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Résumé

Le présent protocole décrit une stratégie globale pour évaluer l’action pharmacologique et le mécanisme du salidroside dans l’inhibition de la prolifération et de la migration des cellules MCF-7.

Résumé

Le salidroside (Sal) contient des activités pharmacologiques anti-cancérigènes, anti-hypoxiques et anti-inflammatoires. Cependant, ses mécanismes sous-jacents anti-cancer du sein n’ont été qu’incomplètement élucidés. Par conséquent, ce protocole visait à décoder le potentiel de Sal dans la régulation de la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 dans la prolifération maligne des cellules MCF-7 du cancer du sein humain. Tout d’abord, l’activité pharmacologique de Sal contre MCF-7 a été évaluée par des tests CCK-8 et des tests de grattage cellulaire. De plus, la résistance des cellules MCF-7 a été mesurée par des tests de migration et d’invasion de Matrigel. Pour les tests d’apoptose cellulaire et de cycle, les cellules MCF-7 ont été traitées par étapes avec l’annexine V-FITC/PI et les kits de détection de coloration du cycle cellulaire pour les analyses de cytométrie en flux, respectivement. Les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de Ca2+ ont été examinés par coloration par immunofluorescence DCFH-DA et Fluo-4 AM. Les activités de Na+-K+-ATPase et de Ca2+-ATPase ont été déterminées à l’aide des kits commerciaux correspondants. Les niveaux d’expression des protéines et des gènes dans l’apoptose et la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 ont été déterminés à l’aide d’analyses Western blot et qRT-PCR, respectivement. Nous avons constaté que le traitement par Sal limitait considérablement la prolifération, la migration et l’invasion des cellules MCF-7 avec des effets dose-dépendants. Pendant ce temps, l’administration de Sal a également forcé de manière spectaculaire les cellules MCF-7 à subir l’apoptose et l’arrêt du cycle cellulaire. Les tests d’immunofluorescence ont montré que Sal stimulait de manière observable la production de ROS et de Ca2+ dans les cellules MCF-7. D’autres données ont confirmé que Sal a favorisé les niveaux d’expression des protéines pro-apoptotiques, Bax, Bim, caspase-9/7/3 clivée et de leurs gènes correspondants. De manière constante, l’intervention de Sal a considérablement réduit l’expression des protéines Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α et FoxO1 et de leurs gènes correspondants. En conclusion, le Sal peut être utilisé comme composé potentiel dérivé d’herbes pour le traitement du cancer du sein, car il peut réduire la prolifération maligne, la migration et l’invasion des cellules MCF-7 en inhibant la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

Introduction

En tant que l’un des cancers les plus fréquemment diagnostiqués et des tumeurs malignes les plus courantes, les dernières statistiques indiquent que 2,3 millions de cas de cancer du sein sont apparus dans le monde en 2020, ce qui représente 11,7 % de tous les cas de cancer1. Les symptômes courants du cancer du sein comprennent la sensibilité et les picotements des seins, les bosses et la douleur mammaires, l’écoulement du mamelon, l’érosion ou l’enfoncement de la peau et l’hypertrophie des ganglions lymphatiques axillaires 1,2. Plus alarmant encore, le nombre de nouveaux cas et l’incidence globale du cancer du sein continuent d’augmenter à un rythme effréné chaque année, représentant 6,9 % des décès liés au cancer1. À l’heure actuelle, l’intervention contre le cancer du sein implique encore principalement la chimiothérapie, la chirurgie, la radiothérapie et un traitement complet. Bien que le traitement puisse réduire efficacement le taux de récidive et le taux de mortalité des patients, l’application d’un traitement à long terme entraîne souvent une multirésistance aux médicaments, une perte de cheveux sur de grandes surfaces, des nausées et des vomissements, ainsi qu’une charge mentale et psychologique grave 2,3. Notamment, le risque potentiel de métastases d’organes multiples du cancer du sein oblige également les gens à rechercher de nouvelles sources de traitement médicamenteux à base de plantes 4,5.

La signalisation médiée par la phosphoinositide 3 kinase (PI3K) est impliquée dans la croissance, la prolifération et la survie du cancer du sein par épissage qui affecte l’expression de plusieurs gènes6. En tant que protéine de détection de signal en aval de PI3K, de nombreuses preuves suggèrent que la protéine kinase B (AKT) pourrait se coupler avec la protéine cible de la rapamycine (mTOR) chez les mammifères pour augmenter davantage le cancer du sein 7,8,9. De plus, la désactivation de la signalisation PI3K/AKT/mTOR a également été revendiquée comme étant un élément clé dans les médicaments inhibant la prolifération maligne et stimulant l’apoptose dans le cancer du sein10,11,12. Il est bien connu qu’une hypoxie extrême dans le microenvironnement tumoral entraîne une augmentation massive du facteur 1 alpha inductible par l’hypoxie (HIF-1α), ce qui aggrave encore la progression du cancer du sein13,14,15. En parallèle, la stimulation AKT conduit également à une accumulation excessive de HIF-1α, limitant l’apoptose dans les échantillons de cancer du sein16,17. Il est intéressant de noter que l’activation de la signalisation PI3K-AKT-HIF-1α a été confirmée comme étant impliquée dans la progression pathologique et les métastases dans une variété de cancers, y compris le cancer du poumon18, le cancer colorectal19, le cancer de l’ovaire20 et le cancer de la prostate21. En plus d’être orchestrée par HIF-1α, la surexpression du facteur de transcription 1 (FoxO1) est également déclenchée par la stimulation de la signalisation AKT, qui favorise l’arrêt du cycle et l’inhibition de l’apoptose dans les cellules cancéreuses du sein22,23. Ensemble, les preuves solides ci-dessus suggèrent que l’inhibition de la cascade de signalisation PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 pourrait être une nouvelle cible potentielle pour le traitement médicamenteux du cancer du sein.

Il a été largement démontré que le salidroside (Sal) exerce des activités anticancéreuses24,25, anti-hypoxie26,27,28,29 et des activités pharmacologiques immunostimulantes30. Il s’agit d’une poudre brun clair ou brune facilement soluble dans l’eau, est un type de glycoside phényléthanoïde et a une structure chimique de formule C14H 20 O7 et un poids moléculaire de300,331,32. Des études pharmacologiques modernes ont démontré que Sal peut favoriser l’apoptose des cellules cancéreuses gastriques en restreignant la signalisation PI3K-AKT-mTOR24. D’autres preuves suggèrent également que la suppression de la signalisation PI3K-AKT-HIF-1α par le traitement Sal peut contribuer à l’apoptose des cellules cancéreuses en augmentant leur sensibilité aux agents chimiothérapeutiques25. Les preuves suggèrent également que Sal restreint la migration et l’invasion cellulaires et provoque l’arrêt du cycle en favorisant l’apoptose dans les cellules MCF-7 du cancer du sein humain33,34. Cependant, il reste à voir si Sal peut réguler la signalisation PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 et inhiber la prolifération maligne des cellules MCF-7. Par conséquent, ce protocole visait à explorer les effets de Sal sur la migration, l’invasion, le cycle cellulaire et l’apoptose des cellules MCF-7 via la voie PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. Les stratégies de recherche intégrées comprenant des expériences conventionnelles, peu coûteuses et indépendantes, telles que les évaluations de la migration et de l’invasion cellulaires, la détection de l’apoptose et du cycle cellulaire par cytométrie en flux, la détermination des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et de la fluorescence du Ca2+, etc., peuvent fournir une référence pour la conception globale des expériences pour la recherche anticancéreuse avec la phytothérapie traditionnelle. Le processus expérimental de cette étude est illustré à la figure 1.

Protocole

Les cellules MCF-7 utilisées dans le cadre de la présente étude ont été obtenues à partir d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).

1. Culture cellulaire

  1. Cultivez les cellules MCF-7 dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 à 37 °C avec du DMEM contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline (10 000 U/mL)/streptomycine (10 000 μg/mL) (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE : Les cellules couvrant 90 % du fond de la boîte ont été utilisées pour l’expérience et réparties dans les groupes suivants : groupe témoin, groupe chlorhydrate de doxorubicine (DXR, 5 μM) et groupes Sal (20 μM, 40 μM et 80 μM), ou groupe témoin, groupe LY294002 (10 μM, un inhibiteur de PI3K), groupe Sal (80 μM) et groupe LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (voir le tableau des matériaux).

2. Test de viabilité cellulaire

REMARQUE : Pour plus de détails sur cette procédure, veuillez vous référer à un rapport précédent27.

  1. Ensemencer des cellules MCF-7 d’une densité de 8 x 104 cellules/puits dans des plaques de 96 puits, et incuber avec du Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM et 320 μM) pendant 24 h ou du Sal (20, 40, 80 μM) pendant 12 h/24 h/36 h/48 h pendant la nuit jusqu’à ce que les cellules soient adhérentes.
  2. Après le traitement, co-incuber les cellules MCF-7 avec 10 μL/puits de solution CCK-8 (voir le tableau des matériaux) pendant 2 h. Ensuite, mesurez la densité optique à 450 nm (OD450) à l’aide d’un lecteur automatique de microplaques.

3. Migration et invasion cellulaires

REMARQUE : Pour plus de détails sur cette procédure, veuillez vous référer à un rapport précédent35.

  1. Incuber 2 mL de 5 x 10 cellules de 6 cellules/mL ensemencées dans des plaques à 6 puits pour couvrir 90 % du fondde la boîte.
  2. Effectuez une enroulement linéaire par grattage le long du centre de la monocouche cellulaire à l’aide d’une pointe de pipette stérile. Acquérir des images à l’aide d’un microscope optique à 0 h, 24 h et 48 h.
  3. Utilisez le logiciel Image J pour mesurer la largeur des égratignures.
  4. Pour l’essai transwell, suspendre les cellules MCF-7 sans milieu sérique et semer dans la chambre transwell supérieure pré-enrobée avec ou sans Matrigel (voir le tableau des matériaux).
  5. Dans le fond de la chambre de transwell, utilisez le milieu complet DMEM comme inducteur chimique. Après 24 h, retirez les cellules de la chambre supérieure et fixez les cellules invasives et migratrices restantes dans du méthanol35.
  6. Colorer les cellules MCF-7 avec une solution cristalline de violet (voir le tableau des matériaux). Capturez les images à l’aide d’un microscope optique.

4. Évaluation de l’activité de la Na+-K+-ATPase et de laCa 2+-Mg2+-ATPase

  1. Utilisez une trousse d’acide bicinchoninique (BCA) pour mesurer la concentration de protéines dans les cellules MCF-7 lysées, en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
    1. Ajouter des échantillons des cellules lysées dans leurs groupes correspondants dans les plaques à 96 puits. Après cela, ajoutez la solution de travail pour incuber à 37 °C pendant 5 min. Enfin, mesurez les valeurs de OD636 à l’aide d’un lecteur de microplaques multifonctionnel.

5. Analyse par cytométrie en flux de l’apoptose et du cycle cellulaire

REMARQUE : Pour plus de détails sur cette procédure, veuillez vous référer à un rapport précédent31.

  1. Digérer les cellules et les récolter pour les remettre en suspension dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant une coloration de 20 minutes avec de l’annexine V-FITC et de l’iodure de propidium (PI) (voir le tableau des matériaux), puis déterminer le nombre de cellules apoptotiques à l’aide d’un cytomètre en flux.
  2. Mélanger la solution d’échantillon remise en suspension avec la solution d’IP pendant une incubation de 30 minutes, suivie d’une détection à l’aide d’un cytomètre en flux.

6. Coloration par fluorescence DCFH-DA et Fluo-4 AM

REMARQUE : Pour plus de détails sur cette procédure, veuillez vous référer à un rapport précédent29.

  1. Incuber les cellules MCF-7 pendant 20 min à l’aide d’une sonde de fluorescence DCPH-DA de 10 μM (voir le tableau des matériaux) à 37 °C. Après avoir soigneusement éliminé l’excédent de DCFH-DA en lavant trois fois avec du PBS, testez l’intensité de fluorescence aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 488 nm et 525 nm, respectivement, à l’aide d’un microscope à fluorescence.
  2. Incuber les cellules MCF-7 avec une solution de sonde fluorescente Fluo-4 AM de 5 μM (voir le tableau des matériaux) pendant 45 min à 37 °C. Après avoir été lavé trois fois avec du PBS, déterminez les valeurs d’intensité de fluorescence aux longueurs d’onde d’excitation et d’émission de 488 nm et 516 nm, respectivement, à l’aide d’un microscope à fluorescence.

7. Transfert Western

  1. Ajouter 2 mL de suspensions cellulaires 5 x 10 6 cellules/mL contenant différents médicaments dans des plaques à6 puits, et mettre en culture dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 24 h.
    NOTA : Les groupes pour l’analyse par transfert Western ont été établis comme suit : groupe témoin, groupe LY294002 (10 μM), groupe Sal (80 μM) et groupe LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (voir le tableau des matériaux).
  2. Prélever les cellules et le surnageant, et centrifuger à 560 × g à 4 °C pendant 3 min. Jetez le surnageant et lavez-le deux fois avec du PBS pré-refroidi. Après chaque lavage, centrifuger les cellules à 560 × g à 4 °C pendant 3 min.
  3. Ajouter 50 μL de tampon de lyse à l’échantillon de cellule de l’étape 7.2 pour un bain de glace de 15 minutes. Centrifuger à 8550 × g à 4 °C pendant 10 min pour prélever l’échantillon de protéine surnageante.
  4. Après avoir détecté la concentration de protéines à l’aide d’une méthode BCA, mélanger l’échantillon de protéines à l’étape 7.3 avec un tampon de charge dans un rapport de 4 :1, dénaturer à 100 °C pendant 10 minutes dans un bain métallique et refroidir à température ambiante.
  5. Ajouter 20 μg de l’échantillon de protéines de l’étape 7.4, séparer les protéines de différents poids moléculaires35à l’aide de 10 % de SDS-PAGE (voir le tableau des matériaux), puis transférer sur des membranes PVDF de 0,22 μm. Après blocage avec 5 % de BSA, incuber les membranes avec les anticorps primaires correspondants pendant une nuit à 4 °C.
    REMARQUE : La concentration diluée des anticorps primaires suivants est de 1 :1 000 : caspase-9/7/3 clivée (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 et β-actine (voir le tableau des matériaux).
  6. Le lendemain, incuber les membranes avec des anticorps secondaires IgG anti-lapin de chèvre pendant 2 h à 37 °C. Développer les membranes à l’aide d’une solution chimiluminescente ECL et capturer des images à l’aide d’un système d’imagerie par transfert Western quantitatif sans contact (voir le tableau des matériaux).

8. qRT-PCR

  1. Effectuer une centrifugation pour recueillir des cellules MCF-7 à 560 x g à 4 °C pendant 3 min, et ajouter 500 μL de tampon RL1 dans 5 × 106 cellules. Soufflez et mélangez à plusieurs reprises avec une pipette jusqu’à ce qu’aucune masse cellulaire ne soit visible.
    REMARQUE : Le tampon RL1 est l’un des composants de la trousse d’isolement total de l’ARN (voir le tableau des matériaux).
  2. Transférer les homogénats cellulaires de l’étape 8.1 dans la colonne de nettoyage de l’ADN intégrée dans le tube de prélèvement et centrifuger à 8 550 × g à 4 °C pendant 2 min. Retirez la colonne de nettoyage de l’ADN et conservez le surnageant dans le tube de prélèvement.
    REMARQUE : La colonne de nettoyage de l’ADN et le tube de prélèvement sont deux des composants de la trousse d’isolement total de l’ARN (voir le tableau des matériaux).
  3. Ajouter 800 μL de tampon RL2 à 500 μL de surnageant de l’étape 8.2 et mélanger délicatement.
    REMARQUE : Le tampon RL2 est l’un des composants de la trousse d’isolement total de l’ARN (voir le tableau des matériaux). Ajouter 120 mL d’éthanol anhydre à 60 mL de tampon RL2 avant utilisation.
  4. Transvaser 700 μL du mélange de l’étape 8.3 dans la colonne d’ARN uniquement intégrée dans le tube de prélèvement, et centrifuger à 8 550 × g à 4 °C pendant 1 min. Jetez le liquide usagé dans le tube de collecte.
    REMARQUE : La colonne d’ARN uniquement est l’un des composants de la trousse d’isolement total de l’ARN (voir le tableau des matériaux).
  5. Répétez l’étape 8.4 pour traiter le reste du mélange de l’étape 8.3.
  6. Ajouter 500 μL de tampon RW1 dans la colonne d’ARN seul et centrifuger à 8 550 × g à 4 °C pendant 1 min. Jetez le liquide usagé dans le tube de collecte.
    REMARQUE : Le tampon RW1 est l’un des composants de la trousse d’isolement total de l’ARN (voir le tableau des matériaux).
  7. Ajouter 700 μL de tampon RW2 dans la colonne d’ARN seul et centrifuger à 8 550 × g à 4 °C pendant 1 min. Jetez le liquide usagé dans le tube de collecte. Répétez l’étape 8.7 une fois.
    REMARQUE : Le tampon RW2 est l’un des composants de la trousse d’isolement total de l’ARN (voir le tableau des matériaux).
  8. Replacez la colonne d’ARN uniquement dans le tube de prélèvement et centrifugez à 8550 × g à 4 °C pendant 2 min pour éliminer le tampon RW2 restant.
  9. Transférez la colonne d’ARN uniquement dans un nouveau tube de collecte et versez 100 μL de ddH2O sans RNase préchauffé à 65 °C au centre de la membrane pour la colonne d’ARN uniquement. Placer à 25 °C pendant 2 min et recueillir la solution d’ARN par centrifugation à 8 550 × g à 4 °C pendant 1 min.
    REMARQUE : Le ddH2O sans RNase est l’un des composants de la trousse d’isolement total de l’ARN (voir le tableau des matériaux).
  10. Ajouter 4 μL de tampon de réaction 5x, 1 μL d’amorce oligo(dT)18 , 1 μL d’amorce hexamère aléatoire, 1 μL d’amorce spécifique au gène (voir le tableau 1), 1 μL de mélange enzymatique et 5 μg de solution d’ARN de l’étape 8.9 dans une bandelette de 100 μL à 8 tubes. Complétez le système de réaction avec de l’eau exempte de RNase à 20 μL.
  11. Réglez les conditions de réaction du système comme suit : (1) : 95 °C, 30 s, 1 cycle ; (2) : 95 °C, 5 s, 50 cycles, 60 °C, 34 s ; (3) : 95 °C, 5 s, 1 cycle, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s ; et (4) : 42 °C, 30 s, 1 cycle. Exécutez la procédure qRT-PCR.
    NOTE : Les niveaux d’expression relatifs des gènes cibles ont été analysés quantitativement par la méthode 2−ΔΔCT 36,37. Les informations d’amorce de chaque gène utilisé pour l’analyse qRT-PCR sont répertoriées dans le tableau 1.

9. Analyse statistique

  1. Exprimez les données sous la forme de la moyenne ±écart-type de trois expériences indépendantes.
  2. Analysez les comparaisons entre plusieurs groupes à l’aide d’un logiciel de représentation graphique et d’analyse (voir le tableau des matériaux) avec une analyse de variance à un facteur (ANOVA) suivie d’un test de Tukey. Dans ce travail, P < 0,05 a été défini comme statistiquement significatif.

Résultats

Effets du Sal sur l’inhibition de la prolifération excessive et le retard de la cicatrisation des plaies dans les cellules MCF-7
Pour sonder le potentiel de Sal contre le cancer du sein, nous avons d’abord testé ses propriétés anticancéreuses à l’aide de tests de toxicité de prolifération cellulaire et de scratch de la lignée cellulaire MCF-7 du cancer du sein humain. Ces cellules ont été co-incubées avec une série de concentrations de Sal (5-320 μM) pendant 24 h, et la proliférat...

Discussion

Le cancer du sein touche des personnes de tous âges et entraîne un fardeau physique et mental incalculable ainsi qu’une grande pression économique1. Le cancer du sein, dont la morbidité et la mortalité augmentent chaque année, a également attiré l’attention du monde entier en termes de recherche de thérapies composées efficaces à base de plantes au-delà des traitements conventionnels 4,5. De manière prometteuse, un grand n...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Commission de la santé de la province du Sichuan (120025).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
1% penicillin/streptomycinHyCloneSV30010
AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT0185
Annexin V-FITC/PI kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.AP101
Automatic microplate readerMolecular DevicesSpectraMax iD5
Bax antibodyCell Signaling Technology, Inc.#5023
BCA kitBiosharp Life SciencesBL521A
Bcl-2 antibodyCell Signaling Technology, Inc.#15071
Bim antibodyCell Signaling Technology, Inc.#2933
Ca2+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-4-2
Cell counting kit-8Biosharp Life SciencesBS350B
Cell cycle staining kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.CCS012
cleaved caspase-3Cell Signaling Technology, Inc.#9661
cleaved caspase-7Cell Signaling Technology, Inc.#8438
cleaved caspase-9Cell Signaling Technology, Inc.#20750
Crystal violet solutionBeyotime BiotechnologyC0121
DMEM high glucose culture mediumServicebio Technology Co., Ltd.G4510
Doxorubicin hydrochlorideMedChemExpressHY-15142
ECL chemiluminescent solutionBiosharp Life SciencesBL520B
Fetal bovine serumProcell Life Science & Technology Co., Ltd.164210
Flow cytometerBDFACSCanto figure-materials-2474
Fluo-4 AMBeyotime BiotechnologyS1060
FoxO1 antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibodyMultiSciences Biotech Co., Ltd.70-GAR0072
GraphPad Prism softwareLa JollaVersion 6.0
HIF-1α antibodyAffinity BiosciencesBF8002
Human breast cancer cell line MCF-7Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0149
Loading bufferBiosharp Life SciencesBL502B
LY294002MedChemExpressHY-10108
MatrigelThermo 356234
mTOR antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11405
Na+–K+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-2-2
Optical microscopeOlympusIX71PH
p-AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYP0006
PI3K antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11525
p-PI3K antibodyAffinity BiosciencesAF3241
Quantitative western blot imaging systemTouch Image ProeBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kitServicebio Technology Co., Ltd.G3330-100
ROS assay kitBeyotime BiotechnologyS0033SDCFH-DA fluorescence probe is included here
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., Ltd.H-040
SDS-PAGE kitServicebio Technology Co., Ltd.G2003-50T
Total RNA isolation kitForegeneRE-03014
TrypsinHyCloneSH30042.01
β-actinAffinity BiosciencesAF7018

Références

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