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摘要

本方案描述了一种综合策略，用于评估红景天苷在抑制MCF-7细胞增殖和迁移中的药理作用和机制。

摘要

红景天苷（Sal）具有抗癌、抗缺氧和抗炎药理活性。然而，其潜在的抗乳腺癌机制尚未完全阐明。因此，该协议旨在解码Sal在调节人乳腺癌MCF-7细胞恶性增殖中PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路的潜力。首先，通过CCK-8和细胞划痕试验评估Sal对MCF-7的药理活性。此外，通过迁移和基质胶侵袭试验测量MCF-7细胞的抗性。对于细胞凋亡和周期测定，分别使用膜联蛋白 V-FITC/PI 和细胞周期染色检测试剂盒分步处理 MCF-7 细胞进行流式细胞术分析。DCFH-DA和Fluo-4 AM免疫荧光染色检测活性氧（ROS）和Ca2+水平。使用相应的商业试剂盒测定Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase的活性。分别采用Western blot和qRT-PCR分析进一步测定细胞凋亡和PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路中的蛋白和基因表达水平。我们发现Sal治疗显着限制了MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭，并具有剂量依赖性效应。同时，Sal 给药还显着迫使 MCF-7 细胞发生凋亡和细胞周期停滞。免疫荧光试验显示，Sal可观察到刺激MCF-7细胞中ROS和Ca2+的产生。进一步数据证实，Sal促进了促凋亡蛋白Bax、Bim、裂解caspase-9/7/3及其相应基因的表达水平。一致地，Sal 干预显着降低了 Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α 和 FoxO1 蛋白及其相应基因的表达。总之，Sal 可作为治疗乳腺癌的潜在草药衍生化合物，因为它可以通过抑制 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 通路来减少 MCF-7 细胞的恶性增殖、迁移和侵袭。

引言

作为最常见的癌症和最常见的恶性肿瘤之一，最新统计数据显示，截至2020年，全球出现了230万例乳腺癌病例，占所有癌症病例的11.7%1。乳腺癌的常见症状包括乳房压痛和刺痛、乳房肿块和疼痛、溢液、皮肤糜烂或凹陷以及腋窝淋巴结肿大 1,2。更令人震惊的是，乳腺癌的新病例数和总体发病率每年继续以惊人的速度增长，占癌症相关死亡人数的6.9%1。目前，乳腺癌干预仍主要涉及化疗、手术、放疗和综合治疗。虽然治疗可以有效降低患者的复发率和死亡率，但长期应用治疗往往会引起产生多重耐药性、大面积脱发、恶心呕吐，以及严重的精神和心理负担2,3。值得注意的是，乳腺癌多器官转移的潜在风险也迫使人们寻求新的草药来源的药物治疗4,5。

磷酸肌醇 3 激酶 （PI3K） 介导的信号转导通过影响多个基因表达的剪接与乳腺癌的生长、增殖和存活有关6.作为 PI3K 的下游信号感应蛋白，大量证据表明蛋白激酶 B （AKT） 可以与哺乳动物雷帕霉素靶标 （mTOR） 蛋白偶联，以进一步增加乳腺癌 7,8,9。此外，PI3K/AKT/mTOR 信号转导的失活也被认为是抑制乳腺癌恶性增殖和刺激细胞凋亡的药物的关键成分10,11,12。众所周知，肿瘤微环境中的极度缺氧迫使缺氧诱导因子 1 α （HIF-1α） 大量激增，这进一步恶化了乳腺癌的进展13,14,15。同时，AKT 刺激也会导致 HIF-1α 的过度积累，从而限制乳腺癌样本中的细胞凋亡16,17。有趣的是，PI3K-AKT-HIF-1α 信号转导的激活已被证实参与多种癌症的病理进展和转移，包括肺癌18、结直肠癌19、卵巢癌20 和前列腺癌21。除了由 HIF-1α 协调外，AKT 信号刺激还触发分叉头转录因子 1 （FoxO1） 过表达，从而促进乳腺癌细胞的周期停滞和细胞凋亡抑制 22,23。综上所述，上述确凿证据表明，抑制PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1信号转导的级联反应可能是乳腺癌药物治疗的潜在新靶点。

红景天苷 （Sal） 已被广泛证明具有抗癌 24,25、抗缺氧26、27、28、29 和增强免疫力的药理活性30。它是一种浅棕色或棕色粉末，易溶于水，是苯乙烷苷的一种，化学式为C14H 20 O7，分子量为300.331,32。现代药理学研究表明，Sal可以通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号传导来促进胃癌细胞的凋亡24。进一步的证据还表明，Sal 治疗对 PI3K-AKT-HIF-1α 信号传导的抑制可能通过增强癌细胞对化疗药物的敏感性来促进癌细胞的凋亡25。证据还表明，Sal 通过促进人乳腺癌 MCF-7 细胞的凋亡来限制细胞迁移和侵袭并导致周期停滞33,34。然而，Sal能否调控PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1信号传导并抑制MCF-7细胞的恶性增殖还有待观察。因此，该方案旨在通过PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1途径探索Sal对MCF-7细胞迁移，侵袭，细胞周期和细胞凋亡的影响。采用常规、低成本、自主实验的综合研究策略，如细胞迁移和侵袭评估、流式细胞术细胞凋亡和细胞周期检测、活性氧（ROS）和Ca2+荧光测定等，可为传统草药抗癌研究的实验整体设计提供参考。本研究的实验过程如图1所示。

研究方案

用于本研究的 MCF-7 细胞是从商业来源获得的（参见 材料表）。

1. 细胞培养

  1. 在37°C的湿润5%CO2 气氛中用含有10%FBS和1%青霉素（10,000U / mL）/链霉素（10,000μg/ mL）的DMEM培养MCF-7细胞（参见 材料表）。
    注：覆盖培养皿底部90%的细胞用于实验，并分为以下组：对照组，盐酸多柔比星组（DXR，5μM）和Sal组（20μM，40μM和80μM），或对照组，LY294002（10μM，PI3K抑制剂）组，Sal（80μM）组和LY294002（10μM）+ Sal（80μM）组（参见 材料表）。

2. 细胞活力测定

注：有关此程序的详细信息，请参阅以前的报告27。

  1. 在 96 孔板中以 8 x 104 个细胞/孔的密度接种 MCF-7 细胞，并与 Sal（10 μM、20 μM、40 μM、80 μM、160 μM 和 320 μM）孵育 24 小时或 Sal（20、40、80 μM）孵育 12 小时/24 小时/36 小时/48 小时过夜，直到细胞贴壁。
  2. 处理后，将MCF-7细胞与10μL/孔的CCK-8溶液（参见 材料表）共同孵育2小时。然后，用自动酶标仪测量450nm（OD450）处的光密度。

3.细胞迁移和侵袭

注：有关此程序的详情，请参阅以前的报告35。

  1. 孵育 2 mL 接种在 6 孔板中的 5 x 106 个细胞/mL 细胞，以覆盖培养皿底部的 90%。
  2. 用无菌移液器吸头沿细胞单层的中心进行线性划痕缠绕。使用光学显微镜在0小时，24小时和48小时采集图像。
  3. 使用 Image J 软件测量划痕的宽度。
  4. 对于transwell测定，悬浮不含血清培养基的MCF-7细胞，并在预涂有或不涂有基质胶的上部transwell室中接种（参见 材料表）。
  5. 在transwell室的底部，使用DMEM完全培养基作为化学诱导剂。24小时后，除去上腔室中的细胞，并将剩余的侵袭性和迁移性细胞固定在甲醇35中。
  6. 用结晶紫溶液染色MCF-7细胞（参见 材料表）。使用光学显微镜捕获图像。

4. Na+-K+-ATPase和Ca 2+-Mg2+-ATPase的活性评价

  1. 按照制造商的说明，使用二辛可宁酸 （BCA） 试剂盒测量裂解的 MCF-7 细胞中的蛋白质浓度（参见 材料表）。
    1. 将相应组的裂解细胞样品添加到96孔板中。之后，加入工作溶液，在37°C下进一步孵育5分钟。最后，用多功能酶标仪测量OD636 的值。

5. 细胞凋亡和细胞周期的流式细胞术分析

注：有关此程序的详细信息，请参阅以前的报告31。

  1. 消化细胞，并收获重悬于磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，用膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶（PI）染色20分钟（参见 材料表），然后使用流式细胞仪确定凋亡细胞的数量。
  2. 将重悬的样品溶液与PI溶液混合孵育30分钟，然后用流式细胞仪检测。

6. DCFH-DA和Fluo-4 AM荧光染色

注：有关此程序的详细信息，请参阅以前的报告29。

  1. 将MCF-7细胞与10μM DCFH-DA荧光探针（参见 材料表）在37°C下孵育20分钟。 用PBS洗涤三次彻底除去多余的DCFH-DA后，使用荧光显微镜分别测试激发波长和发射波长为488nm和525nm的荧光强度。
  2. 将MCF-7细胞与5μM Fluo-4 AM荧光探针溶液（参见 材料表）在37°C下孵育45分钟。 用PBS洗涤三次后，使用荧光显微镜分别测定激发波长和发射波长为488nm和516nm的荧光强度值。

7. 蛋白质印迹

  1. 将含有不同药物的 2 mL 5 x 10 6 个细胞/mL 细胞悬浮液加入6 孔板中，并在 37 °C、5% CO2 培养箱中培养 24 小时。
    注：蛋白质印迹分析组设置如下：对照组，LY294002（10μM）组，Sal（80μM）组和LY294002（10μM）+ Sal（80μM）组（参见 材料表）。
  2. 收集细胞和上清液，并在4°C下以560× g 离心3分钟。弃去上清液，用预冷的PBS洗涤两次。每次洗涤后，将细胞在4°C下以560× g 离心3分钟。
  3. 向步骤7.2中的细胞样品中加入50μL裂解缓冲液，进行15分钟的冰浴。在4°C下以8550× g 离心10分钟以收集上清液蛋白质样品。
  4. 使用BCA方法检测蛋白质浓度后，将步骤7.3中的蛋白质样品与上样缓冲液以4：1的比例混合，在100°C下在金属浴中变性10分钟，并冷却至室温。
  5. 加入来自步骤7.4的20μg蛋白质样品，使用10%SDS-PAGE（参见材料表）分离不同分子量35的蛋白质，然后转移到0.22μmPVDF膜上。用5%BSA封闭后，将膜与相应的一抗在4°C下孵育过夜。
    注：以下一抗的稀释浓度为 1：1,000：裂解的半胱天冬酶-9/7/3 （CC-9/7/3）、Bim、Bax、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α、FoxO1 和 β-肌动蛋白（参见 材料表）。
  6. 第二天，将膜与山羊抗兔IgG二抗在37°C下孵育2小时。 使用ECL化学发光溶液显影膜，并使用非接触式定量蛋白质印迹成像系统捕获图像（参见 材料表）。

8. qRT-PCR检测

  1. 在4°C下以560× g 离心收集MCF-7细胞3分钟，并将500μL缓冲液RL1加入5×106细胞中 。用移液管反复吹气和混合，直到看不到细胞团。
    注：缓冲液RL1是总RNA分离试剂盒中的组分之一（参见 材料表）。
  2. 将步骤8.1中的细胞匀浆转移到嵌入收集管中的DNA清洁柱中，并在4°C下以8,550× g 离心2分钟。取出DNA清洗柱，将上清液保留在收集管中。
    注：DNA 清洗柱和收集管是总 RNA 分离试剂盒中的两个组分（参见 材料表）。
  3. 将 800 μL 缓冲液 RL2 加入步骤 8.2 的 500 μL 上清液中，轻轻混合。
    注：缓冲液 RL2 是总 RNA 分离试剂盒中的组分之一（参见 材料表）。使用前将 120 mL 无水乙醇加入 60 mL 缓冲液 RL2 中。
  4. 将步骤8.3中的700μL混合物转移到嵌入收集管中的仅RNA柱中，并在4°C下以8,550× g 离心1分钟。丢弃收集管中的废液。
    注：仅 RNA 色谱柱是总 RNA 分离试剂盒中的组分之一（参见 材料表）。
  5. 重复步骤 8.4 以处理步骤 8.3 中剩余的混合物。
  6. 向仅RNA色谱柱中加入500μL缓冲液RW1，并在4°C下以8,550× g 离心1分钟。丢弃收集管中的废液。
    注：缓冲液 RW1 是总 RNA 分离试剂盒中的组分之一（参见 材料表）。
  7. 向仅 RNA 色谱柱中加入 700 μL 缓冲液 RW2，并在 4 ◦C 下以 8,550 × g 离心 1 分钟。丢弃收集管中的废液。重复步骤 8.7 一次。
    注：缓冲液 RW2 是总 RNA 分离试剂盒中的组分之一（参见 材料表）。
  8. 将仅RNA色谱柱放回收集管中，并在4°C下以8550 ×g 离心2分钟以除去剩余的缓冲液RW 2。
  9. 将仅RNA色谱柱转移到新的收集管中，并将100μL在65°C下预热的无RNase的ddH2O滴入仅RNA色谱柱的膜中心。置于25°C下2分钟，并通过在4°C下以8,550× g 离心1分钟来收集RNA溶液。
    注：无 RNase 的 ddH2O 是总 RNA 分离试剂盒中的组分之一（参见 材料表）。
  10. 将 4 μL 5x 反应缓冲液、1 μL 寡核苷酸 （dT）18 引物、1 μL 随机六聚体引物、1 μL 基因特异性引物（见表 1）、1 μL 酶混合物和 5 μg 步骤 8.9 的 RNA 溶液加入 100 μL 8 管条中。用不含RNase的水补充反应系统至20μL。
  11. 设置系统的反应条件如下：（1）：95°C，30s，1个循环;（2）：95 °C，5 s，50 次循环，60 °C，34 s;（3）：95 °C、5 s、1 个周期、65 °C、60 s、97 °C、1 s;（4）：42°C，30s，1个循环。执行qRT-PCR程序。
    注：通过2−ΔΔCT方法36,37定量分析靶基因的相对表达水平。用于qRT-PCR分析的每个基因的引物信息列于表1中。

9. 统计分析

  1. 将数据表示为三个独立实验的平均值±标准差。
  2. 使用绘图和分析软件（参见 材料表）分析多个组之间的比较，先进行单因素方差分析 （ANOVA），然后进行 Tukey 检验。在这项工作中， P < 0.05 被定义为具有统计学意义。

结果

Sal 对抑制 MCF-7 细胞过度增殖和延缓伤口愈合的影响
为了探究 Sal 对抗乳腺癌的潜力，我们首先使用细胞增殖毒性和人乳腺癌 MCF-7 细胞系的划痕测定测试了其抗癌特性。将这些细胞与浓度系列的Sal（5-320μM）共同孵育24小时，并使用CCK-8测定法评估细胞增殖。观察到Sal对细胞增殖的剂量依赖性抑制作用，在40μM时细胞活力下降50%（图2A）。然后选择 20 μM、40 μM ?...

讨论

乳腺癌影响所有年龄段的人，并造成不可估量的身心负担和巨大的经济压力1.乳腺癌的发病率和死亡率逐年增加，在寻求传统治疗之外的有效草药复合疗法方面也引起了全世界的关注4,5。有希望的是，大量证据揭示了 Sal24,25,38 的抗癌作用。不幸的是，Sal在乳腺癌中?...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作得到了四川省卫生健康委员会（120025）的支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1% penicillin/streptomycinHyCloneSV30010
AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT0185
Annexin V-FITC/PI kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.AP101
Automatic microplate readerMolecular DevicesSpectraMax iD5
Bax antibodyCell Signaling Technology, Inc.#5023
BCA kitBiosharp Life SciencesBL521A
Bcl-2 antibodyCell Signaling Technology, Inc.#15071
Bim antibodyCell Signaling Technology, Inc.#2933
Ca2+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-4-2
Cell counting kit-8Biosharp Life SciencesBS350B
Cell cycle staining kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.CCS012
cleaved caspase-3Cell Signaling Technology, Inc.#9661
cleaved caspase-7Cell Signaling Technology, Inc.#8438
cleaved caspase-9Cell Signaling Technology, Inc.#20750
Crystal violet solutionBeyotime BiotechnologyC0121
DMEM high glucose culture mediumServicebio Technology Co., Ltd.G4510
Doxorubicin hydrochlorideMedChemExpressHY-15142
ECL chemiluminescent solutionBiosharp Life SciencesBL520B
Fetal bovine serumProcell Life Science & Technology Co., Ltd.164210
Flow cytometerBDFACSCanto figure-materials-1956
Fluo-4 AMBeyotime BiotechnologyS1060
FoxO1 antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibodyMultiSciences Biotech Co., Ltd.70-GAR0072
GraphPad Prism softwareLa JollaVersion 6.0
HIF-1α antibodyAffinity BiosciencesBF8002
Human breast cancer cell line MCF-7Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0149
Loading bufferBiosharp Life SciencesBL502B
LY294002MedChemExpressHY-10108
MatrigelThermo 356234
mTOR antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11405
Na+–K+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-2-2
Optical microscopeOlympusIX71PH
p-AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYP0006
PI3K antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11525
p-PI3K antibodyAffinity BiosciencesAF3241
Quantitative western blot imaging systemTouch Image ProeBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kitServicebio Technology Co., Ltd.G3330-100
ROS assay kitBeyotime BiotechnologyS0033SDCFH-DA fluorescence probe is included here
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., Ltd.H-040
SDS-PAGE kitServicebio Technology Co., Ltd.G2003-50T
Total RNA isolation kitForegeneRE-03014
TrypsinHyCloneSH30042.01
β-actinAffinity BiosciencesAF7018

参考文献

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