Exploración de la acción farmacológica y el mecanismo molecular del salidrósido en la inhibición de la proliferación y migración de células MCF-7

Resumen

El presente protocolo describe una estrategia integral para evaluar la acción farmacológica y el mecanismo del salidrósido en la inhibición de la proliferación y migración de células MCF-7.

Resumen

El salidrósido (Sal) contiene actividades farmacológicas anticancerígenas, antihipóxicas y antiinflamatorias. Sin embargo, sus mecanismos subyacentes contra el cáncer de mama solo se han dilucidado de manera incompleta. Por lo tanto, este protocolo pretendía decodificar el potencial de Sal en la regulación de la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 en la proliferación maligna de células MCF-7 de cáncer de mama humano. En primer lugar, se evaluó la actividad farmacológica de la Sal frente a MCF-7 mediante ensayos de CCK-8 y scratch celular. Además, la resistencia de las células MCF-7 se midió mediante ensayos de migración e invasión de Matrigel. Para los ensayos de apoptosis y ciclo celular, las células MCF-7 se procesaron en pasos con anexina V-FITC/PI y kits de detección de tinción de ciclo celular para análisis de citometría de flujo, respectivamente. Los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) y Ca²⁺ se examinaron mediante tinción de inmunofluorescencia DCFH-DA y Fluo-4 AM. Las actividades de Na+-K+-ATPasa y Ca²⁺-ATPasa se determinaron utilizando los kits comerciales correspondientes. Los niveles de expresión de proteínas y genes en la apoptosis y la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 se determinaron mediante análisis de Western blot y qRT-PCR, respectivamente. Encontramos que el tratamiento con Sal restringió significativamente la proliferación, migración e invasión de las células MCF-7 con efectos dependientes de la dosis. Mientras tanto, la administración de Sal también obligó drásticamente a las células MCF-7 a sufrir apoptosis y detención del ciclo celular. Las pruebas de inmunofluorescencia mostraron que Sal estimuló de forma observable la producción de ROS y Ca²⁺ en las células MCF-7. Otros datos confirmaron que Sal promovió los niveles de expresión de las proteínas proapoptóticas, Bax, Bim, caspasa-9/7/3 escindida y sus genes correspondientes. Consistentemente, la intervención de Sal redujo de manera prominente la expresión de las proteínas Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α y FoxO1 y sus genes correspondientes. En conclusión, la sal se puede utilizar como un compuesto potencial derivado de hierbas para tratar el cáncer de mama, ya que puede reducir la proliferación, migración e invasión maligna de las células MCF-7 al inhibir la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

Introducción

Como uno de los cánceres más comúnmente diagnosticados y las neoplasias malignas más comunes, las últimas estadísticas indican que en 2020 surgieron 2,3 millones de casos de cáncer de mama en todo el mundo, lo que representa el 11,7% de todos los casos de cáncer¹. Los síntomas comunes del cáncer de mama incluyen sensibilidad y hormigueo en los senos, bultos y dolor en los senos, secreción del pezón, erosión o piel hundida y agrandamiento de los ganglios linfáticos axilares ^1,2. Y lo que es aún más alarmante, el número de nuevos casos y la incidencia general del cáncer de mama siguen aum....

Protocolo

Las células MCF-7 utilizadas para el presente estudio se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Cultivo celular

1. Cultivar las células MCF-7 en una atmósfera humidificada con 5% de CO₂ a 37 °C con DMEM que contenga un 10% de FBS y un 1% de penicilina (10.000 U/mL)/estreptomicina (10.000 μg/mL) (ver la Tabla de Materiales).
   NOTA: Las células que cubren el 90% del fondo de la placa se emplearon para el experimento y se asignaron a los siguientes grupos: grupo control, grupo clorhidrato de doxorrubicina (DXR, 5 μM) y grupos Sal (20 μM, 40 μM y 80....

Discusión

El cáncer de mama afecta a personas de todas las edades y causa una carga física y mental incalculable y una gran presión económica¹. El cáncer de mama, con su creciente morbilidad y mortalidad cada año, también ha atraído la atención mundial en cuanto a la búsqueda de terapias compuestas eficaces a base de hierbas más allá de los tratamientos convencionales ^4,5. De manera prometedora, una gran cantidad de evidencia ha revelado.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin/streptomycin	HyClone	SV30010
AKT antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YT0185
Annexin V-FITC/PI kit	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	AP101
Automatic microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax iD5
Bax antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#5023
BCA kit	Biosharp Life Sciences	BL521A
Bcl-2 antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#15071
Bim antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#2933
Ca2+–ATPase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A070-4-2
Cell counting kit-8	Biosharp Life Sciences	BS350B
Cell cycle staining kit	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	CCS012
cleaved caspase-3	Cell Signaling Technology, Inc.	#9661
cleaved caspase-7	Cell Signaling Technology, Inc.	#8438
cleaved caspase-9	Cell Signaling Technology, Inc.	#20750
Crystal violet solution	Beyotime Biotechnology	C0121
DMEM high glucose culture medium	Servicebio Technology Co., Ltd.	G4510
Doxorubicin hydrochloride	MedChemExpress	HY-15142
ECL chemiluminescent solution	Biosharp Life Sciences	BL520B
Fetal bovine serum	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	164210
Flow cytometer	BD	FACSCanto
Fluo-4 AM	Beyotime Biotechnology	S1060
FoxO1 antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	70-GAR0072
GraphPad Prism software	La Jolla	Version 6.0
HIF-1α antibody	Affinity Biosciences	BF8002
Human breast cancer cell line MCF-7	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	CL-0149
Loading buffer	Biosharp Life Sciences	BL502B
LY294002	MedChemExpress	HY-10108
Matrigel	Thermo	356234
mTOR antibody	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11405
Na+–K+–ATPase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A070-2-2
Optical microscope	Olympus	IX71PH
p-AKT antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YP0006
PI3K antibody	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11525
p-PI3K antibody	Affinity Biosciences	AF3241
Quantitative western blot imaging system	Touch Image Pro	eBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit	Servicebio Technology Co., Ltd.	G3330-100
ROS assay kit	Beyotime Biotechnology	S0033S	DCFH-DA fluorescence probe is included here
Salidroside	Chengdu Herbpurify Co., Ltd.	H-040
SDS-PAGE kit	Servicebio Technology Co., Ltd.	G2003-50T
Total RNA isolation kit	Foregene	RE-03014
Trypsin	HyClone	SH30042.01
β-actin	Affinity Biosciences	AF7018