探究红景天苷抑制MCF-7细胞增殖和迁移的药理作用及分子机制

摘要

本方案描述了一种综合策略，用于评估红景天苷在抑制MCF-7细胞增殖和迁移中的药理作用和机制。

摘要

红景天苷（Sal）具有抗癌、抗缺氧和抗炎药理活性。然而，其潜在的抗乳腺癌机制尚未完全阐明。因此，该协议旨在解码Sal在调节人乳腺癌MCF-7细胞恶性增殖中PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路的潜力。首先，通过CCK-8和细胞划痕试验评估Sal对MCF-7的药理活性。此外，通过迁移和基质胶侵袭试验测量MCF-7细胞的抗性。对于细胞凋亡和周期测定，分别使用膜联蛋白 V-FITC/PI 和细胞周期染色检测试剂盒分步处理 MCF-7 细胞进行流式细胞术分析。DCFH-DA和Fluo-4 AM免疫荧光染色检测活性氧（ROS）和^Ca2+水平。使用相应的商业试剂盒测定Na+-K⁺-ATPase和Ca²⁺-ATPase的活性。分别采用Western blot和qRT-PCR分析进一步测定细胞凋亡和PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1通路中的蛋白和基因表达水平。我们发现Sal治疗显着限制了MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭，并具有剂量依赖性效应。同时，Sal 给药还显着迫使 MCF-7 细胞发生凋亡和细胞周期停滞。免疫荧光试验显示，Sal可观察到刺激MCF-7细胞中ROS和Ca²⁺的产生。进一步数据证实，Sal促进了促凋亡蛋白Bax、Bim、裂解caspase-9/7/3及其相应基因的表达水平。一致地，Sal 干预显着降低了 Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR、HIF-1α 和 FoxO1 蛋白及其相应基因的表达。总之，Sal 可作为治疗乳腺癌的潜在草药衍生化合物，因为它可以通过抑制 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 通路来减少 MCF-7 细胞的恶性增殖、迁移和侵袭。

引言

作为最常见的癌症和最常见的恶性肿瘤之一，最新统计数据显示，截至2020年，全球出现了230万例乳腺癌病例，占所有癌症病例的11.7%¹。乳腺癌的常见症状包括乳房压痛和刺痛、乳房肿块和疼痛、溢液、皮肤糜烂或凹陷以及腋窝淋巴结肿大 ^1,2。更令人震惊的是，乳腺癌的新病例数和总体发病率每年继续以惊人的速度增长，占癌症相关死亡人数的6.9%¹。目前，乳腺癌干预仍主要涉及化疗、手术、放疗和综合治疗。虽然治疗可以有效降低患者的复发率和死亡率，但长期应用治疗往往会引起产生多重耐药性、大面积脱发、恶心呕吐，以及严重的精神和心理负担^2,3。值得注意的是，乳腺癌多器官转移的潜在风险也迫使人们寻求新的草药来源的药物治疗^4,5。

磷酸肌醇 3 激酶 （PI3K） 介导的信号转导通过影响多个基因表达的剪接与乳腺癌的生长、增殖和存活有关⁶.作为 PI3K 的下游信号感应蛋白，大量证据表明蛋白激酶 B （AKT） 可....

研究方案

用于本研究的 MCF-7 细胞是从商业来源获得的（参见 材料表）。

1. 细胞培养

1. 在37°C的湿润5%CO₂ 气氛中用含有10%FBS和1%青霉素（10,000U / mL）/链霉素（10,000μg/ mL）的DMEM培养MCF-7细胞（参见 材料表）。
   注：覆盖培养皿底部90%的细胞用于实验，并分为以下组：对照组，盐酸多柔比星组（DXR，5μM）和Sal组（20μM，40μM和80μM），或对照组，LY294002（10μM，PI3K抑制剂）组，Sal（80μM）组和LY294002（10μM）+ Sal（80μM）组（参见 材料表）。

2. 细胞活力测定

注：有关此程序的详细信息，请参阅以前的报告²⁷。

1. 在 96 孔板中以 8 x 10⁴ 个细胞/孔的密度接种 MCF-7 细胞，并与 Sal（10 μM、20 μM、40 μM、80 μM、160 μM 和 320 μM）孵育 24 小时或 Sal（20、40、80 μM）孵育 12 小时/24....

讨论

乳腺癌影响所有年龄段的人，并造成不可估量的身心负担和巨大的经济压力¹.乳腺癌的发病率和死亡率逐年增加，在寻求传统治疗之外的有效草药复合疗法方面也引起了全世界的关注^4,5。有希望的是，大量证据揭示了 Sal^24,25,38 的抗癌作用。不幸的是，Sal在乳腺癌中?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% penicillin/streptomycin	HyClone	SV30010
AKT antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YT0185
Annexin V-FITC/PI kit	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	AP101
Automatic microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax iD5
Bax antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#5023
BCA kit	Biosharp Life Sciences	BL521A
Bcl-2 antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#15071
Bim antibody	Cell Signaling Technology, Inc.	#2933
Ca2+–ATPase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A070-4-2
Cell counting kit-8	Biosharp Life Sciences	BS350B
Cell cycle staining kit	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	CCS012
cleaved caspase-3	Cell Signaling Technology, Inc.	#9661
cleaved caspase-7	Cell Signaling Technology, Inc.	#8438
cleaved caspase-9	Cell Signaling Technology, Inc.	#20750
Crystal violet solution	Beyotime Biotechnology	C0121
DMEM high glucose culture medium	Servicebio Technology Co., Ltd.	G4510
Doxorubicin hydrochloride	MedChemExpress	HY-15142
ECL chemiluminescent solution	Biosharp Life Sciences	BL520B
Fetal bovine serum	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	164210
Flow cytometer	BD	FACSCanto
Fluo-4 AM	Beyotime Biotechnology	S1060
FoxO1 antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibody	MultiSciences Biotech Co., Ltd.	70-GAR0072
GraphPad Prism software	La Jolla	Version 6.0
HIF-1α antibody	Affinity Biosciences	BF8002
Human breast cancer cell line MCF-7	Procell Life Science & Technology Co., Ltd.	CL-0149
Loading buffer	Biosharp Life Sciences	BL502B
LY294002	MedChemExpress	HY-10108
Matrigel	Thermo	356234
mTOR antibody	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11405
Na+–K+–ATPase assay kit	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A070-2-2
Optical microscope	Olympus	IX71PH
p-AKT antibody	ImmunoWay Biotechnology Company	YP0006
PI3K antibody	Servicebio Technology Co., Ltd.	GB11525
p-PI3K antibody	Affinity Biosciences	AF3241
Quantitative western blot imaging system	Touch Image Pro	eBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit	Servicebio Technology Co., Ltd.	G3330-100
ROS assay kit	Beyotime Biotechnology	S0033S	DCFH-DA fluorescence probe is included here
Salidroside	Chengdu Herbpurify Co., Ltd.	H-040
SDS-PAGE kit	Servicebio Technology Co., Ltd.	G2003-50T
Total RNA isolation kit	Foregene	RE-03014
Trypsin	HyClone	SH30042.01
β-actin	Affinity Biosciences	AF7018