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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il presente protocollo descrive una strategia completa per valutare l'azione farmacologica e il meccanismo del salidroside nell'inibire la proliferazione e la migrazione delle cellule MCF-7.

Abstract

Il salidroside (Sal) contiene attività farmacologiche anticancerogene, antiipossiche e antinfiammatorie. Tuttavia, i suoi meccanismi anti-cancro al seno sono stati chiariti solo in modo incompleto. Quindi, questo protocollo intendeva decodificare il potenziale di Sal nella regolazione della via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 nella proliferazione maligna delle cellule MCF-7 del carcinoma mammario umano. In primo luogo, l'attività farmacologica di Sal contro MCF-7 è stata valutata mediante CCK-8 e saggi di graffio cellulare. Inoltre, la resistenza delle cellule MCF-7 è stata misurata mediante saggi di migrazione e invasione di Matrigel. Per l'apoptosi cellulare e i saggi del ciclo, le cellule MCF-7 sono state processate in fasi con annessina V-FITC/PI e kit di rilevamento della colorazione del ciclo cellulare per le analisi di citometria a flusso, rispettivamente. I livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e Ca2+ sono stati esaminati mediante colorazione a immunofluorescenza DCFH-DA e Fluo-4 AM. Le attività di Na+-K+-ATPasi e Ca2+-ATPasi sono state determinate utilizzando i corrispondenti kit commerciali. I livelli di espressione proteica e genica nell'apoptosi e nella via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 sono stati ulteriormente determinati utilizzando analisi western blot e qRT-PCR, rispettivamente. Abbiamo scoperto che il trattamento con Sal ha limitato significativamente la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule MCF-7 con effetti dose-dipendenti. Nel frattempo, la somministrazione di Sal ha anche drammaticamente costretto le cellule MCF-7 a subire l'apoptosi e l'arresto del ciclo cellulare. I test di immunofluorescenza hanno mostrato che Sal stimolava in modo osservabile la produzione di ROS e Ca2+ nelle cellule MCF-7. Ulteriori dati hanno confermato che Sal ha promosso i livelli di espressione delle proteine pro-apoptotiche, Bax, Bim, caspasi scissa-9/7/3 e dei loro geni corrispondenti. Coerentemente, l'intervento di Sal ha ridotto in modo prominente l'espressione delle proteine Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α e FoxO1 e dei loro geni corrispondenti. In conclusione, Sal può essere utilizzato come potenziale composto derivato da erbe per il trattamento del cancro al seno, in quanto può ridurre la proliferazione maligna, la migrazione e l'invasione delle cellule MCF-7 inibendo la via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

Introduzione

Essendo uno dei tumori più comunemente diagnosticati e delle neoplasie maligne più comuni, le ultime statistiche indicano che 2,3 milioni di casi di cancro al seno sono emersi in tutto il mondo entro il 2020, pari all'11,7% di tutti i casi di cancro1. I sintomi comuni del cancro al seno includono tensione mammaria e formicolio, noduli e dolore al seno, secrezione dal capezzolo, erosione o pelle infossata e linfonodi ascellari ingrossati 1,2. Ancora più allarmante, il numero di nuovi casi e l'incidenza complessiva del cancro al seno continuano ad aumentare a un ritmo schiacciante ogni anno, rappresentando il 6,9%dei decessi correlati al cancro. Attualmente, l'intervento per il cancro al seno prevede ancora principalmente chemioterapia, chirurgia, radioterapia e trattamento completo. Sebbene il trattamento possa ridurre efficacemente il tasso di recidiva e il tasso di mortalità dei pazienti, l'applicazione del trattamento a lungo termine spesso causa resistenza multifarmaco, perdita di capelli su vasta area, nausea e vomito e grave carico mentale e psicologico 2,3. In particolare, il potenziale rischio di metastasi multiple d'organo da cancro al seno costringe anche le persone a cercare nuove fonti erboristiche di terapia farmacologica 4,5.

La segnalazione mediata dalla fosfoinositide 3 chinasi (PI3K) è implicata nella crescita, nella proliferazione e nella sopravvivenza del carcinoma mammario attraverso lo splicing che influenza l'espressione di più geni6. Come proteina di rilevamento del segnale a valle di PI3K, numerose evidenze suggeriscono che la proteina chinasi B (AKT) potrebbe accoppiarsi con il bersaglio dei mammiferi della proteina rapamicina (mTOR) per aumentare ulteriormente il cancro al seno 7,8,9. Inoltre, la disattivazione della segnalazione PI3K/AKT/mTOR è stata anche ritenuta una componente chiave nei farmaci che inibiscono la proliferazione maligna e stimolano l'apoptosi nel carcinoma mammario10,11,12. È ben noto che l'ipossia estrema nel microambiente tumorale costringe a un massiccio aumento del fattore 1 alfa inducibile dall'ipossia (HIF-1α), che peggiora ulteriormente la progressione del cancro al seno13,14,15. Parallelamente, la stimolazione AKT porta anche a un eccessivo accumulo di HIF-1α, limitando l'apoptosi nei campioni di cancro al seno16,17. È interessante notare che è stato confermato che l'attivazione della segnalazione PI3K-AKT-HIF-1α è coinvolta nella progressione patologica e nelle metastasi in una varietà di tumori, tra cui il cancro del polmone18, il cancro del colon-retto19, il cancro ovarico20 e il cancro alla prostata21. Oltre ad essere orchestrata da HIF-1α, la sovraespressione del fattore di trascrizione della testa biforcuta 1 (FoxO1) è anche innescata dalla stimolazione della segnalazione AKT, che promuove l'arresto del ciclo e l'inibizione dell'apoptosi nelle cellule di cancro al seno22,23. Insieme, le solide evidenze di cui sopra suggeriscono che l'inibizione della cascata di segnalazione PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 può essere un potenziale nuovo bersaglio per la terapia farmacologica nel carcinoma mammario.

È stato ampiamente dimostrato che il salidroside (Sal) esercita attività antitumorali24,25, anti-ipossia26,27,28,29 e immuno-potenzianti30. È una polvere marrone chiaro o marrone facilmente solubile in acqua, è un tipo di glicoside feniletanoide e ha una formula di struttura chimica di C14H 20 O7 e un peso molecolare di300.331,32. Moderne indagini farmacologiche hanno dimostrato che Sal può promuovere l'apoptosi delle cellule tumorali gastriche limitando la segnalazione PI3K-AKT-mTOR24. Ulteriori evidenze suggeriscono anche che la soppressione della segnalazione PI3K-AKT-HIF-1α da parte del trattamento con Sal può contribuire all'apoptosi delle cellule tumorali aumentando la loro sensibilità agli agenti chemioterapici25. L'evidenza suggerisce anche che Sal limita la migrazione e l'invasione cellulare e provoca l'arresto del ciclo promuovendo l'apoptosi nelle cellule MCF-7 del cancro al seno umano33,34. Tuttavia, resta da vedere se Sal può regolare la segnalazione PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 e inibire la proliferazione maligna delle cellule MCF-7. Pertanto, questo protocollo mirava a esplorare gli effetti di Sal sulla migrazione, l'invasione, il ciclo cellulare e l'apoptosi delle cellule MCF-7 attraverso la via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. Le strategie di ricerca integrate che comprendono esperimenti convenzionali, a basso costo e indipendenti, come le valutazioni della migrazione e dell'invasione cellulare, l'apoptosi e il rilevamento del ciclo cellulare mediante citometria a flusso, le specie reattive dell'ossigeno (ROS) e la determinazione della fluorescenza Ca2+, ecc., possono fornire un riferimento per la progettazione complessiva di esperimenti per la ricerca anti-cancro con la medicina erboristica tradizionale. Il processo sperimentale di questo studio è mostrato nella Figura 1.

Protocollo

Le cellule MCF-7 utilizzate per il presente studio sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi la Tabella dei Materiali).

1. Colture cellulari

  1. Coltura delle cellule MCF-7 in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 a 37 °C con DMEM contenente il 10% di FBS e l'1% di penicillina (10.000 U/mL)/streptomicina (10.000 μg/mL) (vedere la tabella dei materiali).
    NOTA: Le cellule che coprono il 90% del fondo del piatto sono state impiegate per l'esperimento e assegnate ai seguenti gruppi: gruppo di controllo, gruppo cloridrato doxorubicina (DXR, 5 μM) e gruppi Sal (20 μM, 40 μM e 80 μM), o gruppo di controllo, gruppo LY294002 (10 μM, un inibitore di PI3K), gruppo Sal (80 μM) e gruppo LY294002 (10 μM) + gruppo Sal (80 μM) (vedere la tabella dei materiali).

2. Saggio di vitalità cellulare

NOTA: Per i dettagli su questa procedura, fare riferimento a un rapporto precedente27.

  1. Seminare cellule MCF-7 con una densità di 8 x 104 cellule/pozzetto in piastre da 96 pozzetti e incubare con Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM e 320 μM) per 24 ore o Sal (20, 40, 80 μM) per 12 ore/24 ore/36 ore/48 ore durante la notte fino a quando le cellule non sono aderenti.
  2. Dopo il trattamento, co-incubare le cellule MCF-7 con 10 μL/pozzetto di soluzione CCK-8 (vedere la tabella dei materiali) per 2 ore. Quindi, misurare la densità ottica a 450 nm (OD450) con un lettore automatico per micropiastre.

3. Migrazione e invasione cellulare

NOTA: Per i dettagli su questa procedura, fare riferimento a un rapporto precedente35.

  1. Incubare 2 mL di 5 x 106 cellule/mL di cellule seminate in piastre a 6 pozzetti per coprire il 90% del fondo della capanna.
  2. Eseguire una ferita lineare a graffio lungo il centro del monostrato cellulare con un puntale sterile per pipetta. Acquisire immagini utilizzando un microscopio ottico a 0 ore, 24 ore e 48 ore.
  3. Utilizzare il software Image J per misurare la larghezza delle ferite da graffio.
  4. Per il saggio del transwell, sospendere le cellule MCF-7 senza terreno sierico e seminare nella camera del transwell superiore pre-rivestita con o senza Matrigel (vedere la Tabella dei materiali).
  5. Nella parte inferiore della camera del pozzetto, utilizzare il terreno DMEM completo come induttore chimico. Dopo 24 ore, rimuovere le cellule nella camera superiore e fissare le restanti cellule invasive e migranti nel metanolo35.
  6. Colorare le cellule MCF-7 con una soluzione di cristallo violetto (vedere la tabella dei materiali). Cattura le immagini utilizzando un microscopio ottico.

4. Valutazione dell'attività di Na+-K+-ATPasi e Ca 2+-Mg2+-ATPasi

  1. Utilizzare un kit di acido bicinchoninico (BCA) per misurare la concentrazione proteica nelle cellule MCF-7 lisate, seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
    1. Aggiungere i campioni delle cellule lisate nei gruppi corrispondenti nelle piastre a 96 pozzetti. Successivamente, aggiungere la soluzione di lavoro per incubare ulteriormente a 37 °C per 5 min. Infine, misurare i valori di OD636 con un lettore multifunzione per micropiastre.

5. Analisi citometrica a flusso dell'apoptosi e del ciclo cellulare

NOTA: Per i dettagli su questa procedura, fare riferimento a un rapporto precedente31.

  1. Digerire le cellule e prelevare per risospenderle in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per una colorazione di 20 minuti con annessina V-FITC e ioduro di propidio (PI) (vedere la tabella dei materiali), quindi determinare il numero di cellule apoptotiche utilizzando un citometro a flusso.
  2. Miscelare la soluzione del campione risospeso con la soluzione PI per un'incubazione di 30 minuti, seguita dal rilevamento con un citometro a flusso.

6. Colorazione a fluorescenza DCFH-DA e Fluo-4 AM

NOTA: Per i dettagli su questa procedura, fare riferimento a un rapporto precedente29.

  1. Incubare le cellule MCF-7 per 20 minuti con una sonda a fluorescenza DCFH-DA da 10 μM (vedere la tabella dei materiali) a 37 °C. Dopo aver rimosso accuratamente il DCFH-DA in eccesso lavando tre volte con PBS, testare l'intensità della fluorescenza alle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente di 488 nm e 525 nm, utilizzando un microscopio a fluorescenza.
  2. Incubare le cellule MCF-7 con una soluzione di sonda fluorescente Fluo-4 AM da 5 μM (vedere la tabella dei materiali) per 45 minuti a 37 °C. Dopo aver lavato con PBS tre volte, determinare i valori di intensità della fluorescenza alle lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione rispettivamente di 488 nm e 516 nm utilizzando un microscopio a fluorescenza.

7. Macchia occidentale

  1. Aggiungere 2 mL di 5 x 10 sospensioni cellulari da 6 cellule/mL contenenti diversi farmaci in piastre a6 pozzetti e fermentare in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
    NOTA: I gruppi per l'analisi western blot sono stati impostati come segue: gruppo di controllo, gruppo LY294002 (10 μM), gruppo Sal (80 μM) e gruppo LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (vedere la tabella dei materiali).
  2. Raccogliere le cellule e il surnatante e centrifugare a 560 × g a 4 °C per 3 min. Scartare il surnatante e lavare due volte con PBS preraffreddato. Dopo ogni lavaggio, centrifugare le celle a 560 × g a 4 °C per 3 min.
  3. Aggiungere 50 μL di tampone di lisi al campione cellulare del passaggio 7.2 per un bagno di ghiaccio di 15 minuti. Centrifugare a 8550 × g a 4 °C per 10 minuti per raccogliere il campione di proteina surnatante.
  4. Dopo aver rilevato la concentrazione proteica con un metodo BCA, miscelare il campione proteico nella fase 7.3 con il tampone di carico in un rapporto di 4:1, denaturare a 100 °C per 10 minuti in un bagno di metallo e raffreddare a temperatura ambiente.
  5. Aggiungere 20 μg del campione proteico del passaggio 7.4, separare le proteine con diversi pesi molecolari35utilizzando SDS-PAGE al 10% (vedere la tabella dei materiali), quindi trasferire su membrane PVDF da 0,22 μm. Dopo il blocco con BSA al 5%, incubare le membrane con i corrispondenti anticorpi primari per una notte a 4 °C.
    NOTA: La concentrazione diluita dei seguenti anticorpi primari è di 1:1.000: caspasi-9/7/3 scissa (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 e β-actina (vedere la tabella dei materiali).
  6. Il giorno successivo, incubare le membrane con l'anticorpo secondario IgG anti-coniglio di capra per 2 ore a 37 °C. Sviluppare le membrane utilizzando una soluzione chemiluminescente ECL e acquisire immagini utilizzando un sistema di imaging western blot quantitativo senza contatto (vedere la tabella dei materiali).

8. PCR qRT

  1. Eseguire la centrifugazione per raccogliere le cellule MCF-7 a 560 x g a 4 °C per 3 minuti e aggiungere 500 μL di tampone RL1 in 5 × 106 cellule. Soffiare e mescolare ripetutamente con una pipetta fino a quando non sono visibili masse cellulari.
    NOTA: Il tampone RL1 è uno dei componenti del kit di isolamento dell'RNA totale (vedere la tabella dei materiali).
  2. Trasferire gli omogenati cellulari nella fase 8.1 nella colonna di pulizia del DNA incorporata nella provetta di raccolta e centrifugare a 8.550 × g a 4 °C per 2 minuti. Rimuovere la colonna di pulizia del DNA e conservare il surnatante nella provetta di raccolta.
    NOTA: La colonna per la pulizia del DNA e la provetta di raccolta sono due dei componenti del kit di isolamento dell'RNA totale (vedere la tabella dei materiali).
  3. Aggiungere 800 μL di tampone RL2 a 500 μL del surnatante del passaggio 8.2 e mescolare delicatamente.
    NOTA: Il tampone RL2 è uno dei componenti del kit di isolamento dell'RNA totale (vedere la tabella dei materiali). Aggiungere 120 mL di etanolo anidro a 60 mL di tampone RL2 prima dell'uso.
  4. Trasferire 700 μL della miscela dalla fase 8.3 nella colonna di solo RNA incorporata nella provetta di raccolta e centrifugare a 8.550 × g a 4 °C per 1 min. Gettare il liquido di scarto nella provetta di raccolta.
    NOTA: La colonna di solo RNA è uno dei componenti del kit di isolamento dell'RNA totale (vedere la tabella dei materiali).
  5. Ripetere il passaggio 8.4 per lavorare la miscela rimanente dal passaggio 8.3.
  6. Aggiungere 500 μL di tampone RW1 alla colonna di solo RNA e centrifugare a 8.550 × g a 4 °C per 1 min. Gettare il liquido di scarto nella provetta di raccolta.
    NOTA: Il tampone RW1 è uno dei componenti del kit di isolamento dell'RNA totale (vedere la tabella dei materiali).
  7. Aggiungere 700 μL di tampone RW2 alla colonna di solo RNA e centrifugare a 8.550 × g a 4 ◦C per 1 min. Gettare il liquido di scarto nella provetta di raccolta. Ripetere il passaggio 8.7 una volta.
    NOTA: Il tampone RW2 è uno dei componenti del kit di isolamento dell'RNA totale (vedere la tabella dei materiali).
  8. Riposizionare la colonna di solo RNA nella provetta di raccolta e centrifugare a 8550 × g a 4 °C per 2 minuti per rimuovere il tampone RW2 rimanente.
  9. Trasferire la colonna di solo RNA in una nuova provetta di raccolta e far gocciolare 100 μL di ddH2O privo di RNasi preriscaldato a 65 °C al centro della membrana per la colonna di solo RNA. Porre a 25 °C per 2 minuti e raccogliere la soluzione di RNA per centrifugazione a 8.550 × g a 4 °C per 1 minuto.
    NOTA: Il ddH2O privo di RNasi è uno dei componenti del kit di isolamento dell'RNA totale (vedere la tabella dei materiali).
  10. Aggiungere 4 μL di tampone di reazione 5x, 1 μL di primer oligo (dT)18 , 1 μL di primer per esamero casuale, 1 μL di primer gene-specifico (vedere Tabella 1), 1 μL di miscela enzimatica e 5 μg della soluzione di RNA del passaggio 8.9 in una striscia da 100 μL a 8 provette. Integrare il sistema di reazione con acqua priva di RNasi a 20 μL.
  11. Impostare le condizioni di reazione del sistema come segue: (1): 95 °C, 30 s, 1 ciclo; (2): 95 °C, 5 s, 50 cicli, 60 °C, 34 s; (3): 95 °C, 5 s, 1 ciclo, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s; e (4): 42 °C, 30 s, 1 ciclo. Eseguire la procedura qRT-PCR.
    NOTA: I livelli di espressione relativi dei geni bersaglio sono stati analizzati quantitativamente con il metodo 2−ΔΔCT 36,37. Le informazioni sul primer di ciascun gene utilizzato per l'analisi qRT-PCR sono elencate nella Tabella 1.

9. Analisi statistica

  1. Esprimere i dati come media ± deviazione standard di tre esperimenti indipendenti.
  2. Analizza i confronti tra più gruppi utilizzando un software di rappresentazione grafica e analisi (vedi la Tabella dei Materiali) con un'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita da un test di Tukey. In questo lavoro, P < 0,05 è stato definito come statisticamente significativo.

Risultati

Effetti del Sal sull'inibizione dell'eccesso di proliferazione e sul ritardo della guarigione delle ferite nelle cellule MCF-7
Per sondare il potenziale di Sal contro il cancro al seno, abbiamo prima testato le sue proprietà antitumorali utilizzando la tossicità della proliferazione cellulare e i saggi di graffio della linea cellulare MCF-7 del cancro al seno umano. Queste cellule sono state co-incubate con una serie di concentrazioni di Sal (5-320 μM) per 24 ore e la proliferazione cellulare è st...

Discussione

Il cancro al seno colpisce individui di tutte le età e provoca un carico fisico e mentale incalcolabile e una grande pressione economica1. Il cancro al seno, con la sua morbilità e mortalità che aumentano ogni anno, ha anche attirato l'attenzione mondiale in termini di ricerca di terapie composte efficaci a base di erbe al di là dei trattamenti convenzionali 4,5. Promettentemente, un ampio corpo di prove ha rivelato gli effetti antitum...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Commissione sanitaria della provincia di Sichuan (120025).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1% penicillin/streptomycinHyCloneSV30010
AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT0185
Annexin V-FITC/PI kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.AP101
Automatic microplate readerMolecular DevicesSpectraMax iD5
Bax antibodyCell Signaling Technology, Inc.#5023
BCA kitBiosharp Life SciencesBL521A
Bcl-2 antibodyCell Signaling Technology, Inc.#15071
Bim antibodyCell Signaling Technology, Inc.#2933
Ca2+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-4-2
Cell counting kit-8Biosharp Life SciencesBS350B
Cell cycle staining kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.CCS012
cleaved caspase-3Cell Signaling Technology, Inc.#9661
cleaved caspase-7Cell Signaling Technology, Inc.#8438
cleaved caspase-9Cell Signaling Technology, Inc.#20750
Crystal violet solutionBeyotime BiotechnologyC0121
DMEM high glucose culture mediumServicebio Technology Co., Ltd.G4510
Doxorubicin hydrochlorideMedChemExpressHY-15142
ECL chemiluminescent solutionBiosharp Life SciencesBL520B
Fetal bovine serumProcell Life Science & Technology Co., Ltd.164210
Flow cytometerBDFACSCanto figure-materials-1956
Fluo-4 AMBeyotime BiotechnologyS1060
FoxO1 antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibodyMultiSciences Biotech Co., Ltd.70-GAR0072
GraphPad Prism softwareLa JollaVersion 6.0
HIF-1α antibodyAffinity BiosciencesBF8002
Human breast cancer cell line MCF-7Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0149
Loading bufferBiosharp Life SciencesBL502B
LY294002MedChemExpressHY-10108
MatrigelThermo 356234
mTOR antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11405
Na+–K+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-2-2
Optical microscopeOlympusIX71PH
p-AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYP0006
PI3K antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11525
p-PI3K antibodyAffinity BiosciencesAF3241
Quantitative western blot imaging systemTouch Image ProeBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kitServicebio Technology Co., Ltd.G3330-100
ROS assay kitBeyotime BiotechnologyS0033SDCFH-DA fluorescence probe is included here
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., Ltd.H-040
SDS-PAGE kitServicebio Technology Co., Ltd.G2003-50T
Total RNA isolation kitForegeneRE-03014
TrypsinHyCloneSH30042.01
β-actinAffinity BiosciencesAF7018

Riferimenti

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