Exploration de l’action pharmacologique et du mécanisme moléculaire du salidroside dans l’inhibition de la prolifération et de la migration des cellules MCF-7

Résumé

Le présent protocole décrit une stratégie globale pour évaluer l’action pharmacologique et le mécanisme du salidroside dans l’inhibition de la prolifération et de la migration des cellules MCF-7.

Résumé

Le salidroside (Sal) contient des activités pharmacologiques anti-cancérigènes, anti-hypoxiques et anti-inflammatoires. Cependant, ses mécanismes sous-jacents anti-cancer du sein n’ont été qu’incomplètement élucidés. Par conséquent, ce protocole visait à décoder le potentiel de Sal dans la régulation de la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 dans la prolifération maligne des cellules MCF-7 du cancer du sein humain. Tout d’abord, l’activité pharmacologique de Sal contre MCF-7 a été évaluée par des tests CCK-8 et des tests de grattage cellulaire. De plus, la résistance des cellules MCF-7 a été mesurée par des tests de migration et d’invasion de Matrigel. Pour les tests d’apoptose cellulaire et de cycle, les cellules MCF-7 ont été traitées par étapes avec l’annexine V-FITC/PI et les kits de détection de coloration du cycle cellulaire pour les analyses de cytométrie en flux, respectivement. Les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de Ca²⁺ ont été examinés par coloration par immunofluorescence DCFH-DA et Fluo-4 AM. Les activités de Na⁺-K+-ATPase et de Ca²⁺-ATPase ont été déterminées à l’aide des kits commerciaux correspondants. Les niveaux d’expression des protéines et des gènes dans l’apoptose et la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 ont été déterminés à l’aide d’analyses Western blot et qRT-PCR, respectivement. Nous avons constaté que le traitement par Sal limitait considérablement la prolifération, la migration et l’invasion des cellules MCF-7 avec des effets dose-dépendants. Pendant ce temps, l’administration de Sal a également forcé de manière spectaculaire les cellules MCF-7 à subir l’apoptose et l’arrêt du cycle cellulaire. Les tests d’immunofluorescence ont montré que Sal stimulait de manière observable la production de ROS et de Ca²⁺ dans les cellules MCF-7. D’autres données ont confirmé que Sal a favorisé les niveaux d’expression des protéines pro-apoptotiques, Bax, Bim, caspase-9/7/3 clivée et de leurs gènes correspondants. De manière constante, l’intervention de Sal a considérablement réduit l’expression des protéines Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α et FoxO1 et de leurs gènes correspondants. En conclusion, le Sal peut être utilisé comme composé potentiel dérivé d’herbes pour le traitement du cancer du sein, car il peut réduire la prolifération maligne, la migration et l’invasion des cellules MCF-7 en inhibant la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

Introduction

En tant que l’un des cancers les plus fréquemment diagnostiqués et des tumeurs malignes les plus courantes, les dernières statistiques indiquent que 2,3 millions de cas de cancer du sein sont apparus dans le monde en 2020, ce qui représente 11,7 % de tous les cas de cancer¹. Les symptômes courants du cancer du sein comprennent la sensibilité et les picotements des seins, les bosses et la douleur mammaires, l’écoulement du mamelon, l’érosion ou l’enfoncement de la peau et l’hypertrophie des ganglions lymphatiques axillaires ^1,2. Plus alarmant encore, le nombre de nouveaux cas et l’incide....

Protocole

Les cellules MCF-7 utilisées dans le cadre de la présente étude ont été obtenues à partir d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).

1. Culture cellulaire

1. Cultivez les cellules MCF-7 dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂ à 37 °C avec du DMEM contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline (10 000 U/mL)/streptomycine (10 000 μg/mL) (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Les cellules couvrant 90 % du fond de la boîte ont été utilisées pour l’expérience et réparties dans les groupes suivants : groupe témoin, groupe chlorhydrate de doxorubicine (DXR....

Discussion

Le cancer du sein touche des personnes de tous âges et entraîne un fardeau physique et mental incalculable ainsi qu’une grande pression économique¹. Le cancer du sein, dont la morbidité et la mortalité augmentent chaque année, a également attiré l’attention du monde entier en termes de recherche de thérapies composées efficaces à base de plantes au-delà des traitements conventionnels ^4,5. De manière prometteuse, un grand n.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin/streptomycin	HyClone	SV30010
AKT antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YT0185
Annexin V-FITC/PI kit	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	AP101
Automatic microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax iD5
Bax antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#5023
BCA kit	Biosharp Life Sciences	BL521A
Bcl-2 antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#15071
Bim antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#2933
Ca2+–ATPase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A070-4-2
Cell counting kit-8	Biosharp Life Sciences	BS350B
Cell cycle staining kit	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	CCS012
cleaved caspase-3	Cell Signaling Technology, Inc.	#9661
cleaved caspase-7	Cell Signaling Technology, Inc.	#8438
cleaved caspase-9	Cell Signaling Technology, Inc.	#20750
Crystal violet solution	Beyotime Biotechnology	C0121
DMEM high glucose culture medium	Servicebio Technology Co., Ltd.	G4510
Doxorubicin hydrochloride	MedChemExpress	HY-15142
ECL chemiluminescent solution	Biosharp Life Sciences	BL520B
Fetal bovine serum	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	164210
Flow cytometer	BD	FACSCanto
Fluo-4 AM	Beyotime Biotechnology	S1060
FoxO1 antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	70-GAR0072
GraphPad Prism software	La Jolla	Version 6.0
HIF-1α antibody	Affinity Biosciences	BF8002
Human breast cancer cell line MCF-7	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	CL-0149
Loading buffer	Biosharp Life Sciences	BL502B
LY294002	MedChemExpress	HY-10108
Matrigel	Thermo	356234
mTOR antibody	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11405
Na+–K+–ATPase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A070-2-2
Optical microscope	Olympus	IX71PH
p-AKT antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YP0006
PI3K antibody	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11525
p-PI3K antibody	Affinity Biosciences	AF3241
Quantitative western blot imaging system	Touch Image Pro	eBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit	Servicebio Technology Co., Ltd.	G3330-100
ROS assay kit	Beyotime Biotechnology	S0033S	DCFH-DA fluorescence probe is included here
Salidroside	Chengdu Herbpurify Co., Ltd.	H-040
SDS-PAGE kit	Servicebio Technology Co., Ltd.	G2003-50T
Total RNA isolation kit	Foregene	RE-03014
Trypsin	HyClone	SH30042.01
β-actin	Affinity Biosciences	AF7018