに増加させる可能性があることを示唆する多くの証拠があります7,8,9。さらに、PI3K / AKT / mTORシグナル伝達の不活性化は、乳がんの悪性増殖を阻害し、アポトーシスを刺激する薬物の重要な要素であるとも主張されています10,11,12。腫瘍微小環境における極端な低酸素状態は、低酸素誘導性第1因子アルファ(HIF-1α)の大規模な急増を余儀なくされ、乳がんの進行をさらに悪化させることはよく知られています13,14,15。並行して、AKT刺激はHIF-1αの過剰蓄積にもつながり、乳がんサンプルのアポトーシスを制限します16,17。興味深いことに、PI3K-AKT-HIF-1αシグナル伝達の活性化は、肺がん18、大腸がん19、卵巣がん20、前立腺がん21など、さまざまながんの病理学的進行と転移に関与していることが確認されています。HIF-1αによって調整されることに加えて、分岐頭部転写因子1(FoxO1)の過剰発現は、AKTシグナル伝達刺激によっても引き起こされ、乳がん細胞の周期停止とアポトーシスの阻害を促進します22,23。まとめると、上記の確かな証拠は、PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1シグナル伝達のカスケードの阻害が、乳がんにおける薬物療法の潜在的な新規標的である可能性があることを示唆しています。

サリドロシド(Sal)は、抗癌24,25、抗低酸素26,27,28,29、および免疫増強薬理活性30を発揮することが広く実証されています。水に溶けやすい薄茶色または褐色の粉末であり、フェニルエタノイド配糖体の一種であり、化学構造式はC14H 20 O7であり、分子量は300.331,32である。現代の薬理学的研究は、SalがPI3K-AKT-mTORシグナル伝達を抑制することにより、胃癌細胞のアポトーシスを促進することができることを実証している24。さらなる証拠はまた、Sal治療によるPI3K-AKT-HIF-1αシグナル伝達の抑制が、化学療法剤に対する感受性を高めることによって癌細胞のアポトーシスに寄与する可能性があることを示唆しています25。証拠はまた、サルが細胞の移動と浸潤を制限し、ヒト乳がんMCF-7細胞のアポトーシスを促進することによって周期停止を引き起こすことを示唆しています33,34。しかし、SalがPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1シグナル伝達を調節し、MCF-7細胞の悪性増殖を阻害できるかどうかは、まだ不明である。従って、このプロトコルはPI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1細道によってMCF-7セル移動、浸潤、細胞周期およびapoptosisに対するSalの効果を探検することを向けた。細胞遊走や浸潤の評価、フローサイトメトリーによるアポトーシスや細胞周期の検出、活性酸素種(ROS)、Ca2+蛍光測定など、従来型の低コストで独立した実験からなる統合研究戦略は、従来の漢方薬を用いた抗がん研究の実験の全体的なデザインの参考となります。本研究の実験過程を図1に示す。

プロトコル

本研究に用いたMCF-7細胞は、市販の供給源から入手した( 材料表参照)。

1. 細胞培養

  1. MCF-7細胞を加湿した5%CO2 雰囲気、37°C、10%FBSおよび1%ペニシリン(10,000 U/mL)/ストレプトマイシン(10,000 μg/mL)を含むDMEMで培養します( 材料表参照)。
    注:ディッシュの底の90%を覆う細胞を実験に用い、対照群、塩酸ドキソルビシン群(DXR、5μM)、Sal群(20μM、40μM、80μM)、または対照群、LY294002(10μM、PI3K阻害剤)群、Sal(80μM)群、LY294002(10μM)+Sal(80μM)群に割り付けた( 材料表参照)。

2. 細胞生存率アッセイ

注: この手順の詳細については、以前のレポート27 を参照してください。

  1. 密度8 x 104 細胞/ウェルのMCF-7細胞を96ウェルプレートに播種し、細胞が接着するまで、Sal(10 μM、20 μM、40 μM、80 μM、160 μM、および320 μM)で24時間またはSal(20、40、80 μM)で12時間/24時間/36時間/48時間インキュベートします。
  2. 処理後、MCF-7細胞を10 μL/ウェルのCCK-8溶液( 材料表を参照)と2時間共インキュベートします。次に、自動マイクロプレートリーダーで450nm(OD450)の光学濃度を測定します。

3. 細胞の遊走と浸潤

注:この手順の詳細については、以前のレポート35を参照してください。

  1. 2 mL の 5 x 10 6 細胞/mL 細胞を6 ウェルプレートに播種し、皿の底の 90% を覆うようにインキュベートします。
  2. 滅菌ピペットチップで細胞単層の中心に沿って線状の引っ掻き傷を巻きます。0時間、24時間、48時間で光学顕微鏡を使用して画像を取得します。
  3. Image Jソフトウェアを使用して、引っかき傷の幅を測定します。
  4. トランズウェルアッセイでは、MCF-7細胞を血清培地なしで懸濁し、マトリゲルの有無にかかわらず、プレコートされた上部トランスウェルチャンバーにシードします( 材料表を参照)。
  5. トランズウェルチャンバーの底部では、化学誘導剤としてDMEM完全培地を使用します。24時間後、上部チャンバー内の細胞を除去し、残りの侵襲性細胞および移動細胞をメタノール35で固定する。
  6. MCF-7細胞をクリスタルバイオレット溶液で染色します( 材料表を参照)。光学顕微鏡を使用して画像を撮影します。

4. Na+-K+-ATPaseおよびCa2+-Mg2+-ATPaseの活性評価

  1. ビシンコニン酸(BCA)キットを使用して、製造元の指示に従って、溶解したMCF-7細胞のタンパク質濃度を測定します( 材料表を参照)。
    1. 溶解した細胞のサンプルを対応するグループの96ウェルプレートに加えます。その後、作業溶液を加えて、さらに37°Cで5分間インキュベートします。最後に、多機能マイクロプレートリーダーでOD636 の値を測定します。

5. アポトーシスと細胞周期のフローサイトメトリー解析

注:この手順の詳細については、以前のレポート31を参照してください。

  1. 細胞を消化し、回収してリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁し、アネキシンV-FITCおよびヨウ化プロピジウム(PI)( 材料表を参照)で20分間染色した後、フローサイトメーターを使用してアポトーシス細胞の数を決定します。
  2. 再懸濁したサンプル溶液とPI溶液を混合して30分間インキュベーションした後、フローサイトメーターで検出します。

6. DCFH-DAおよびFluo-4 AM蛍光染色

注: この手順の詳細については、以前のレポート29 を参照してください。

  1. MCF-7細胞を10 μM DCFH-DA 蛍光プローブ( 材料表参照)を用いて37°Cで20分間インキュベートします。 PBSで3回洗浄して余剰DCFH-DAを十分に除去した後、励起波長488nm、発光波長525nmの蛍光強度を蛍光顕微鏡で検査します。
  2. MCF-7細胞を5 μM Fluo-4 AM蛍光プローブ溶液( 材料表参照)と37°Cで45分間インキュベートします。 PBSで3回洗浄した後、蛍光顕微鏡を用いて、励起波長488nm、発光波長516nmの蛍光強度値を求めます。

7.ウェスタンブロット

  1. 異なる薬物を含む5 x 10 6細胞/mL細胞懸濁液2 mLを6 ウェルプレートに加え、37°C、5%CO2 インキュベーターで24時間培養します。
    注:ウェスタンブロット解析のグループは、対照群、LY294002(10μM)群、Sal(80μM)群、LY294002(10μM)+Sal(80μM)群として設定しました( 材料表参照)。
  2. 細胞と上清を回収し、560 × g 、4°C、3分間遠心分離します。上澄みを捨て、予冷したPBSで2回洗浄する。各洗浄後、細胞を560 × g 、4°C、3分間遠心分離します。
  3. ステップ 7.2 の細胞サンプルに 50 μL の溶解バッファーを加え、15 分間のアイスバスを行います。8550 × g 、4°C、10分間遠心分離し、上清タンパク質サンプルを回収します。
  4. BCA法を用いてタンパク質濃度を検出した後、ステップ7.3のタンパク質サンプルとローディングバッファーを4:1の割合で混合し、金属浴中で100°Cで10分間変性させ、室温まで冷却します。
  5. ステップ7.4のタンパク質サンプル20 μgを添加し、10% SDS-PAGE(材料表を参照)を使用して分子量35の異なるタンパク質を分離し、0.22 μmのPVDFメンブレンに移します。5% BSAで閉塞した後、メンブレンを対応する一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートします。
    注:一次抗体の希薄濃度は1:1,000です:切断カスパーゼ-9/7/3(CC-9/7/3)、Bim、Bax、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α、FoxO1、およびβ-アクチン( 材料表を参照)。
  6. 翌日、メンブレンをヤギ抗ウサギIgG二次抗体と37°Cで2時間インキュベートします。 ECL化学発光溶液を使用してメンブレンを現像し、非接触定量ウェスタンブロットイメージングシステムを使用して画像を撮影します( 材料表を参照)。

8. qRT-PCRの

  1. 遠心分離を行い、MCF-7細胞を560 x g 、4°C、3分間回収し、500 μLのバッファーRL1を5 × 106 細胞に加えます。細胞塊が見えなくなるまでピペットで繰り返しブローして混合します。
    注:バッファー RL1 は、トータル RNA 単離キットのコンポーネントの 1 つです( 材料表を参照)。
  2. ステップ8.1の細胞ホモジネートをコレクションチューブに埋め込まれたDNAクリーニングカラムに移し、8,550 × g 、4°C、2分間遠心分離します。DNAクリーニングカラムを取り外し、上清をコレクションチューブに保管します。
    注:DNA クリーニングカラムとコレクションチューブは、トータル RNA 分離キットの 2 つのコンポーネントです( 材料表を参照)。
  3. ステップ8.2の上清500μLに緩衝液RL2 800 μLを加え、穏やかに混合する。
    注:バッファー RL2 は、トータル RNA 単離キットのコンポーネントの 1 つです( 材料表を参照)。使用前に、60 mLの緩衝液RL2に120 mLの無水エタノールを加えてください。
  4. ステップ 8.3 の混合物 700 μL をコレクションチューブに埋め込まれた RNA 専用カラムに移し、8,550 × g で 4 °C で 1 分間遠心分離します。回収管内の廃液を廃棄します。
    注:RNA 専用カラムは、トータル RNA 単離キットのコンポーネントの 1 つです( 材料表を参照)。
  5. ステップ8.4を繰り返して、ステップ8.3の残りの混合物を処理します。
  6. 500 μL のバッファー RW1 を RNA 専用カラムに添加し、8,550 × g で 4 °C、1 分間遠心分離します。回収管内の廃液を廃棄します。
    注:バッファー RW1 は、トータル RNA 単離キットのコンポーネントの 1 つです( 材料表を参照)。
  7. 700 μL のバッファー RW2 を RNA 専用カラムに添加し、8,550 × g で 4 ◦C で 1 分間遠心分離します。回収管内の廃液を廃棄します。手順8.7を一度繰り返します。
    注:バッファー RW2 は、トータル RNA 単離キットの成分の 1 つです( 材料表を参照)。
  8. RNA のみのカラムをコレクションチューブに戻し、8550 × g で 4 °C、2 分間遠心分離して、残りのバッファー RW2 を除去します。
  9. RNA 専用カラムを新しいコレクションチューブに移し、65 °C で予熱した RNase フリー ddH2O 100 μL を RNA 専用カラムのメンブレンの中央に滴下します。25°Cで2分間置き、8,550 × g 、4°C、1分間遠心分離してRNA溶液を回収します。
    注:RNaseフリーddH2Oは、total RNA単離キットの成分の1つです( 材料表を参照)。
  10. 5x反応バッファー4 μL、オリゴ(dT)18 プライマー1 μL、ランダム六量体プライマー1 μL、遺伝子特異的プライマー1 μL(表1を参照)、酵素ミックス1 μL、およびステップ8.9のRNA溶液5 μgを100 μLの8チューブストリップに加えます。反応系にRNaseフリーの水を20 μLまで添加します。
  11. システムの反応条件を次のように設定します:(1):95°C、30秒、1サイクル。(2):95°C、5秒、50サイクル、60°C、34秒;(3):95°C、5秒、1サイクル、65°C、60秒、97°C、1秒;(4):42°C、30秒、1サイクル。qRT-PCR手順を実行します。
    注:標的遺伝子の相対発現レベルは、2−ΔΔCT法36,37によって定量的に分析された。qRT-PCR解析に用いた各遺伝子のプライマー情報を表1に示します。

9. 統計解析

  1. データを 3 つの独立した実験の平均±標準偏差として表します。
  2. グラフ作成および分析ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、一元配置分散分析(ANOVA)とそれに続くテューキーの検定を使用して、複数のグループ間の比較を分析します。この研究では、 P < 0.05 を統計的に有意なものとして定義しました。

結果

MCF-7細胞の過剰増殖の抑制と創傷治癒の遅延に対するSalの効果
乳がんに対するSalの可能性を探るために、まずヒト乳がんMCF-7細胞株の細胞増殖毒性と引っかきアッセイを用いて、その抗がん特性をテストしました。これらの細胞をSal(5〜320μM)の濃度系列と24時間共インキュベートし、細胞増殖をCCK-8アッセイを用いて評価した。細胞増殖に対するSalの用量依存的な阻害効果が観?...

ディスカッション

乳がんはあらゆる年齢層に罹患し、計り知れない肉体的・精神的負担と大きな経済的圧力を引き起こします1。また、罹患率や死亡率が年々増加している乳がんは、従来の治療法を超えた効果的なハーブベースの複合療法の模索という点でも世界的に注目されています4,5。有望なことに、多くの証拠がSal 24,25,38

開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

この研究は、四川省衛生健康委員会(120025)の支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1% penicillin/streptomycinHyCloneSV30010
AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT0185
Annexin V-FITC/PI kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.AP101
Automatic microplate readerMolecular DevicesSpectraMax iD5
Bax antibodyCell Signaling Technology, Inc.#5023
BCA kitBiosharp Life SciencesBL521A
Bcl-2 antibodyCell Signaling Technology, Inc.#15071
Bim antibodyCell Signaling Technology, Inc.#2933
Ca2+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-4-2
Cell counting kit-8Biosharp Life SciencesBS350B
Cell cycle staining kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.CCS012
cleaved caspase-3Cell Signaling Technology, Inc.#9661
cleaved caspase-7Cell Signaling Technology, Inc.#8438
cleaved caspase-9Cell Signaling Technology, Inc.#20750
Crystal violet solutionBeyotime BiotechnologyC0121
DMEM high glucose culture mediumServicebio Technology Co., Ltd.G4510
Doxorubicin hydrochlorideMedChemExpressHY-15142
ECL chemiluminescent solutionBiosharp Life SciencesBL520B
Fetal bovine serumProcell Life Science & Technology Co., Ltd.164210
Flow cytometerBDFACSCanto figure-materials-2474
Fluo-4 AMBeyotime BiotechnologyS1060
FoxO1 antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibodyMultiSciences Biotech Co., Ltd.70-GAR0072
GraphPad Prism softwareLa JollaVersion 6.0
HIF-1α antibodyAffinity BiosciencesBF8002
Human breast cancer cell line MCF-7Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0149
Loading bufferBiosharp Life SciencesBL502B
LY294002MedChemExpressHY-10108
MatrigelThermo 356234
mTOR antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11405
Na+–K+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-2-2
Optical microscopeOlympusIX71PH
p-AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYP0006
PI3K antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11525
p-PI3K antibodyAffinity BiosciencesAF3241
Quantitative western blot imaging systemTouch Image ProeBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kitServicebio Technology Co., Ltd.G3330-100
ROS assay kitBeyotime BiotechnologyS0033SDCFH-DA fluorescence probe is included here
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., Ltd.H-040
SDS-PAGE kitServicebio Technology Co., Ltd.G2003-50T
Total RNA isolation kitForegeneRE-03014
TrypsinHyCloneSH30042.01
β-actinAffinity BiosciencesAF7018

参考文献

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