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요약

본 프로토콜은 MCF-7 세포 증식 및 이동을 억제하는 살리드로사이드의 약리학적 작용 및 기전을 평가하기 위한 포괄적인 전략을 설명합니다.

초록

Salidroside (Sal)는 항 발암성, 항 저산소 및 항 염증 약리 활성을 포함합니다. 그러나, 그것의 근본적인 반대로 유방암 기계장치는 단지 불완전하게 해명되었다. 따라서 이 프로토콜은 인간 유방암 MCF-7 세포의 악성 증식에서 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로를 조절하는 Sal의 잠재력을 해독하기 위한 것입니다. 먼저, MCF-7에 대한 Sal의 약리활성을 CCK-8 및 세포 스크래치 분석으로 평가하였다. 또한, MCF-7 세포의 내성은 이동 및 Matrigel 침습 분석에 의해 측정되었습니다. 세포 사멸 및 주기 분석을 위해 MCF-7 세포는 각각 유세포 분석을 위해 annexin V-FITC/PI 및 세포 주기 염색 검출 키트를 사용하여 단계적으로 처리되었습니다. 활성 산소종(ROS) 및 Ca2+의 수준은 DCFH-DA 및 Fluo-4 AM 면역형광 염색으로 검사되었습니다. Na+-K+-ATPase 및 Ca2+-ATPase의 활성은 해당 상용 키트를 사용하여 측정하였다. 세포사멸 및 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로의 단백질 및 유전자 발현 수준은 각각 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR 분석을 사용하여 추가로 측정되었습니다. Sal 치료는 용량 의존적 효과로 MCF-7 세포의 증식, 이동 및 침입을 유의하게 제한한다는 것을 발견했습니다. 한편, Sal 투여는 MCF-7 세포가 세포사멸(apoptosis)과 세포주기 정지(cell cycle arrest)를 겪도록 극적으로 강제했다. 면역형광 검사는 Sal이 MCF-7 세포에서 ROS 및 Ca2+ 생산을 관찰할 수 있게 자극하는 것으로 나타났습니다. 추가 데이터는 Sal이 pro-apoptotic 단백질, Bax, Bim, 절단된 caspase-9/7/3 및 해당 유전자의 발현 수준을 촉진한다는 것을 확인했습니다. 일관되게 Sal 중재는 Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α 및 FoxO1 단백질과 해당 유전자의 발현을 현저하게 감소시켰습니다. 결론적으로, Sal은 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로를 억제하여 MCF-7 세포의 악성 증식, 이동 및 침입을 줄일 수 있기 때문에 유방암 치료를 위한 잠재적인 허브 유래 화합물로 사용할 수 있습니다.

서문

가장 흔하게 진단되는 암 및 가장 흔한 악성 종양 중 하나인 유방암은 최신 통계에 따르면 2020년까지 전 세계적으로 230만 건의 유방암이 발생하여 전체암 사례의 11.7%를 차지합니다1. 유방암의 일반적인 증상으로는 유방 압통과 따끔거림, 유방 덩어리 및 통증, 유두 분비물, 미란 또는 함몰된 피부, 겨드랑이 림프절 비대증등이 있다 1,2. 더욱 우려스러운 것은 유방암의 신규 발병 건수와 전체 발병률이 매년 압도적인 비율로 계속 증가하여 암 관련 사망의 6.9%를 차지한다는 것입니다1. 현재 유방암 중재는 여전히 주로 화학 요법, 수술, 방사선 요법 및 포괄적 인 치료를 포함합니다. 치료는 환자의 재발률과 사망률을 효과적으로 낮출 수 있지만, 장기간의 치료는 종종 다제내성, 대면적 탈모, 메스꺼움 및 구토, 심각한 정신적, 심리적 부담을 유발한다 2,3. 특히, 유방암으로 인한 다발성 장기 전이의 잠재적 위험으로 인해 사람들은 약물 요법의 새로운 약초 공급원을 찾게 된다 4,5.

Phosphoinositide 3 kinase (PI3K) 매개 신호전달은 여러 유전자의 발현에 영향을 미치는 스플라이싱을 통해 유방암의 성장, 증식 및 생존에 관여한다6. PI3K의 다운스트림 신호 감지 단백질인 단백질 키나아제 B(AKT)가 포유류 표적인 라파마이신(mTOR) 단백질과 결합하여 유방암을 더욱 증가시킬 수 있다는 수많은 증거가 있습니다 7,8,9. 또한, PI3K/AKT/mTOR 신호전달의 비활성화는 유방암에서 악성 증식을 억제하고 세포사멸을 자극하는 약물의 핵심 성분이라고 주장되어 왔다10,11,12. 종양 미세환경에서의 극심한 저산소증은 저산소증 유발 인자 1 알파(HIF-1α)의 급증을 강요하며, 이는 유방암의 진행을 더욱 악화시킨다는 것은 잘 알려져 있다13,14,15. 동시에, AKT 자극은 또한 HIF-1α의 과도한 축적을 유도하여, 유방암 샘플에서 세포사멸을 제한한다16,17. 흥미롭게도, PI3K-AKT-HIF-1α 신호전달의 활성화는 폐암18, 대장암19, 난소암20, 전립선암21을 포함한 다양한 암에서 병리학적 진행 및 전이에 관여하는 것으로 확인되었다. HIF-1α에 의해 조율되는 것 외에도 갈래 머리 전사 인자 1(FoxO1) 과발현은 AKT 신호 자극에 의해 유발되며, 이는 주기 정지 및 유방암 세포의 세포 사멸 억제를 촉진합니다22,23. 위의 확실한 증거는 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 신호전달의 캐스케이드 억제가 유방암에서 약물 요법을 위한 잠재적인 새로운 표적이 될 수 있음을 시사합니다.

Salidroside (Sal)는 항암 24,25, 항 저산소증26,27,28,29 및 면역 강화 약리 활성30을 발휘하는 것으로 널리 입증되었습니다. 물에 쉽게 용해되는 밝은 갈색 또는 갈색 분말이며 페닐에탄노이드 배당체의 일종이며 화학 구조식은 C14H 20 O7이고 분자량은300.331,32입니다. 현대의 약리학적 연구는 Sal이 PI3K-AKT-mTOR 신호전달을 억제함으로써 위암 세포의 세포사멸을 촉진할 수 있음을 입증했다24. 추가 증거는 또한 Sal 치료에 의한 PI3K-AKT-HIF-1α 신호전달의 억제가 화학요법제에 대한 암세포의 감수성을 향상시킴으로써 암세포의 세포사멸에 기여할 수 있음을 시사한다25. 증거는 또한 Sal이 세포 이동 및 침입을 제한하고 인간 유방암 MCF-7 세포33,34에서 세포 사멸을 촉진하여 주기 정지를 유발한다는 것을 시사합니다. 그러나 Sal이 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 신호전달을 조절하고 MCF-7 세포의 악성 증식을 억제할 수 있는지는 아직 밝혀지지 않았습니다. 따라서 이 프로토콜은 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로를 통해 MCF-7 세포 이동, 침입, 세포 주기 및 세포 사멸에 대한 Sal의 효과를 탐색하는 것을 목표로 했습니다. 세포 이동 및 침습 평가, 유세포 분석에 의한 세포 사멸 및 세포 주기 검출, 활성 산소 종(ROS) 및 Ca2+ 형광 측정 등과 같은 기존의 저비용 및 독립적인 실험으로 구성된 통합 연구 전략은 전통 한약을 사용한 항암 연구를 위한 전반적인 실험 설계에 대한 참고 자료를 제공할 수 있습니다. 이 연구의 실험 과정은 그림 1에 나와 있습니다.

프로토콜

본 연구에 사용된 MCF-7 세포는 상업적 출처에서 얻은 것입니다( 재료 표 참조).

1. 세포 배양

  1. 10% FBS 및 1% 페니실린(10,000U/mL)/스트렙토마이신(10,000μg/mL)을 함유한 DMEM을 사용하여 37°C에서 가습된 5%CO2 분위기에서 MCF-7 세포를 배양합니다( 재료 표 참조).
    참고: 접시 바닥의 90%를 차지하는 세포를 실험에 사용하고 대조군, 독소루비신 염산염 그룹(DXR, 5μM) 및 Sal 그룹(20μM, 40μM 및 80μM) 또는 대조군, LY294002(10μM, PI3K 억제제) 그룹, Sal(80μM) 그룹 및 LY294002(10μM) + Sal(80μM) 그룹( 재료 표 참조).

2. 세포 생존율 분석

참고: 이 절차에 대한 자세한 내용은 이전 보고서27을 참조하십시오.

  1. 96웰 플레이트에 8 x 104 세포/웰 밀도의 MCF-7 세포를 파종하고 세포가 부착될 때까지 Sal(10μM, 20μM, 40μM, 80μM, 160μM 및 320μM)로 24시간 동안 또는 Sal(20, 40, 80μM)로 12시간/24시간/36시간/48시간 동안 배양합니다.
  2. 처리 후 MCF-7 세포를 10μL/웰의 CCK-8 용액( 재료 표 참조)과 2시간 동안 공동 배양합니다. 그런 다음 자동 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm(OD450)에서 광학 밀도를 측정합니다.

3. 세포 이동 및 침입

참고: 이 절차에 대한 자세한 내용은 이전 보고서35를 참조하십시오.

  1. 접시 바닥의 90%를 덮도록 6웰 플레이트에 파종한 5 x 106 cells/mL 세포 2mL를 배양합니다.
  2. 멸균 피펫 팁으로 세포 단층의 중심을 따라 선형 스크래치 감기를 수행합니다. 광학 현미경을 사용하여 0시간, 24시간, 48시간에서 이미지를 획득합니다.
  3. Image J 소프트웨어를 사용하여 긁힌 상처의 너비를 측정합니다.
  4. 트랜스웰 분석의 경우, 혈청 배지 없이 MCF-7 세포를 현탁시키고 Matrigel을 사용하거나 사용하지 않고 사전 코팅된 상부 트랜스웰 챔버에 파종합니다( 재료 표 참조).
  5. transwell 약실의 바닥에서는, 화학 유도자로 DMEM 완전한 매체를 이용하십시오. 24시간 후, 상부 챔버에서 세포를 제거하고, 메탄올35에 잔류하는 침습성 및 이주성 세포를 고정시킨다.
  6. MCF-7 세포를 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색합니다( 재료 표 참조). 광학 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다.

4. Na+-K+-ATPase 및 Ca 2+-Mg2+-ATPase의 활성 평가

  1. 비신코닌산(BCA) 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 용해된 MCF-7 세포의 단백질 농도를 측정합니다( 재료 표 참조).
    1. 용해된 세포의 샘플을 해당 그룹에 96웰 플레이트에 추가합니다. 그 후, 작업 용액을 추가하여 37 °C에서 5 분 동안 추가로 배양합니다. 마지막으로 다기능 마이크로플레이트 리더로 OD636 의 값을 측정합니다.

5. 세포사멸 및 세포주기의 유세포 분석

참고: 이 절차에 대한 자세한 내용은 이전 보고서31을 참조하십시오.

  1. 세포를 분해하고 인산염 완충 식염수(PBS)에서 20분 동안 annexin V-FITC 및 propidium iodide(PI)로 염색한 다음( 재료 표 참조) 유세포 분석기를 사용하여 자가사멸 세포의 수를 측정합니다.
  2. 재현탁된 샘플 용액을 PI 용액과 혼합하여 30분 동안 배양한 후 유세포 분석기로 검출합니다.

6. DCFH-DA 및 Fluo-4 AM 형광 염색

참고: 이 절차에 대한 자세한 내용은 이전 보고서29를 참조하십시오.

  1. 37°C에서 10μM DCFH-DA 형광 프로브( 재료 표 참조)를 사용하여 MCF-7 세포를 20분 동안 배양합니다. PBS로 3회 세척하여 잉여 DCFH-DA를 완전히 제거한 후 형광 현미경을 사용하여 각각 488nm 및 525nm의 여기 및 방출 파장에서 형광 강도를 테스트합니다.
  2. MCF-7 세포를 5μM Fluo-4 AM 형광 프로브 용액( 재료 표 참조)으로 37°C에서 45분 동안 배양합니다. PBS로 세 번 세척한 후 형광 현미경을 사용하여 각각 488nm 및 516nm의 여기 및 방출 파장에서 형광 강도 값을 결정합니다.

7. 웨스턴 블롯

  1. 다양한 약물이 포함된 2mL의 5 x 10 6 cells/mL 세포 현탁액을6 웰 플레이트에 추가하고 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다.
    참고: 웨스턴 블롯 분석을 위한 그룹은 대조군, LY294002(10μM)군, Sal(80μM)군 및 LY294002(10μM)+Sal(80μM)군으로 설정되었습니다( 재료 표 참조).
  2. 세포와 상층액을 수집하고 4°C에서 560× g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 미리 냉각된 PBS로 두 번 세척하십시오. 세척할 때마다 4°C에서 560× g 으로 3분 동안 세포를 원심분리합니다.
  3. 7.2단계의 세포 샘플에 50μL 용해 완충액을 추가하여 15분 동안 얼음 목욕을 합니다. 4°C에서 8550× g 으로 10분 동안 원심분리하여 상층액 단백질 샘플을 수집합니다.
  4. BCA 방법을 사용하여 단백질 농도를 검출한 후 7.3단계의 단백질 샘플을 로딩 버퍼와 4:1의 비율로 혼합하고 금속 수조에서 100°C에서 10분 동안 변성시킨 후 실온으로 냉각합니다.
  5. 단계 7.4에서 단백질 표본의 20 μg를 추가하고, 10% SDS-PAGE를 사용하여 다른 분자량35를 가진 단백질을 분리하고십시오 ( 물자의 표 보십시오), 그 후에 0.22 μm PVDF 막으로 옮깁니다. 5% BSA로 막힌 후 4°C에서 하룻밤 동안 해당 1차 항체로 멤브레인을 배양합니다.
    참고: 절단된 카스파제-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 및 β-actin과 같은 1차 항체의 희석 농도는 1:1,000입니다( 재료 표 참조).
  6. 다음날 37°C에서 2시간 동안 염소 항토끼 IgG 2차 항체로 막을 배양합니다. ECL 화학발광 용액을 사용하여 멤브레인을 개발하고 비접촉식 정량적 웨스턴 블롯 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 캡처합니다( 재료 표 참조).

8. qRT-PCR (영문)

  1. 원심분리를 수행하여 4°C에서 560 x g 에서 3분 동안 MCF-7 세포를 수집하고 500μL 완충액 RL1을 5 × 106 세포에 추가합니다. 세포 덩어리가 보이지 않을 때까지 피펫으로 불고 반복적으로 혼합합니다.
    참고: Buffer RL1은 total RNA isolation kit의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조).
  2. 8.1 단계의 세포 균질액을 수집 튜브에 내장된 DNA 세척 컬럼으로 옮기고 4°C에서 8,550× g 으로 2분 동안 원심분리합니다. DNA 세척 컬럼을 제거하고 상층액을 수집 튜브에 보관합니다.
    참고: DNA 세척 컬럼과 수집 튜브는 전체 RNA 분리 키트의 두 가지 구성 요소입니다( 재료 표 참조).
  3. 8.2단계에서 상층액 500μL에 800μL 완충액 RL2를 첨가하고 부드럽게 혼합합니다.
    참고: Buffer RL2는 total RNA isolation kit의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조). 사용하기 전에 120mL의 무수 에탄올을 60mL의 완충액 RL2에 첨가합니다.
  4. 단계 8.3에서 혼합물 700μL를 수집 튜브에 내장된 RNA 전용 컬럼으로 옮기고 4°C에서 1분 동안 8,550× g 으로 원심분리합니다. 수집 튜브에 있는 폐액을 버리십시오.
    참고: RNA 전용 컬럼은 전체 RNA 분리 키트의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조).
  5. 8.4단계를 반복하여 8.3단계에서 나머지 혼합물을 처리합니다.
  6. RNA 전용 컬럼에 500μL의 완충액 RW1을 추가하고 4°C에서 8,550× g 으로 1분 동안 원심분리합니다. 수집 튜브에 있는 폐액을 버리십시오.
    참고: 버퍼 RW1은 전체 RNA 분리 키트의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조).
  7. RNA 전용 컬럼에 700μL의 완충액 RW2를 추가하고 4 ◦C에서 8,550× g 으로 1분 동안 원심분리합니다. 수집 튜브에 있는 폐액을 버리십시오. 8.7단계를 한 번 반복합니다.
    참고: 완충액 RW2는 전체 RNA 분리 키트의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조).
  8. RNA 전용 컬럼을 수집 튜브에 다시 넣고 4°C에서 8550× g 으로 2분 동안 원심분리하여 나머지 완충액 RW2를 제거합니다.
  9. RNA 전용 컬럼을 새 수집 튜브로 옮기고 65°C에서 예열된 100μL의 RNase-free ddH2O를 RNA 전용 컬럼용 멤브레인 중앙으로 떨어뜨립니다. 25°C에서 2분간 방치하고, 4°C에서 8,550× g 에서 1분간 원심분리하여 RNA 용액을 채취합니다.
    참고: RNase-free ddH2O는 전체 RNA 분리 키트의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조).
  10. 4 μL의 5x 반응 완충액, 1 μL의 올리고(dT)18 프라이머, 1 μL의 무작위 헥사머 프라이머, 1 μL의 유전자 특이적 프라이머(표 1 참조), 1 μL의 효소 혼합물 및 8.9단계의 RNA 용액 5 μg을 100 μL 8-튜브 스트립에 추가합니다. RNase가 없는 물로 반응 시스템을 20μL까지 보충합니다.
  11. 시스템의 반응 조건을 다음과 같이 설정하십시오 : (1) : 95 °C, 30 s, 1 사이클; (2): 95°C, 5초, 50주기, 60°C, 34초; (3): 95°C, 5초, 1주기, 65°C, 60초, 97°C, 1초; 및 (4): 42°C, 30초, 1사이클. qRT-PCR 프로시저를 실행합니다.
    참고: 표적 유전자의 상대적 발현 수준은 2−ΔΔCT 방법36,37에 의해 정량적으로 분석되었습니다. qRT-PCR 분석에 사용되는 각 유전자의 프라이머 정보는 표 1에 기재되어 있다.

9. 통계 분석

  1. 데이터를 세 개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차로 표현합니다.
  2. 그래프 및 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 단방향 분산 분석(ANOVA)과 Tukey의 검정을 사용하여 여러 그룹 간의 비교를 분석합니다. 이 연구에서 P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 정의되었습니다.

결과

MCF-7 세포의 과잉 증식 억제 및 상처 치유 지연에 대한 Sal의 효과
유방암에 대한 Sal의 잠재력을 조사하기 위해 먼저 인간 유방암 MCF-7 세포주의 세포 증식 독성 및 스크래치 분석을 사용하여 항암 특성을 테스트했습니다. 이들 세포를 24시간 동안 일련의 Sal(5-320μM) 농도와 함께 공동 배양하고, CCK-8 분석을 사용하여 세포 증식을 평가하였다. 세포 증식에 대한 Sal의 용량 의존적 억제 효...

토론

유방암은 모든 연령대의 개인에게 영향을 미치며 헤아릴 수 없는 신체적, 정신적 부담과 큰 경제적 압박을 유발합니다1. 매년 이환율과 사망률이 증가하는 유방암은 기존 치료법을 넘어 효과적인 한방 기반 복합 요법을 찾는 측면에서 전 세계적으로 주목을 받고 있습니다 4,5. 유망하게도, Sal24,25,38

공개

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 말

이 작업은 쓰촨성 건강위원회(120025)의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1% penicillin/streptomycinHyCloneSV30010
AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT0185
Annexin V-FITC/PI kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.AP101
Automatic microplate readerMolecular DevicesSpectraMax iD5
Bax antibodyCell Signaling Technology, Inc.#5023
BCA kitBiosharp Life SciencesBL521A
Bcl-2 antibodyCell Signaling Technology, Inc.#15071
Bim antibodyCell Signaling Technology, Inc.#2933
Ca2+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-4-2
Cell counting kit-8Biosharp Life SciencesBS350B
Cell cycle staining kitMultiSciences Biotech Co., Ltd.CCS012
cleaved caspase-3Cell Signaling Technology, Inc.#9661
cleaved caspase-7Cell Signaling Technology, Inc.#8438
cleaved caspase-9Cell Signaling Technology, Inc.#20750
Crystal violet solutionBeyotime BiotechnologyC0121
DMEM high glucose culture mediumServicebio Technology Co., Ltd.G4510
Doxorubicin hydrochlorideMedChemExpressHY-15142
ECL chemiluminescent solutionBiosharp Life SciencesBL520B
Fetal bovine serumProcell Life Science & Technology Co., Ltd.164210
Flow cytometerBDFACSCanto figure-materials-2474
Fluo-4 AMBeyotime BiotechnologyS1060
FoxO1 antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYT1758
Goat anti-rabbit IgG secondary antibodyMultiSciences Biotech Co., Ltd.70-GAR0072
GraphPad Prism softwareLa JollaVersion 6.0
HIF-1α antibodyAffinity BiosciencesBF8002
Human breast cancer cell line MCF-7Procell Life Science & Technology Co., Ltd.CL-0149
Loading bufferBiosharp Life SciencesBL502B
LY294002MedChemExpressHY-10108
MatrigelThermo 356234
mTOR antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11405
Na+–K+–ATPase assay kitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA070-2-2
Optical microscopeOlympusIX71PH
p-AKT antibodyImmunoWay Biotechnology CompanyYP0006
PI3K antibodyServicebio Technology Co., Ltd.GB11525
p-PI3K antibodyAffinity BiosciencesAF3241
Quantitative western blot imaging systemTouch Image ProeBlot
Reverse transcription first strand cDNA synthesis kitServicebio Technology Co., Ltd.G3330-100
ROS assay kitBeyotime BiotechnologyS0033SDCFH-DA fluorescence probe is included here
SalidrosideChengdu Herbpurify Co., Ltd.H-040
SDS-PAGE kitServicebio Technology Co., Ltd.G2003-50T
Total RNA isolation kitForegeneRE-03014
TrypsinHyCloneSH30042.01
β-actinAffinity BiosciencesAF7018

참고문헌

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