JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר אסטרטגיה מקיפה להערכת הפעולה הפרמקולוגית והמנגנון של סלידרוזיד בעיכוב התרבות ונדידת תאי MCF-7.

Abstract

Salidroside (Sal) מכיל פעילויות פרמקולוגיות אנטי מסרטנות, אנטי היפוקסיסיות ואנטי דלקתיות. עם זאת, המנגנונים הבסיסיים שלה נגד סרטן השד הובהרו רק באופן חלקי. לפיכך, פרוטוקול זה נועד לפענח את הפוטנציאל של Sal בוויסות מסלול PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 בהתפשטות הממאירה של תאי MCF-7 של סרטן השד האנושי. ראשית, הפעילות הפרמקולוגית של Sal כנגד MCF-7 הוערכה על ידי CCK-8 ומבחני שריטות תאים. יתר על כן, העמידות של תאי MCF-7 נמדדה על ידי מבחני הגירה ופלישה מטריגל. עבור אפופטוזיס של תאים ומבחני מחזור, תאי MCF-7 עובדו בשלבים עם ANNEXIN V-FITC/PI וערכות זיהוי צביעת מחזור התא לניתוח ציטומטריית זרימה, בהתאמה. רמות מיני החמצן הריאקטיבי (ROS) ו-Ca2+ נבדקו על ידי DCFH-DA וצביעה אימונופלואורסצנטית Fluo-4 AM. הפעילות של Na+-K+-ATPase ו- Ca2+-ATPase נקבעה באמצעות ערכות מסחריות מתאימות. רמות החלבון וביטוי הגנים באפופטוזיס ובמסלול PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 נקבעו עוד יותר באמצעות ניתוחי כתם מערבי ו- qRT-PCR, בהתאמה. מצאנו כי טיפול Sal הגביל באופן משמעותי את ההתפשטות, הנדידה והפלישה של תאי MCF-7 עם השפעות תלויות מינון. בינתיים, ממשל סאל גם אילץ באופן דרמטי תאי MCF-7 לעבור אפופטוזיס ומעצר מחזור תאים. בדיקות האימונופלואורסנציה הראו כי Sal עורר באופן נצפה ייצור ROS ו- Ca2+ בתאי MCF-7. נתונים נוספים אישרו כי סאל קידם את רמות הביטוי של חלבונים פרו-אפופטוטיים, Bax, Bim, cleaved caspase-9/7/3, ואת הגנים המתאימים להם. באופן עקבי, התערבות Sal הפחיתה באופן בולט את הביטוי של חלבוני Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α ו-FoxO1 ואת הגנים המתאימים להם. לסיכום, Sal יכול לשמש כתרכובת פוטנציאלית שמקורה בצמחי מרפא לטיפול בסרטן השד, שכן הוא עשוי להפחית את ההתפשטות, הנדידה והפלישה הממאירה של תאי MCF-7 על ידי עיכוב מסלול PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

Introduction

כאחד מסוגי הסרטן המאובחנים הנפוצים ביותר והממאירויות הנפוצות ביותר, הנתונים הסטטיסטיים האחרונים מצביעים על כך ש -2.3 מיליון מקרים של סרטן השד הופיעו ברחבי העולם עד שנת 2020, המהווים 11.7% מכלל מקרי הסרטן1. תסמינים נפוצים של סרטן השד כוללים רגישות ועקצוץ בשדיים, גושים וכאבים בשדיים, הפרשות פטמות, שחיקה או עור שקוע, ובלוטות לימפה מוגדלותבבית השחי 1,2. מדאיג עוד יותר, מספר המקרים החדשים וההיארעות הכוללת של סרטן השד ממשיכים לעלות בקצב מכריע מדי שנה, ומהווים 6.9% ממקרי המוות הקשורים לסרטן1. כיום, התערבות בסרטן השד עדיין כוללת בעיקר כימותרפיה, ניתוח, הקרנות וטיפול מקיף. למרות שהטיפול יכול להפחית ביעילות את שיעור ההישנות והתמותה של החולים, יישום טיפול ארוך טווח גורם לעיתים קרובות לייצר עמידות לתרופות רבות, נשירת שיער בשטח גדול, בחילות והקאות, ועומס נפשי ופסיכולוגי חמור 2,3. יש לציין כי הסיכון הפוטנציאלי לגרורות איברים מרובות מסרטן השד מאלץ גם אנשים לחפש מקורות צמחיים חדשים לטיפול תרופתי 4,5.

איתות בתיווך Phosphoinositide 3 kinase (PI3K) מעורב בגדילה, שגשוג והישרדות של סרטן השד באמצעות שחבור המשפיע על ביטוי של גנים מרובים6. כחלבון חישת אותות במורד הזרם של PI3K, ראיות רבות מצביעות על כך שחלבון קינאז B (AKT) יכול להזדווג עם המטרה של יונקים של חלבון רפמיצין (mTOR) כדי להגדיל עוד יותר את סרטן השד 7,8,9. יתר על כן, נטרול איתות PI3K/AKT/mTOR נטען גם כמרכיב מרכזי בתרופות המעכבות התפשטות ממאירה וממריצות אפופטוזיס בסרטן השד10,11,12. ידוע היטב כי היפוקסיה קיצונית במיקרו-סביבה של הגידול מאלצת גל מסיבי בגורם 1 אלפא (HIF-1α), אשר מחמיר עוד יותר את התקדמות סרטן השד13,14,15. במקביל, גירוי AKT מוביל גם להצטברות יתר של HIF-1α, המגביל אפופטוזיס בדגימות סרטן השד16,17. באופן מעניין, ההפעלה של איתות PI3K-AKT-HIF-1α אושרה כמעורבת בהתקדמות פתולוגית וגרורות במגוון סוגי סרטן, כולל סרטן ריאות18, סרטן המעי הגס19, סרטן השחלות20 וסרטן הערמונית21. בנוסף להיותו מתוזמר על ידי HIF-1α, ביטוי יתר של גורם שעתוק ראש מפוצל 1 (FoxO1) מופעל גם על ידי גירוי איתות AKT, המקדם מעצר מחזור ועיכוב אפופטוזיס בתאי סרטן השד22,23. יחד, הראיות המוצקות לעיל מצביעות על כך שעיכוב מפל האיתות PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 עשוי להיות מטרה פוטנציאלית חדשה לטיפול תרופתי בסרטן השד.

Salidroside (Sal) הוכח באופן נרחב להפעיל אנטי סרטן 24,25, אנטי היפוקסיה26,27,28,29, ופעילויות פרמקולוגיות לשיפור החיסון30. זוהי אבקה חומה בהירה או חומה כי הוא מסיס בקלות במים, הוא סוג של גליקוזיד phenylethanoid ויש לו נוסחת מבנה כימי של C14H 20 O7 ומשקל מולקולרי של300.331,32. מחקרים פרמקולוגיים מודרניים הוכיחו כי סאל יכול לקדם אפופטוזיס של תאי סרטן קיבה על ידי ריסון PI3K-AKT-mTOR איתות24. ראיות נוספות מצביעות גם על כך שדיכוי איתות PI3K-AKT-HIF-1α על ידי טיפול סאל עשוי לתרום לאפופטוזיס של תאים סרטניים על ידי שיפור רגישותם לחומרים כימותרפיים25. ראיות מצביעות גם על כך שסאל מגביל נדידת תאים ופלישה וגורם למעצר מעגלי על ידי קידום אפופטוזיס בתאי MCF-7 של סרטן השד האנושי33,34. עם זאת, נותר לראות אם Sal יכול לווסת איתות PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 ולעכב את ההתפשטות הממאירה של תאי MCF-7. לכן, פרוטוקול זה נועד לחקור את ההשפעות של Sal על נדידת תאי MCF-7, פלישה, מחזור התא ואפופטוזיס באמצעות מסלול PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. אסטרטגיות המחקר המשולבות הכוללות ניסויים קונבנציונליים, זולים ועצמאיים, כגון נדידת תאים והערכות פלישה, אפופטוזיס וזיהוי מחזור התא על ידי ציטומטריית זרימה, מיני חמצן תגובתי (ROS) וקביעת פלואורסצנטיות Ca2+ וכו ', יכולות לספק התייחסות לתכנון הכולל של ניסויים למחקר אנטי סרטני עם רפואת צמחים מסורתית. התהליך הניסויי של המחקר הזה מוצג באיור 1.

Protocol

תאי MCF-7 ששימשו למחקר הנוכחי התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).

1. תרבית תאים

  1. תרבית את תאי MCF-7 באטמוספירה לחה של 5% CO2 ב-37°C עם DMEM המכיל 10% FBS ו-1% פניצילין (10,000 U/mL)/סטרפטומיצין (10,000 מיקרוגרם/מ"ל) (ראו טבלת חומרים).
    הערה: התאים המכסים 90% מתחתית הצלחת שימשו לניסוי וחולקו לקבוצות הבאות: קבוצת ביקורת, קבוצת דוקסורוביצין הידרוכלוריד (DXR, 5 מיקרומטר) וקבוצות סאל (20 מיקרומטר, 40 מיקרומטר ו-80 מיקרומטר), או קבוצת ביקורת, קבוצת LY294002 (10 מיקרומטר, מעכב PI3K), קבוצת סאל (80 מיקרומטר) וקבוצת LY294002 (10 מיקרומטר) + סאל (80 מיקרומטר) (ראה טבלת חומרים).

2. בדיקת כדאיות התא

הערה: לקבלת פרטים על הליך זה, עיין בדוח קודם27.

  1. זרעו תאי MCF-7 בצפיפות של 8 x 104 תאים/באר בצלחות של 96 בארות, ודגרו עם Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM ו-320 μM) למשך 24 שעות או Sal (20, 40, 80 μM) למשך 12 שעות/24 שעות/36 שעות/48 שעות למשך הלילה עד שהתאים נדבקים.
  2. לאחר הטיפול, יש לדגור במשותף על תאי MCF-7 עם 10 μL/well של תמיסת CCK-8 (ראה טבלת חומרים) למשך שעתיים. לאחר מכן, מדוד את הצפיפות האופטית ב- 450 ננומטר (OD450) באמצעות קורא מיקרו-לוחות אוטומטי.

3. נדידת תאים ופלישה

הערה: לקבלת פרטים על הליך זה, עיין בדוח קודם35.

  1. דגרו 2 מ"ל של 5 x 10 6 תאים/מ"ל תאים שנזרעו בצלחות6 בארות כדי לכסות 90% מתחתית המנה.
  2. בצע פצע שריטה ליניארי לאורך מרכז התא monolayer עם קצה פיפטה סטרילי. קבל תמונות באמצעות מיקרוסקופ אופטי ב- 0 שעות, 24 שעות ו- 48 שעות.
  3. השתמש בתוכנת Image J כדי למדוד את רוחב פצעי השריטה.
  4. לבדיקת הטרנסוול, יש להשהות תאי MCF-7 ללא תווך בסרום, ולזרוע בתא הטרנסוול העליון המצופה מראש במטריג'ל או בלעדיו (ראו טבלת חומרים).
  5. בתחתית תא הטרנסוול, השתמש בתווך המלא DMEM כגורם כימי. לאחר 24 שעות, להסיר את התאים בחדר העליון, ולתקן את התאים הפולשים והמהגרים הנותרים מתנול35.
  6. צבעו את תאי MCF-7 בתמיסה סגולה קריסטלית (ראו טבלת חומרים). צלם את התמונות באמצעות מיקרוסקופ אופטי.

4. הערכת פעילות של Na+-K+-ATPase ו-Ca 2+-Mg2+-ATPase

  1. השתמש בערכת חומצה ביכומונית (BCA) כדי למדוד את ריכוז החלבון בתאי MCF-7 מליזה, בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים).
    1. הוסף דוגמאות של תאי lysed בקבוצות המתאימות שלהם לתוך לוחות 96 באר. לאחר מכן, הוסף את פתרון העבודה כדי לדגור עוד יותר ב 37 ° C במשך 5 דקות. לבסוף, מדוד את הערכים של OD636 באמצעות קורא microplate רב תכליתי.

5. ניתוח ציטומטריה זרימה של אפופטוזיס ומחזור התא

הערה: לקבלת פרטים על הליך זה, עיין בדוח קודם31.

  1. לעכל את התאים, ולקצור כדי להשהות מחדש במי מלח חוצצי פוספט (PBS) במשך 20 דקות צביעה עם annexin V-FITC ו propidium iodide (PI) (ראה את טבלת החומרים), ולאחר מכן לקבוע את מספר התאים אפופטוטיים באמצעות ציטומטר זרימה.
  2. ערבבו את תמיסת הדגימה המושהית עם תמיסת PI למשך דגירה של 30 דקות, ולאחר מכן בצעו זיהוי באמצעות ציטומטר זרימה.

6. צביעת פלואורסצנטיות DCFH-DA ו- Fluo-4 AM

הערה: לקבלת פרטים על הליך זה, עיין בדוח קודם29.

  1. דגרו על תאי MCF-7 למשך 20 דקות עם בדיקה פלואורסצנטית DCFH-DA של 10 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37°C. לאחר הסרה יסודית של עודפי DCFH-DA על ידי שטיפה שלוש פעמים עם PBS, בדוק את עוצמת הפלואורסצנטיות באורכי גל עירור ופליטה של 488 ננומטר ו- 525 ננומטר, בהתאמה, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
  2. יש לדגור על תאי MCF-7 בתמיסת בדיקה פלואורסצנטית Fluo-4 AM בגודל 5 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) למשך 45 דקות בטמפרטורה של 37°C. לאחר שטיפה עם PBS שלוש פעמים, לקבוע את ערכי עוצמת הפלואורסצנטיות באורכי גל עירור ופליטה של 488 ננומטר ו 516 ננומטר, בהתאמה, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

7. כתם מערבי

  1. הוסף 2 מ"ל של 5 x 106 תאים / מ"ל תרחיפים תאים המכילים תרופות שונות לתוך צלחות 6 בארות, ותרבית ב 37 ° C, 5% CO2 אינקובטור במשך 24 שעות.
    הערה: הקבוצות לניתוח הכתם המערבי נקבעו באופן הבא: קבוצת ביקורת, קבוצת LY294002 (10 מיקרומטר), קבוצת סאל (80 מיקרומטר) וקבוצת LY294002 (10 מיקרומטר) + סאל (80 מיקרומטר) (ראה טבלת חומרים).
  2. לאסוף את התאים ואת supernatant, ואת הצנטריפוגה ב 560 × גרם ב 4 ° C במשך 3 דקות. השליכו את הסופרנטנט ושטפו פעמיים עם PBS מקורר מראש. לאחר כל שטיפה, צנטריפוגה את התאים ב 560 × גרם ב 4 ° C במשך 3 דקות.
  3. הוסף חיץ ליזה של 50 μL לדגימת התא משלב 7.2 לאמבט קרח של 15 דקות. צנטריפוגה ב 8550 × גרם ב 4 ° C במשך 10 דקות כדי לאסוף את דגימת חלבון supernatant.
  4. לאחר זיהוי ריכוז החלבון בשיטת BCA, ערבבו את דגימת החלבון בשלב 7.3 עם חיץ העמסה ביחס של 4:1, דה-נטורציה ב-100°C למשך 10 דקות באמבט מתכת, והתקררו לטמפרטורת החדר.
  5. הוסף 20 מיקרוגרם של דגימת החלבון משלב 7.4, הפרד את החלבונים בעלי משקלים מולקולריים שונים35באמצעות 10% SDS-PAGE (ראה טבלת חומרים), ולאחר מכן העבר לקרומי PVDF של 0.22 מיקרומטר. לאחר חסימה עם 5% BSA, לדגור את הממברנות עם הנוגדנים העיקריים המתאימים לילה ב 4 ° C.
    הערה: הריכוז המדולל של הנוגדנים העיקריים הבאים הוא 1:1,000: קספאז-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 ו-β-actin (ראה טבלת חומרים).
  6. למחרת, לדגור את הממברנות עם נוגדן משני IgG נגד ארנב עיזים במשך 2 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לפתח את הממברנות באמצעות תמיסה כימילומינסנטית ECL, וללכוד תמונות באמצעות מערכת הדמיה כמותית מערבית ללא מגע (ראה טבלת חומרים).

8. qRT-PCR

  1. בצע צנטריפוגה כדי לאסוף תאי MCF-7 ב 560 x גרם ב 4 ° C במשך 3 דקות, ולהוסיף 500 μL חיץ RL1 לתוך 5 × 106 תאים. לנשוף ולערבב שוב ושוב עם פיפטה עד שלא נראים מסות תאים.
    הערה: Buffer RL1 הוא אחד המרכיבים בערכת בידוד הרנ"א הכוללת (ראה טבלת חומרים).
  2. העבירו את ההומוגנטים של התא בשלב 8.1 לעמודת ניקוי הדנ"א המוטמעת בצינור האיסוף, ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 8,550 × גרם ב-4°C למשך 2 דקות. הסר את עמודת ניקוי הדנ"א, ושמור את הסופרנאטנט בצינור האיסוף.
    הערה: עמודת ניקוי הדנ"א וצינור האיסוף הם שניים מהרכיבים בערכת בידוד הרנ"א הכוללת (ראה טבלת חומרים).
  3. הוסיפו 800 μL buffer RL2 ל-500 μL של הסופרנאטנט משלב 8.2, וערבבו בעדינות.
    הערה: Buffer RL2 הוא אחד המרכיבים בערכת בידוד הרנ"א הכוללת (ראה טבלת חומרים). הוסף 120 מ"ל אתנול נטול מים ל 60 מ"ל של חיץ RL2 לפני השימוש.
  4. העבירו 700 μL של התערובת משלב 8.3 לעמודת RNA בלבד המוטמעת בצינור האיסוף, וצנטריפוגה בטמפרטורה של 8,550 × גרם ב-4°C למשך דקה אחת. יש להשליך את נוזל הפסולת לצינור האיסוף.
    הערה: עמודת RNA בלבד היא אחד המרכיבים בערכת בידוד הרנ"א הכוללת (ראה טבלת חומרים).
  5. חזור על שלב 8.4 כדי לעבד את התערובת הנותרת משלב 8.3.
  6. הוסף 500 μL של חיץ RW1 לעמודת RNA בלבד, וצנטריפוגה ב 8,550 × גרם ב 4 ° C למשך דקה אחת. יש להשליך את נוזל הפסולת לצינור האיסוף.
    הערה: Buffer RW1 הוא אחד המרכיבים בערכת בידוד הרנ"א הכוללת (ראה טבלת חומרים).
  7. הוסף 700 μL של חיץ RW2 לעמודת RNA בלבד, וצנטריפוגה ב 8,550 × גרם ב 4 ◦C למשך דקה אחת. יש להשליך את נוזל הפסולת לצינור האיסוף. חזור על שלב 8.7 פעם אחת.
    הערה: Buffer RW2 הוא אחד המרכיבים בערכת בידוד הרנ"א הכוללת (ראה טבלת חומרים).
  8. החזירו את עמודת הרנ"א בלבד לצינור האיסוף, וצנטריפוגה בטמפרטורה של 8550 × גרם ב-4°C למשך 2 דקות כדי להסיר את ה-RW2 החיץ שנותר.
  9. מעבירים את עמודת הרנ"א בלבד לצינור איסוף חדש, ומטפטפים 100 μL של ddH2O נטול RNase שחומם מראש ב-65°C למרכז הממברנה עבור עמודת הרנ"א בלבד. מניחים ב 25 ° C למשך 2 דקות, ולאסוף את תמיסת RNA על ידי צנטריפוגה ב 8,550 × גרם ב 4 ° C במשך 1 דקות.
    הערה: ddH2O ללא RNase הוא אחד המרכיבים בערכת בידוד RNA הכוללת (ראה טבלת חומרים).
  10. הוסף 4 μL של 5x reaction buffer, 1 μL של oligo (dT)18 primer, 1 μL של פריימר hexamer אקראי, 1 μL של פריימר ספציפי לגן (ראה טבלה 1), 1 μL של תערובת אנזימים, ו 5 מיקרוגרם של תמיסת RNA משלב 8.9 לתוך 100 μL 8-tube רצועה. השלם את מערכת התגובה עם מים נטולי RNase ל 20 μL.
  11. הגדר את תנאי התגובה של המערכת כדלקמן: (1): 95 °C, 30 s, מחזור אחד; (2): 95 °C, 5 שניות, 50 מחזורים, 60 °C, 34 שניות; (3): 95 °C, 5 שניות, מחזור אחד, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 שניות; ו-(4): 42°C, 30 שניות, מחזור אחד. בצע את הליך qRT-PCR.
    הערה: רמות הביטוי היחסיות של גני המטרה נותחו כמותית בשיטת 2-ΔΔCT 36,37. המידע הראשוני של כל גן המשמש לניתוח qRT-PCR מופיע בטבלה 1.

9. ניתוח סטטיסטי

  1. בטא את הנתונים כממוצע ± סטיית התקן של שלושה ניסויים בלתי תלויים.
  2. נתח את ההשוואות בין קבוצות מרובות באמצעות תוכנת גרפים וניתוח (ראה טבלת חומרים) עם ניתוח חד-כיווני של שונות (ANOVA) ואחריו מבחן Tukey's. בעבודה זו, P < 0.05 הוגדר כמובהק סטטיסטית.

תוצאות

השפעות Sal על עיכוב התרבות עודפת ועיכוב ריפוי פצעים בתאי MCF-7
כדי לחקור את הפוטנציאל של Sal נגד סרטן השד, בדקנו תחילה את התכונות האנטי-סרטניות שלו באמצעות רעילות להתרבות תאים ומבחני שריטות של קו התאים MCF-7 של סרטן השד האנושי. תאים אלה הודגרו יחד עם סדרת ריכוזים של Sal (5-320 מיקרומטר) במשך 2...

Discussion

סרטן השד משפיע על אנשים בכל הגילאים וגורם לעומס פיזי ונפשי בל יתואר ולחץ כלכלי גדול1. סרטן השד, עם התחלואה והתמותה ההולכות וגדלות שלו מדי שנה, משך תשומת לב עולמית גם במונחים של חיפוש טיפולים מורכבים מבוססי צמחי מרפא יעילים מעבר לטיפולים קונבנציונליים 4,5

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי ועדת הבריאות של מחוז סצ'ואן (120025).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1% penicillin/streptomycinHyCloneSV30010
AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT0185
Annexin V-FITC/PI kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.AP101
Automatic microplate readerMolecular DevicesSpectraMax iD5
Bax antibodyCell Signaling Technology, Inc.#5023
BCA kitBiosharp Life SciencesBL521A
Bcl-2 antibodyCell Signaling Technology, Inc.#15071
Bim antibodyCell Signaling Technology, Inc.#2933
Ca2+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-4-2
Cell counting kit-8Biosharp Life SciencesBS350B
Cell cycle staining kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.CCS012
cleaved caspase-3Cell Signaling Technology, Inc.#9661
cleaved caspase-7Cell Signaling Technology, Inc.#8438
cleaved caspase-9Cell Signaling Technology, Inc.#20750
Crystal violet solutionBeyotime BiotechnologyC0121
DMEM high glucose culture mediumServicebio Technology Co., Ltd.G4510
Doxorubicin hydrochlorideMedChemExpressHY-15142
ECL chemiluminescent solutionBiosharp Life SciencesBL520B
Fetal bovine serumProcell Life Science & Technology Co., Ltd.164210
Flow cytometerBDFACSCanto figure-materials-1956
Fluo-4 AMBeyotime BiotechnologyS1060
FoxO1 antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibodyMultiSciences Biotech Co., Ltd.70-GAR0072
GraphPad Prism softwareLa JollaVersion 6.0
HIF-1α antibodyAffinity BiosciencesBF8002
Human breast cancer cell line MCF-7Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0149
Loading bufferBiosharp Life SciencesBL502B
LY294002MedChemExpressHY-10108
MatrigelThermo 356234
mTOR antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11405
Na+–K+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-2-2
Optical microscopeOlympusIX71PH
p-AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYP0006
PI3K antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11525
p-PI3K antibodyAffinity BiosciencesAF3241
Quantitative western blot imaging systemTouch Image ProeBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kitServicebio Technology Co., Ltd.G3330-100
ROS assay kitBeyotime BiotechnologyS0033SDCFH-DA fluorescence probe is included here
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., Ltd.H-040
SDS-PAGE kitServicebio Technology Co., Ltd.G2003-50T
Total RNA isolation kitForegeneRE-03014
TrypsinHyCloneSH30042.01
β-actinAffinity BiosciencesAF7018

References

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Franzoi, M. A., et al. Evidence-based approaches for the management of side-effects of adjuvant endocrine therapy in patients with breast cancer. Lancet Oncology. 22 (7), e303-313 (2021).
  3. Prionas, N. D., Stephens, S. J., Blitzblau, R. C. Early-stage breast cancer: Tailored external beam fractionation approaches for treatment of the whole or partial breast. Seminars in Radiation Oncology. 32 (3), 245-253 (2022).
  4. Wei, W. C., et al. Diterpenoid vinigrol specifically activates ATF4/DDIT3-mediated PERK arm of unfolded protein response to drive non-apoptotic death of breast cancer cells. Pharmacological Research. 182, 106285 (2022).
  5. Zhu, Y., et al. Apoptosis induction, a sharp edge of berberine to exert anti-cancer effects, focus on breast, lung, and liver cancer. Frontiers in Pharmacology. 13, 803717 (2022).
  6. Ladewig, E., et al. The oncogenic PI3K-induced transcriptomic landscape reveals key functions in splicing and gene expression regulation. Cancer Research. 82 (12), 2269-2280 (2022).
  7. Lu, Z. N., Song, J., Sun, T. H., Sun, G. UBE2C affects breast cancer proliferation through the AKT/mTOR signaling pathway. Chinese Medical Journal. 134 (20), 2465-2474 (2021).
  8. Weng, H. C., et al. The combination of a novel GLUT1 inhibitor and cisplatin synergistically inhibits breast cancer cell growth by enhancing the DNA damaging effect and modulating the Akt/mTOR and MAPK signaling pathways. Frontiers in Pharmacology. 13, 879748 (2022).
  9. Silveira Rabelo, A. C., et al. Calotropis procera induced caspase dependent apoptosis and impaired Akt/mTOR signaling in 4T1 breast cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 22 (18), 3136-3147 (2022).
  10. Tohkayomatee, R., Reabroi, S., Tungmunnithum, D., Parichatikanond, W., Pinthong, D. Andrographolide exhibits anticancer activity against breast cancer cells (MCF-7 and MDA-MB-231 cells) through suppressing cell proliferation and inducing cell apoptosis via inactivation of ER-α receptor and PI3K/AKT/mTOR signaling. Molecules. 27 (11), 3544 (2022).
  11. Jin, X. Y., et al. TPI1 activates the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway to induce breast cancer progression by stabilizing CDCA5. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 191 (2022).
  12. Li, Z. W., et al. Atractylodin induces oxidative stress-mediated apoptosis and autophagy in human breast cancer MCF-7 cells through inhibition of the P13K/Akt/mTOR pathway. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 36 (8), 23081 (2022).
  13. Chen, F., et al. Extracellular vesicle-packaged HIF-1α-stabilizing lncRNA from tumour-associated macrophages regulates aerobic glycolysis of breast cancer cells. Nature Cell Biology. 21 (4), 498-510 (2019).
  14. You, D., et al. Mitochondrial malic enzyme 2 promotes breast cancer metastasis via stabilizing HIF-1α under hypoxia. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (3), 308-322 (2021).
  15. La Camera, G., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles promote breast cancer cell malignancy through HIF-1α activity. Cancer Letters. 521, 155-168 (2021).
  16. Jeong, Y. J., et al. Ascofuranone suppresses EGF-induced HIF-1α protein synthesis by inhibition of the Akt/mTOR/p70S6K pathway in MDA-MB-231 breast cancer cells. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 542-550 (2013).
  17. Zhang, T., et al. Targeting the ROS/PI3K/AKT/HIF-1α/HK2 axis of breast cancer cells: Combined administration of polydatin and 2-deoxy-d-glucose. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 23 (5), 3711-3723 (2019).
  18. Han, N. N., et al. HIF-1α induced NID1 expression promotes pulmonary metastases via the PI3K-AKT pathway in salivary gland adenoid cystic carcinoma. Oral Oncology. 131, 105940 (2022).
  19. Sun, L. T., Zhang, L. Y., Shan, F. Y., Shen, M. H., Ruan, S. M. Jiedu Sangen decoction inhibits chemoresistance to 5-fluorouracil of colorectal cancer cells by suppressing glycolysis via PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway. Chinese Journal of Natural Medicines. 19 (2), 143-152 (2021).
  20. Gao, T., et al. SIK2 promotes reprogramming of glucose metabolism through PI3K/AKT/HIF-1α pathway and Drp1-mediated mitochondrial fission in ovarian cancer. Cancer Letters. 469, 89-101 (2020).
  21. Zhu, W. H., et al. Dihydroartemisinin suppresses glycolysis of LNCaP cells by inhibiting PI3K/AKT pathway and downregulating HIF-1α expression. Life Sciences. 233, 116730 (2019).
  22. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R. Differential behaviors of trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells treated with menadione reveal the involvement of Notch1/Akt/FOXO1 signaling elements. Molecular and Cellular Biochemistry. 408 (1-2), 89-102 (2015).
  23. Sajadimajd, S., Yazdanparast, R., Akram, S. Involvement of Numb-mediated HIF-1α inhibition in anti-proliferative effect of PNA-antimiR-182 in trastuzumab-sensitive and -resistant SKBR3 cells. Tumor Biology. 37 (4), 5413-5426 (2016).
  24. Rong, L., et al. Salidroside induces apoptosis and protective autophagy in human gastric cancer AGS cells through the PI3K/Akt/mTOR pathway. Biomedicine & Pharmacotherapy. 122, 109726 (2020).
  25. Zeng, Q., et al. Salidroside promotes sensitization to doxorubicin in human cancer cells by affecting the PI3K/Akt/HIF signal pathway and inhibiting the expression of tumor-resistance-related proteins. Journal of Natural Products. 85 (1), 196-204 (2022).
  26. Wang, X. B., et al. Rhodiola crenulata attenuates apoptosis and mitochondrial energy metabolism disorder in rats with hypobaric hypoxia-induced brain injury by regulating the HIF-1α/microRNA210/ISCU1/2 (COX10) signaling pathway. Journal of Ethnopharmacology. 241, 111801 (2019).
  27. Tang, Y., et al. Salidroside attenuates CoCl2-simulated hypoxia injury in PC12 cells partly by mitochondrial protection. European Journal of Pharmacology. 912, 174617 (2021).
  28. Jiang, S. N., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. European Journal of Pharmacology. 925, 175015 (2022).
  29. Wang, X. B., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115278 (2022).
  30. Vasileva, L. V., et al. Antidepressant-like effect of salidroside and curcumin on the immunoreactivity of rats subjected to a chronic mild stress model. Food and Chemical Toxicology. 121, 604-611 (2018).
  31. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  32. Fan, F. F., et al. Salidroside as a potential neuroprotective agent for ischemic stroke: A review of sources, pharmacokinetics, mechanism and safety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 129, 110458 (2020).
  33. Hu, X. L., Zhang, X. Q., Qiu, S. F., Yu, D. H., Lin, S. X. Salidroside induces cell-cycle arrest and apoptosis in human breast cancer cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 398 (1), 62-67 (2010).
  34. Zhao, G., Shi, A. P., Fan, Z. M., Du, Y. Salidroside inhibits the growth of human breast cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 33 (5), 2553-2560 (2015).
  35. Bai, J. R., et al. The enhanced mitochondrial dysfunction by cantleyoside confines inflammatory response and promotes apoptosis of human HFLS-RA cell line via AMPK/Sirt 1/NF-κB pathway activation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 149, 112847 (2022).
  36. Hou, Y., et al. Longzhibu disease and its therapeutic effects by traditional Tibetan medicine: Ershi-wei Chenxiang pills. Journal of Ethnopharmacology. 249, 112426 (2020).
  37. Yang, L., et al. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. Journal of Ethnopharmacology. 288, 114988 (2022).
  38. Cui, L. J., et al. Salidroside promotes apoptosis of human HCT116 colon cancer cells by regulating Wnt/β-catenin signaling pathway. Pharmacological Research - Modern Chinese Medicine. 3, 100088 (2022).
  39. Wu, S. L., et al. Genome-wide 5-Hydroxymethylcytosine profiling analysis identifies MAP7D1 as a novel regulator of lymph node metastasis in breast cancer. Genomics Proteomics & Bioinformatics. 19 (1), 64-79 (2021).
  40. Du, J. W., et al. Targeted NIRF/MR dual-mode imaging of breast cancer brain metastasis using BRBP1-functionalized ultra-small iron oxide nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 116, 111188 (2020).
  41. Wang, S. F., et al. Mitochondrial stress adaptation promotes resistance to aromatase inhibitor in human breast cancer cells via ROS/calcium up-regulated amphiregulin-estrogen receptor loop signaling. Cancer Letters. 523, 82-99 (2021).
  42. Zuo, Y., et al. Activation of mitochondrial-associated apoptosis signaling pathway and inhibition of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by voacamine suppress breast cancer progression. Phytomedicine. 99, 154015 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

MCF 7MCF 7PI3K AKT HIF 1 FoxO1CCK 8ROSCa2Na K ATPaseCa2 ATPaseQRT PCR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved