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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El presente protocolo describe una estrategia integral para evaluar la acción farmacológica y el mecanismo del salidrósido en la inhibición de la proliferación y migración de células MCF-7.

Resumen

El salidrósido (Sal) contiene actividades farmacológicas anticancerígenas, antihipóxicas y antiinflamatorias. Sin embargo, sus mecanismos subyacentes contra el cáncer de mama solo se han dilucidado de manera incompleta. Por lo tanto, este protocolo pretendía decodificar el potencial de Sal en la regulación de la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 en la proliferación maligna de células MCF-7 de cáncer de mama humano. En primer lugar, se evaluó la actividad farmacológica de la Sal frente a MCF-7 mediante ensayos de CCK-8 y scratch celular. Además, la resistencia de las células MCF-7 se midió mediante ensayos de migración e invasión de Matrigel. Para los ensayos de apoptosis y ciclo celular, las células MCF-7 se procesaron en pasos con anexina V-FITC/PI y kits de detección de tinción de ciclo celular para análisis de citometría de flujo, respectivamente. Los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) y Ca2+ se examinaron mediante tinción de inmunofluorescencia DCFH-DA y Fluo-4 AM. Las actividades de Na+-K+-ATPasa y Ca2+-ATPasa se determinaron utilizando los kits comerciales correspondientes. Los niveles de expresión de proteínas y genes en la apoptosis y la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 se determinaron mediante análisis de Western blot y qRT-PCR, respectivamente. Encontramos que el tratamiento con Sal restringió significativamente la proliferación, migración e invasión de las células MCF-7 con efectos dependientes de la dosis. Mientras tanto, la administración de Sal también obligó drásticamente a las células MCF-7 a sufrir apoptosis y detención del ciclo celular. Las pruebas de inmunofluorescencia mostraron que Sal estimuló de forma observable la producción de ROS y Ca2+ en las células MCF-7. Otros datos confirmaron que Sal promovió los niveles de expresión de las proteínas proapoptóticas, Bax, Bim, caspasa-9/7/3 escindida y sus genes correspondientes. Consistentemente, la intervención de Sal redujo de manera prominente la expresión de las proteínas Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α y FoxO1 y sus genes correspondientes. En conclusión, la sal se puede utilizar como un compuesto potencial derivado de hierbas para tratar el cáncer de mama, ya que puede reducir la proliferación, migración e invasión maligna de las células MCF-7 al inhibir la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

Introducción

Como uno de los cánceres más comúnmente diagnosticados y las neoplasias malignas más comunes, las últimas estadísticas indican que en 2020 surgieron 2,3 millones de casos de cáncer de mama en todo el mundo, lo que representa el 11,7% de todos los casos de cáncer1. Los síntomas comunes del cáncer de mama incluyen sensibilidad y hormigueo en los senos, bultos y dolor en los senos, secreción del pezón, erosión o piel hundida y agrandamiento de los ganglios linfáticos axilares 1,2. Y lo que es aún más alarmante, el número de nuevos casos y la incidencia general del cáncer de mama siguen aumentando a un ritmo abrumador cada año, y representan el 6,9% de las muertes relacionadas con el cáncer1. En la actualidad, la intervención del cáncer de mama sigue siendo principalmente quimioterapia, cirugía, radioterapia y tratamiento integral. A pesar de que el tratamiento puede reducir eficazmente la tasa de recurrencia y la tasa de mortalidad de los pacientes, la aplicación del tratamiento a largo plazo a menudo causa la aparición de multirresistencia, pérdida de cabello en grandes áreas, náuseas y vómitos, y una grave carga mental y psicológica 2,3. En particular, el riesgo potencial de metástasis de múltiples órganos por cáncer de mama también obliga a las personas a buscar nuevas fuentes herbales de terapia farmacológica 4,5.

La señalización mediada por la fosfoinositida 3 quinasa (PI3K) está implicada en el crecimiento, la proliferación y la supervivencia del cáncer de mama a través del empalme que afecta a la expresión de múltiples genes6. Como proteína de detección de señales aguas abajo de PI3K, numerosas evidencias sugieren que la proteína quinasa B (AKT) podría acoplarse con la proteína diana de rapamicina en mamíferos (mTOR) para aumentar aún más el cáncer de mama 7,8,9. Además, también se ha afirmado que la desactivación de la señalización de PI3K/AKT/mTOR es un componente clave en los fármacos que inhiben la proliferación maligna y estimulan la apoptosis en el cáncer de mama10,11,12. Es bien sabido que la hipoxia extrema en el microambiente tumoral obliga a un aumento masivo del factor 1 alfa inducible por hipoxia (HIF-1α), lo que empeora aún más la progresión del cáncer de mama13,14,15. Paralelamente, la estimulación de AKT también conduce a una acumulación excesiva de HIF-1α, limitando la apoptosis en muestras de cáncer de mama16,17. Curiosamente, se ha confirmado que la activación de la señalización PI3K-AKT-HIF-1α está involucrada en la progresión patológica y la metástasis en una variedad de cánceres, incluidos el cáncer de pulmón18, el cáncer colorrectal19, el cáncer de ovario20 y el cáncer de próstata21. Además de ser orquestada por HIF-1α, la sobreexpresión del factor de transcripción de cabeza bifurcada 1 (FoxO1) también es desencadenada por la estimulación de la señalización AKT, que promueve la detención del ciclo y la inhibición de la apoptosis en las células de cáncer de mama22,23. En conjunto, la evidencia sólida anterior sugiere que la inhibición de la cascada de señalización PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 puede ser una nueva diana potencial para el tratamiento farmacológico en el cáncer de mama.

Se ha demostrado ampliamente que el salidrósido (Sal) ejerce actividades anticancerígenas 24,25, antihipoxia26,27,28,29 y potenciadoras del sistema inmunológico30. Es un polvo de color marrón claro o marrón que es fácilmente soluble en agua, es un tipo de glucósido feniletanoide y tiene una fórmula de estructura química de C14H 20 O7 y un peso molecular de300.331,32. Las investigaciones farmacológicas modernas han demostrado que la Sal puede promover la apoptosis de las células cancerosas gástricas al restringir la señalización PI3K-AKT-mTOR24. Otras evidencias también sugieren que la supresión de la señalización de PI3K-AKT-HIF-1α por el tratamiento con Sal puede contribuir a la apoptosis de las células cancerosas al mejorar su sensibilidad a los agentes quimioterapéuticos25. La evidencia también sugiere que la Sal restringe la migración e invasión celular y causa la detención del ciclo al promover la apoptosis en las células MCF-7 del cáncer de mama humano33,34. Sin embargo, queda por ver si Sal puede regular la señalización de PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 e inhibir la proliferación maligna de las células MCF-7. Por lo tanto, este protocolo tuvo como objetivo explorar los efectos de Sal en la migración, invasión, ciclo celular y apoptosis de las células MCF-7 a través de la vía PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. Las estrategias de investigación integradas que comprenden experimentos convencionales, de bajo costo e independientes, como las evaluaciones de migración e invasión celular, la apoptosis y la detección del ciclo celular por citometría de flujo, la determinación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y fluorescencia de Ca2+, etc., pueden proporcionar una referencia para el diseño general de experimentos para la investigación anticancerígena con la medicina herbal tradicional. El proceso experimental de este estudio se muestra en la Figura 1.

Protocolo

Las células MCF-7 utilizadas para el presente estudio se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Cultivo celular

  1. Cultivar las células MCF-7 en una atmósfera humidificada con 5% de CO2 a 37 °C con DMEM que contenga un 10% de FBS y un 1% de penicilina (10.000 U/mL)/estreptomicina (10.000 μg/mL) (ver la Tabla de Materiales).
    NOTA: Las células que cubren el 90% del fondo de la placa se emplearon para el experimento y se asignaron a los siguientes grupos: grupo control, grupo clorhidrato de doxorrubicina (DXR, 5 μM) y grupos Sal (20 μM, 40 μM y 80 μM), o grupo control, grupo LY294002 (10 μM, un inhibidor de PI3K), grupo Sal (80 μM) y grupo LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (ver la Tabla de Materiales).

2. Ensayo de viabilidad celular

NOTA: Para más detalles sobre este procedimiento, véase un informe anterior27.

  1. Siembre células MCF-7 con una densidad de 8 x 104 células/pocillo en placas de 96 pocillos e incube con Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM y 320 μM) durante 24 h o Sal (20, 40, 80 μM) durante 12 h/24 h/36 h/48 h durante la noche hasta que las células estén adheridas.
  2. Después del tratamiento, co-incubar las células MCF-7 con 10 μL/pocillo de solución de CCK-8 (ver la Tabla de Materiales) durante 2 h. A continuación, mida la densidad óptica a 450 nm (OD450) con un lector automático de microplacas.

3. Migración e invasión celular

NOTA: Para más detalles sobre este procedimiento, véase un informe anterior35.

  1. Incubar 2 ml de 5 x 10 6 células/ml de células sembradas en placas de6 pocillos para cubrir el 90% del fondo de la placa.
  2. Realice una herida de raspado lineal a lo largo del centro de la monocapa celular con una punta de pipeta estéril. Adquisición de imágenes con un microscopio óptico a las 0 h, 24 h y 48 h.
  3. Utilice el software Image J para medir el ancho de las heridas por arañazo.
  4. Para el ensayo transwell, suspenda las células MCF-7 sin medio sérico y siembre en la cámara transwell superior previamente recubierta con o sin Matrigel (consulte la Tabla de materiales).
  5. En el fondo de la cámara de transpozo, utilice el medio completo DMEM como inductor químico. Después de 24 h, retire las células de la cámara superior y fije las células invasoras y migratorias restantes en metanol35.
  6. Tiñir las células MCF-7 con una solución de violeta cristalina (consulte la Tabla de materiales). Capture las imágenes con un microscopio óptico.

4. Evaluación de la actividad de Na+-K+-ATPasa y Ca 2+-Mg2+-ATPasa

  1. Utilice un kit de ácido bicinconínico (BCA) para medir la concentración de proteínas en las células MCF-7 lisadas, siguiendo las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
    1. Agregue muestras de las células lisadas en sus grupos correspondientes en las placas de 96 pocillos. Después de eso, agregue la solución de trabajo para incubar a 37 °C durante 5 minutos. Por último, mida los valores de OD636 con un lector de microplacas multifuncional.

5. Análisis por citometría de flujo de la apoptosis y el ciclo celular

NOTA: Para más detalles sobre este procedimiento, sírvase consultar un informe anterior31.

  1. Digiera las células y recoja para resuspenderlas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante una tinción de 20 minutos con anexina V-FITC y yoduro de propidio (PI) (consulte la Tabla de materiales), y luego determine el número de células apoptóticas utilizando un citómetro de flujo.
  2. Mezcle la solución de muestra resuspendida con la solución PI durante una incubación de 30 minutos, seguida de la detección con un citómetro de flujo.

6. Tinción de fluorescencia DCFH-DA y Fluo-4 AM

NOTA: Para más detalles sobre este procedimiento, véase un informe anterior29.

  1. Incubar las células MCF-7 durante 20 min con una sonda de fluorescencia DCFH-DA de 10 μM (ver la Tabla de Materiales) a 37 °C. Después de eliminar completamente el excedente de DCFH-DA lavando tres veces con PBS, pruebe la intensidad de fluorescencia en longitudes de onda de excitación y emisión de 488 nm y 525 nm, respectivamente, utilizando un microscopio de fluorescencia.
  2. Incubar las células MCF-7 con una solución de sonda fluorescente Fluo-4 AM de 5 μM (véase la Tabla de materiales) durante 45 min a 37 °C. Después de lavar con PBS tres veces, determine los valores de intensidad de fluorescencia en longitudes de onda de excitación y emisión de 488 nm y 516 nm, respectivamente, utilizando un microscopio de fluorescencia.

7. Western blot

  1. Añadir 2 mL de suspensiones celulares de 5 x 10 6 células/mL que contengan diferentes fármacos en placas de6 pocillos y cultivar en una incubadora de CO2 al 5% a 37 °C durante 24 h.
    NOTA: Los grupos para el análisis de Western blot se establecieron de la siguiente manera: grupo control, grupo LY294002 (10 μM), grupo Sal (80 μM) y grupo LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (ver la Tabla de Materiales).
  2. Recoger las células y el sobrenadante, y centrifugar a 560 × g a 4 °C durante 3 min. Deseche el sobrenadante y lávelo dos veces con PBS preenfriado. Después de cada lavado, centrifugar las células a 560 × g a 4 °C durante 3 min.
  3. Añadir 50 μL de tampón de lisis a la muestra celular del paso 7.2 para un baño de hielo de 15 minutos. Centrifugar a 8550 × g a 4 °C durante 10 min para recoger la muestra de proteína sobrenadante.
  4. Después de detectar la concentración de proteína mediante un método BCA, mezcle la muestra de proteína en el paso 7.3 con tampón de carga en una proporción de 4:1, desnaturalice a 100 °C durante 10 min en un baño de metal y enfríe a temperatura ambiente.
  5. Añadir 20 μg de la muestra de proteína del paso 7.4, separar las proteínas con diferentes pesos moleculares35utilizando SDS-PAGE al 10% (ver la Tabla de Materiales), y luego transferir a membranas de PVDF de 0,22 μm. Después del bloqueo con BSA al 5%, incubar las membranas con los anticuerpos primarios correspondientes durante la noche a 4 °C.
    NOTA: La concentración diluida de los siguientes anticuerpos primarios es de 1:1.000: caspasa-9/7/3 escindida (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 y β-actina (véase la tabla de materiales).
  6. Al día siguiente, incubar las membranas con el anticuerpo secundario IgG anticonejo de cabra durante 2 h a 37 °C. Desarrollar las membranas utilizando una solución quimioluminiscente ECL y capturar imágenes utilizando un sistema cuantitativo de imágenes Western blot sin contacto (ver la Tabla de Materiales).

8. qRT-PCR

  1. Realice la centrifugación para recolectar células MCF-7 a 560 x g a 4 °C durante 3 min, y agregue 500 μL de tampón RL1 en 5 × 106 celdas. Soplar y mezclar repetidamente con una pipeta hasta que no se vean masas celulares.
    NOTA: El tampón RL1 es uno de los componentes del kit de aislamiento de ARN total (consulte la Tabla de materiales).
  2. Transfiera los homogeneizados celulares en el paso 8.1 a la columna de limpieza de ADN incrustada en el tubo de recolección y centrifugue a 8.550 × g a 4 °C durante 2 min. Retire la columna de limpieza de ADN y mantenga el sobrenadante en el tubo de recolección.
    NOTA: La columna de limpieza de ADN y el tubo de recolección son dos de los componentes del kit de aislamiento de ARN total (consulte la Tabla de materiales).
  3. Añadir 800 μL de tampón RL2 a 500 μL del sobrenadante del paso 8.2 y mezclar suavemente.
    NOTA: El tampón RL2 es uno de los componentes del kit de aislamiento de ARN total (consulte la Tabla de materiales). Añadir 120 mL de etanol anhidro a 60 mL de tampón RL2 antes de usar.
  4. Transfiera 700 μL de la mezcla del paso 8.3 a la columna de ARN solo incrustada en el tubo de recolección y centrifugue a 8.550 × g a 4 °C durante 1 min. Deseche el líquido residual en el tubo de recolección.
    NOTA: La columna de solo ARN es uno de los componentes del kit de aislamiento de ARN total (consulte la Tabla de materiales).
  5. Repita el paso 8.4 para procesar la mezcla restante del paso 8.3.
  6. Añadir 500 μL de tampón RW1 a la columna de ARN y centrifugar a 8.550 × g a 4 °C durante 1 min. Deseche el líquido residual en el tubo de recolección.
    NOTA: El tampón RW1 es uno de los componentes del kit de aislamiento de ARN total (consulte la Tabla de materiales).
  7. Añadir 700 μL de tampón RW2 a la columna de ARN solamente y centrifugar a 8.550 × g a 4 °C durante 1 min. Deseche el líquido residual en el tubo de recolección. Repita el paso 8.7 una vez.
    NOTA: El tampón RW2 es uno de los componentes del kit de aislamiento de ARN total (consulte la Tabla de materiales).
  8. Vuelva a colocar la columna de ARN solo en el tubo de recolección y centrifugue a 8550 × g a 4 °C durante 2 min para eliminar el tampón RW2 restante.
  9. Transfiera la columna de ARN solo a un nuevo tubo de recolección y gotee 100 μL de ddH2O libre de ARNasa precalentado a 65 °C en el centro de la membrana para la columna de ARN solo. Colocar a 25 °C durante 2 min y recoger la solución de ARN por centrifugación a 8.550 × g a 4 °C durante 1 min.
    NOTA: La ddH2O libre de ARNasa es uno de los componentes del kit de aislamiento de ARN total (consulte la Tabla de materiales).
  10. Agregue 4 μL de tampón de reacción 5x, 1 μL de cebador oligo (dT)18 , 1 μL de cebador hexámero aleatorio, 1 μL de cebador específico de gen (ver Tabla 1), 1 μL de mezcla de enzimas y 5 μg de la solución de ARN del paso 8.9 en una tira de 8 tubos de 100 μL. Complementar el sistema de reacción con agua libre de RNasa a 20 μL.
  11. Establezca las condiciones de reacción del sistema de la siguiente manera: (1): 95 °C, 30 s, 1 ciclo; (2): 95 °C, 5 s, 50 ciclos, 60 °C, 34 s; (3): 95 °C, 5 s, 1 ciclo, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s; y (4): 42 °C, 30 s, 1 ciclo. Ejecute el procedimiento qRT-PCR.
    NOTA: Los niveles relativos de expresión de los genes diana se analizaron cuantitativamente por el método 2−ΔΔCT 36,37. La información del cebador de cada gen utilizado para el análisis de qRT-PCR se muestra en la Tabla 1.

9. Análisis estadístico

  1. Exprese los datos como la media ± la desviación estándar de tres experimentos independientes.
  2. Analice las comparaciones entre múltiples grupos utilizando un software de gráficos y análisis (consulte la Tabla de Materiales) con un análisis de varianza de un factor (ANOVA) seguido de una prueba de Tukey. En este trabajo, P < 0,05 se definió como estadísticamente significativo.

Resultados

Efectos de la sal en la inhibición del exceso de proliferación y el retraso de la cicatrización de heridas en células MCF-7
Para probar el potencial de la Sal contra el cáncer de mama, primero probamos sus propiedades anticancerígenas mediante ensayos de toxicidad de proliferación celular y arañazos de la línea celular MCF-7 de cáncer de mama humano. Estas células se co-incubaron con una serie de concentraciones de Sal (5-320 μM) durante 24 h, y la proliferación celular se evaluó mediant...

Discusión

El cáncer de mama afecta a personas de todas las edades y causa una carga física y mental incalculable y una gran presión económica1. El cáncer de mama, con su creciente morbilidad y mortalidad cada año, también ha atraído la atención mundial en cuanto a la búsqueda de terapias compuestas eficaces a base de hierbas más allá de los tratamientos convencionales 4,5. De manera prometedora, una gran cantidad de evidencia ha revelado...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de la Comisión de Salud de la Provincia de Sichuan (120025).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1% penicillin/streptomycinHyCloneSV30010
AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT0185
Annexin V-FITC/PI kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.AP101
Automatic microplate readerMolecular DevicesSpectraMax iD5
Bax antibodyCell Signaling Technology, Inc.#5023
BCA kitBiosharp Life SciencesBL521A
Bcl-2 antibodyCell Signaling Technology, Inc.#15071
Bim antibodyCell Signaling Technology, Inc.#2933
Ca2+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-4-2
Cell counting kit-8Biosharp Life SciencesBS350B
Cell cycle staining kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.CCS012
cleaved caspase-3Cell Signaling Technology, Inc.#9661
cleaved caspase-7Cell Signaling Technology, Inc.#8438
cleaved caspase-9Cell Signaling Technology, Inc.#20750
Crystal violet solutionBeyotime BiotechnologyC0121
DMEM high glucose culture mediumServicebio Technology Co., Ltd.G4510
Doxorubicin hydrochlorideMedChemExpressHY-15142
ECL chemiluminescent solutionBiosharp Life SciencesBL520B
Fetal bovine serumProcell Life Science & Technology Co., Ltd.164210
Flow cytometerBDFACSCanto figure-materials-1956
Fluo-4 AMBeyotime BiotechnologyS1060
FoxO1 antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibodyMultiSciences Biotech Co., Ltd.70-GAR0072
GraphPad Prism softwareLa JollaVersion 6.0
HIF-1α antibodyAffinity BiosciencesBF8002
Human breast cancer cell line MCF-7Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0149
Loading bufferBiosharp Life SciencesBL502B
LY294002MedChemExpressHY-10108
MatrigelThermo 356234
mTOR antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11405
Na+–K+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-2-2
Optical microscopeOlympusIX71PH
p-AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYP0006
PI3K antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11525
p-PI3K antibodyAffinity BiosciencesAF3241
Quantitative western blot imaging systemTouch Image ProeBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kitServicebio Technology Co., Ltd.G3330-100
ROS assay kitBeyotime BiotechnologyS0033SDCFH-DA fluorescence probe is included here
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., Ltd.H-040
SDS-PAGE kitServicebio Technology Co., Ltd.G2003-50T
Total RNA isolation kitForegeneRE-03014
TrypsinHyCloneSH30042.01
β-actinAffinity BiosciencesAF7018

Referencias

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