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Neste Artigo

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Resumo

O presente protocolo descreve uma estratégia abrangente para avaliar a ação farmacológica e o mecanismo do salidrosídeo na inibição da proliferação e migração de células MCF-7.

Resumo

Salidrosídeo (Sal) contém atividades farmacológicas anticarcinogênicas, anti-hipóxicas e anti-inflamatórias. No entanto, seus mecanismos subjacentes contra o câncer de mama foram apenas incompletamente elucidados. Assim, este protocolo pretendeu decodificar o potencial do Sal na regulação da via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 na proliferação maligna de células MCF-7 de câncer de mama humano. Primeiramente, a atividade farmacológica do Sal contra MCF-7 foi avaliada por CCK-8 e ensaios de arranhão celular. Além disso, a resistência das células MCF-7 foi medida por ensaios de migração e invasão de Matrigel. Para ensaios de apoptose celular e ciclo, as células MCF-7 foram processadas em etapas com anexina V-FITC/PI e kits de detecção de ciclo celular para análises por citometria de fluxo, respectivamente. Os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) e Ca2+ foram examinados pelas colorações de imunofluorescência DCFH-DA e Fluo-4 AM. As atividades da Na+-K+-ATPase e da Ca2+-ATPase foram determinadas utilizando os kits comerciais correspondentes. Os níveis de expressão gênica e proteica na apoptose e na via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 foram posteriormente determinados usando análises de western blot e qRT-PCR, respectivamente. Descobrimos que o tratamento com Sal restringiu significativamente a proliferação, migração e invasão de células MCF-7 com efeitos dose-dependentes. Enquanto isso, a administração do Sal também forçou dramaticamente as células MCF-7 a sofrer apoptose e parada do ciclo celular. Os testes de imunofluorescência mostraram que o Sal estimulou observavelmente a produção de ROS e Ca2+ em células MCF-7. Dados adicionais confirmaram que Sal promoveu os níveis de expressão de proteínas pró-apoptóticas, Bax, Bim, caspase-9/7/3 clivada e seus genes correspondentes. Consistentemente, a intervenção com Sal reduziu proeminentemente a expressão das proteínas Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α e FoxO1 e seus genes correspondentes. Em conclusão, o Sal pode ser usado como um potencial composto derivado de ervas para o tratamento do câncer de mama, pois pode reduzir a proliferação, migração e invasão malignas de células MCF-7 inibindo a via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1.

Introdução

Como um dos cânceres mais comumente diagnosticados e malignidades mais comuns, as estatísticas mais recentes indicam que 2,3 milhões de casos de câncer de mama surgiram em todo o mundo até 2020, representando 11,7% de todos os casos de câncer1. Os sintomas comuns do câncer de mama incluem sensibilidade mamária e formigamento, nódulos e dor mamária, secreção mamilar, erosão ou pele afundada e linfonodos axilares aumentados 1,2. Ainda mais alarmante, o número de novos casos e a incidência geral de câncer de mama continuam a aumentar a uma taxa avassaladora a cada ano, sendo responsáveis por 6,9% das mortes relacionadas ao câncer1. Atualmente, a intervenção contra o câncer de mama ainda envolve principalmente quimioterapia, cirurgia, radioterapia e tratamento abrangente. Embora o tratamento possa efetivamente reduzir a taxa de recorrência e a taxa de mortalidade dos pacientes, a aplicação do tratamento em longo prazo frequentemente produz resistência a múltiplas drogas, queda de cabelo em grandes áreas, náuseas e vômitos e grave sobrecarga mental e psicológica 2,3. Notavelmente, o risco potencial de metástases de múltiplos órgãos do câncer de mama também força as pessoas a procurar novas fontes fitoterápicas de terapia medicamentosa 4,5.

A sinalização mediada pela fosfoinositida 3 quinase (PI3K) está implicada no crescimento, proliferação e sobrevida do câncer de mama por meio de splicing que afeta a expressão de múltiplos genes6. Como uma proteína sensível ao sinal a jusante da PI3K, numerosas evidências sugerem que a proteína quinase B (AKT) poderia acoplar-se ao alvo mamífero da proteína rapamicina (mTOR) para aumentar ainda mais o câncer de mama 7,8,9. Além disso, a desativação da sinalização PI3K/AKT/mTOR também tem sido reivindicada como um componente-chave em drogas que inibem a proliferação maligna e estimulam a apoptose no câncer de mama10,11,12. Sabe-se que a hipóxia extrema no microambiente tumoral força um aumento maciço do fator 1 alfa induzível por hipóxia (HIF-1α), o que piora ainda mais a progressão do câncer de mama13,14,15. Paralelamente, a estimulação com AKT também leva ao acúmulo excessivo de HIF-1α, limitando a apoptose em amostras de câncer de mama16,17. Curiosamente, a ativação da sinalização PI3K-AKT-HIF-1α foi confirmada como envolvida na progressão patológica e metástase em uma variedade de cânceres, incluindo câncer de pulmão18, câncer colorretal19, câncer de ovário20 e câncer de próstata21. Além de ser orquestrada pelo HIF-1α, a superexpressão do fator de transcrição cabeça bifurcada 1 (FoxO1) também é desencadeada pela estimulação da sinalização AKT, que promove a parada do ciclo e a inibição da apoptose em células do câncer de mama22,23. Juntas, as evidências sólidas acima sugerem que a inibição da cascata da sinalização PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 pode ser um novo alvo potencial para a terapia medicamentosa no câncer de mama.

O salidrosídeo (Sal) tem demonstrado amplamente exercer atividades farmacológicas antineoplásicas 24,25, anti-hipóxia26,27,28,29 e imunoestimulantes 30. É um pó marrom claro ou marrom que é facilmente solúvel em água, é um tipo de glicosídeo feniletanóide, e tem uma fórmula de estrutura química de C14H 20 O7 e um peso molecular de300,331,32. Investigações farmacológicas modernas têm demonstrado que o Sal pode promover a apoptose de células do câncer gástrico restringindo a sinalização PI3K-AKT-mTOR24. Outras evidências também sugerem que a supressão da sinalização PI3K-AKT-HIF-1α pelo tratamento com Sal pode contribuir para a apoptose de células cancerosas, aumentando sua sensibilidade a agentes quimioterápicos25. Evidências também sugerem que o Sal restringe a migração e invasão celular e causa a parada do ciclo por promover apoptose nas células MCF-7 do câncer de mama humano33,34. No entanto, resta saber se o Sal pode regular a sinalização PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 e inibir a proliferação maligna de células MCF-7. Portanto, este protocolo teve como objetivo explorar os efeitos do Sal na migração, invasão, ciclo celular e apoptose de células MCF-7 via via PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1. As estratégias de pesquisa integradas que incluem experimentos convencionais, de baixo custo e independentes, como avaliações de migração e invasão celular, apoptose e detecção do ciclo celular por citometria de fluxo, determinação de espécies reativas de oxigênio (ROS) e fluorescência de Ca2+, etc., podem fornecer uma referência para o planejamento geral de experimentos para pesquisa anticâncer com a medicina fitoterápica tradicional. O processo experimental deste estudo é mostrado na Figura 1.

Protocolo

As células MCF-7 utilizadas no presente estudo foram obtidas de fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Cultura celular

  1. Cultivar as células MCF-7 em atmosfera umidificada de 5% de CO2 a 37 °C com DMEM contendo FBS a 10% e penicilina a 1% (10.000 U/mL)/estreptomicina (10.000 μg/mL) (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: As células que cobrem 90% do fundo da placa foram empregadas para o experimento e divididas nos seguintes grupos: grupo controle, grupo cloridrato de doxorrubicina (DXR, 5 μM) e grupo Sal (20 μM, 40 μM e 80 μM), ou grupo controle, grupo LY294002 (10 μM, um inibidor da PI3K), grupo Sal (80 μM) e grupo LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (ver Tabela de Materiais).

2. Ensaio de viabilidade celular

NOTA: Para obter detalhes sobre este procedimento, consulte um relatório anterior27.

  1. Semear células MCF-7 com densidade de 8 x 104 células/poço em placas de 96 poços e incubar com Sal (10 μM, 20 μM, 40 μM, 80 μM, 160 μM e 320 μM) por 24 h ou Sal (20, 40, 80 μM) por 12 h/24 h/36 h/48 h durante a noite até que as células estejam aderentes.
  2. Após o tratamento, co-incubar as células MCF-7 com 10 μL/poço de solução de CCK-8 (ver Tabela de Materiais) por 2 h. Em seguida, meça a densidade óptica a 450 nm (OD450) com um leitor automático de microplacas.

3. Migração e invasão celular

NOTA: Para obter detalhes sobre este procedimento, consulte um relatório anterior35.

  1. Incubar 2 mL de células de 5 x 10 6 células/mL semeadas em placas de6 poços para cobrir 90% do fundo da placa.
  2. Execute uma ferida de arranhão linear ao longo do centro da monocamada celular com uma ponta de pipeta estéril. Adquirir imagens em microscópio óptico às 0 h, 24 h e 48 h.
  3. Use o software Image J para medir a largura das feridas de arranhões.
  4. Para o ensaio de transwell, suspender as células MCF-7 sem meio de soro e semear na câmara de transwell superior pré-revestida com ou sem Matrigel (ver Tabela de Materiais).
  5. No fundo da câmara de transwell, use meio completo DMEM como indutor químico. Após 24 h, remover as células da câmara superior e fixar as células invasoras e migrantes remanescentes em metanol35.
  6. Manchar as células MCF-7 com solução de cristal violeta (ver Tabela de Materiais). Capture as imagens usando um microscópio óptico.

4. Avaliação da atividade da Na+-K+-ATPase e Ca 2+-Mg2+-ATPase

  1. Use um kit de ácido bicinconínico (BCA) para medir a concentração de proteína em células MCF-7 lisadas, seguindo as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
    1. Adicione amostras das células lisadas em seus grupos correspondentes nas placas de 96 poços. Depois disso, adicione a solução de trabalho para incubar ainda mais a 37 °C durante 5 min. Finalmente, meça os valores de OD636 com um leitor de microplacas multifuncional.

5. Análise por citometria de fluxo da apoptose e do ciclo celular

NOTA: Para obter detalhes sobre este procedimento, consulte um relatório anterior31.

  1. Digerir as células e colher para ressuspender em solução salina tamponada com fosfato (PBS) por uma coloração de 20 minutos com anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI) (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, determinar o número de células apoptóticas usando um citômetro de fluxo.
  2. Misturar a solução da amostra ressuspensa com a solução de PI durante uma incubação de 30 minutos, seguida da detecção com um citómetro de fluxo.

6. Coloração por fluorescência DCFH-DA e Fluo-4 AM

NOTA: Para obter detalhes sobre este procedimento, consulte um relatório anterior29.

  1. Incubar as células MCF-7 durante 20 minutos com uma sonda de fluorescência de 10 μM DCFH-DA (ver Tabela de Materiais) a 37 °C. Depois de remover completamente o excesso de DCFH-DA lavando três vezes com PBS, teste a intensidade da fluorescência nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 488 nm e 525 nm, respectivamente, usando um microscópio de fluorescência.
  2. Incubar as células MCF-7 com uma solução de sonda fluorescente Fluo-4 AM de 5 μM (ver Tabela de Materiais) durante 45 minutos a 37 °C. Após a lavagem com PBS três vezes, determinar os valores de intensidade de fluorescência nos comprimentos de onda de excitação e emissão de 488 nm e 516 nm, respectivamente, usando um microscópio de fluorescência.

7. Mancha ocidental

  1. Adicionar 2 mL de suspensões de células 5 x 106 células/mL contendo diferentes fármacos em placas de 6 poços e cultura em estufa a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h.
    NOTA: Os grupos para a análise de western blot foram definidos da seguinte forma: grupo controle, grupo LY294002 (10 μM), grupo Sal (80 μM) e grupo LY294002 (10 μM) + Sal (80 μM) (ver Tabela de Materiais).
  2. Recolher as células e o sobrenadante e centrifugar a 560 × g a 4 °C durante 3 min. Descarte o sobrenadante e lave duas vezes com PBS pré-resfriado. Após cada lavagem, centrifugar as células a 560 × g a 4 °C durante 3 min.
  3. Adicionar 50 μL de tampão de lise à amostra celular do passo 7.2 para um banho de gelo de 15 minutos. Centrifugar a 8550 × g a 4 °C durante 10 min para recolher a amostra de proteína sobrenadante.
  4. Depois de detectar a concentração de proteínas usando um método BCA, misturar a amostra de proteína na etapa 7.3 com tampão de carga na proporção de 4:1, desnaturar a 100 °C por 10 min em banho de metal e resfriar até a temperatura ambiente.
  5. Adicionar 20 μg da amostra de proteínas do passo 7.4, separar as proteínas com diferentes pesos moleculares35usando 10% SDS-PAGE (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, transferir para membranas de PVDF de 0,22 μm. Após o bloqueio com BSA a 5%, incubar as membranas com os anticorpos primários correspondentes durante a noite a 4 °C.
    NOTA: A concentração diluída dos seguintes anticorpos primários é de 1:1.000: caspase-9/7/3 clivada (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 e β-actina (ver Tabela de Materiais).
  6. No dia seguinte, incubar as membranas com anticorpo secundário IgG de cabra anti-coelho por 2 h a 37 °C. Desenvolva as membranas usando uma solução quimioluminescente ECL e capture imagens usando um sistema de imagem western blot quantitativo sem contato (consulte a Tabela de Materiais).

8. qRT-PCR

  1. Realizar centrifugação para coletar células MCF-7 a 560 x g a 4 °C por 3 min e adicionar 500 μL de tampão RL1 em 5 × 106 células. Sopre e misture repetidamente com uma pipeta até que nenhuma massa celular seja visível.
    NOTA: O tampão RL1 é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Transferir os homogeneizados celulares na etapa 8.1 para a coluna de limpeza de DNA embutida no tubo de coleta e centrifugar a 8.550 × g a 4 °C por 2 min. Remova a coluna de limpeza de DNA e mantenha o sobrenadante no tubo de coleta.
    NOTA: A coluna de limpeza de ADN e o tubo de recolha são dois dos componentes do kit de isolamento de ARN total (ver Tabela de Materiais).
  3. Adicionar 800 μL de tampão RL2 a 500 μL do sobrenadante do passo 8.2 e misturar delicadamente.
    NOTA: O tampão RL2 é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais). Adicionar 120 mL de etanol anidro a 60 mL de tampão RL2 antes de usar.
  4. Transferir 700 μL da mistura do passo 8.3 para a coluna somente de RNA embutida no tubo de coleta e centrifugar a 8.550 × g a 4 °C por 1 min. Descarte os resíduos líquidos no tubo de coleta.
    NOTA: A coluna somente de RNA é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais).
  5. Repetir o passo 8.4 para processar a mistura restante do passo 8.3.
  6. Adicionar 500 μL de tampão RW1 à coluna somente de RNA e centrifugar a 8.550 × g a 4 °C por 1 min. Descarte os resíduos líquidos no tubo de coleta.
    NOTA: O buffer RW1 é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais).
  7. Adicionar 700 μL de tampão RW2 à coluna somente de RNA e centrifugar a 8.550 × g a 4 ◦C por 1 min. Descarte os resíduos líquidos no tubo de coleta. Repita a etapa 8.7 uma vez.
    NOTA: O tampão RW2 é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais).
  8. Coloque a coluna somente de RNA de volta no tubo de coleta e centrifugar a 8550 × g a 4 °C por 2 min para remover o tampão RW2 restante.
  9. Transfira a coluna somente de RNA para um novo tubo de coleta e goteje 100 μL de ddH2O livre de RNase pré-aquecido a 65 °C no centro da membrana para a coluna somente de RNA. Colocar a 25 °C durante 2 min e recolher a solução de ARN por centrifugação a 8.550 × g a 4 °C durante 1 min.
    NOTA: DDH2O livre de RNase é um dos componentes do kit de isolamento de RNA total (consulte a Tabela de Materiais).
  10. Adicionar 4 μL de tampão de reacção 5x, 1 μL de primer oligo (dT)18 , 1 μL de primer hexâmero aleatório, 1 μL de primer gene-específico (ver Tabela 1), 1 μL de mistura enzimática e 5 μg da solução de ARN do passo 8.9 numa tira de 8 tubos de 100 μL. Completar o sistema de reação com água livre de RNase a 20 μL.
  11. Definir as condições de reação do sistema da seguinte forma: (1): 95 °C, 30 s, 1 ciclo; (2): 95 °C, 5 s, 50 ciclos, 60 °C, 34 s; (3): 95 °C, 5 s, 1 ciclo, 65 °C, 60 s, 97 °C, 1 s; e (4): 42 °C, 30 s, 1 ciclo. Execute o procedimento qRT-PCR.
    NOTA: Os níveis de expressão relativa dos genes-alvo foram analisados quantitativamente pelo método 2−ΔΔCT 36,37. As informações dos primers de cada gene utilizado para a análise do qRT-PCR estão listadas na Tabela 1.

9. Análise estatística

  1. Expresse os dados como média ± desvio padrão de três experimentos independentes.
  2. Analise as comparações entre múltiplos grupos usando gráficos e softwares de análise (veja a Tabela de Materiais) com uma análise de variância (ANOVA) unidirecional seguida de um teste de Tukey. Neste trabalho, P < 0,05 foi definido como estatisticamente significante.

Resultados

Efeitos do Sal na inibição do excesso de proliferação e retardo da cicatrização de feridas em células MCF-7
Para sondar o potencial do Sal contra o câncer de mama, primeiro testamos suas propriedades anticancerígenas usando ensaios de toxicidade de proliferação celular e arranhões da linhagem celular MCF-7 do câncer de mama humano. Essas células foram co-incubadas com uma série de concentração de Sal (5-320 μM) por 24 h, e a proliferação celular foi avaliada usando um ensaio CCK-8....

Discussão

O câncer de mama acomete indivíduos de todas as idades e causa incalculável sobrecarga física e mental e grande pressão econômica1. O câncer de mama, com sua crescente morbidade e mortalidade a cada ano, também tem atraído a atenção mundial na busca de terapias compostas fitoterápicas eficazes além dos tratamentos convencionais 4,5. De forma promissora, um grande corpo de evidências tem revelado os efeitos anticancerígenos d...

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Comissão de Saúde da Província de Sichuan (120025).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1% penicillin/streptomycinHyCloneSV30010
AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT0185
Annexin V-FITC/PI kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.AP101
Automatic microplate readerMolecular DevicesSpectraMax iD5
Bax antibodyCell Signaling Technology, Inc.#5023
BCA kitBiosharp Life SciencesBL521A
Bcl-2 antibodyCell Signaling Technology, Inc.#15071
Bim antibodyCell Signaling Technology, Inc.#2933
Ca2+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-4-2
Cell counting kit-8Biosharp Life SciencesBS350B
Cell cycle staining kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.CCS012
cleaved caspase-3Cell Signaling Technology, Inc.#9661
cleaved caspase-7Cell Signaling Technology, Inc.#8438
cleaved caspase-9Cell Signaling Technology, Inc.#20750
Crystal violet solutionBeyotime BiotechnologyC0121
DMEM high glucose culture mediumServicebio Technology Co., Ltd.G4510
Doxorubicin hydrochlorideMedChemExpressHY-15142
ECL chemiluminescent solutionBiosharp Life SciencesBL520B
Fetal bovine serumProcell Life Science & Technology Co., Ltd.164210
Flow cytometerBDFACSCanto figure-materials-1956
Fluo-4 AMBeyotime BiotechnologyS1060
FoxO1 antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibodyMultiSciences Biotech Co., Ltd.70-GAR0072
GraphPad Prism softwareLa JollaVersion 6.0
HIF-1α antibodyAffinity BiosciencesBF8002
Human breast cancer cell line MCF-7Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0149
Loading bufferBiosharp Life SciencesBL502B
LY294002MedChemExpressHY-10108
MatrigelThermo 356234
mTOR antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11405
Na+–K+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-2-2
Optical microscopeOlympusIX71PH
p-AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYP0006
PI3K antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11525
p-PI3K antibodyAffinity BiosciencesAF3241
Quantitative western blot imaging systemTouch Image ProeBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kitServicebio Technology Co., Ltd.G3330-100
ROS assay kitBeyotime BiotechnologyS0033SDCFH-DA fluorescence probe is included here
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., Ltd.H-040
SDS-PAGE kitServicebio Technology Co., Ltd.G2003-50T
Total RNA isolation kitForegeneRE-03014
TrypsinHyCloneSH30042.01
β-actinAffinity BiosciencesAF7018

Referências

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