نموذج استنزاف ورم خبيث في العقدة الليمفاوية لتقييم ديناميكيات الخلايا التائية CD8 + الخاصة بالمستضد أثناء تكوين الورم

Summary

يوفر التصميم التجريبي المعروض هنا نموذجا تناسليا مفيدا لدراسات الخلايا التائية CD8⁺ الخاصة بمولد الضد أثناء ورم خبيث في العقدة الليمفاوية (LN) ، والذي يستبعد اضطراب خلايا CD8⁺ T المتارة.

Abstract

تكتسب الخلايا التائية CD8 ⁺ T الخاصة بمستضد الورم من تصريف الغدد الليمفاوية أهمية متراكمة في تصاعد الاستجابة المناعية المضادة للورم أثناء تكوين الأورام. ومع ذلك ، في كثير من الحالات ، تشكل الخلايا السرطانية مواضع نقيلية في الغدد الليمفاوية قبل أن تنتقل إلى أعضاء بعيدة. إلى أي مدى تأثرت استجابات الخلايا التائية ^{CD8 +} المحلية والمنهجية بورم خبيث LN لا يزال غامضا. تحقيقا لهذه الغاية ، أنشأنا نموذج ورم خبيث LN الفئران جنبا إلى جنب مع خط خلايا سرطان الجلد B16F10-GP الذي يعبر عن المستضد الجديد البديل المشتق من فيروس التهاب المشيمية اللمفاوي (LCMV) ، والبروتين السكري (GP) ، والفئران المعدلة وراثيا P14 التي تؤوي مستقبلات الخلايا التائية (TCRs) الخاصة بالببتيد المشتق من GP GP_33-41 المقدم من جزيء معقد التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الأولى (MHC) H-2D^b. يتيح هذا البروتوكول دراسة استجابات الخلايا التائية CD8 ⁺ الخاصة بالمستضد أثناء ورم خبيث LN. في هذا البروتوكول ، تم زرع الفئران C57BL / 6J تحت الجلد بخلايا B16F10-GP ، تليها النقل بالتبني بخلايا P14 الساذجة. عندما نما الورم تحت الجلد إلى قطر 5 مم تقريبا ، تم استئصال الورم الرئيسي ، وتم حقن خلايا B16F10-GP مباشرة في العقدة الليمفاوية التي تستنزف الورم (TdLN). بعد ذلك ، تمت مراقبة ديناميكيات الخلايا التائية CD8 ⁺ أثناء عملية ورم خبيث LN. بشكل جماعي ، قدم هذا النموذج نهجا للتحقيق بدقة في الاستجابات المناعية للخلايا التائية CD8 ⁺ الخاصة بالمستضد أثناء ورم خبيث LN.

Introduction

أحدث العلاج المناعي للسرطان ، وخاصة حصار نقاط التفتيش المناعية (ICB) ، ثورة في علاج السرطان¹. يمنع ICB المستقبلات المناعية المثبطة (مثل PD-1 و Tim-3 و LAG-3 و TIGIT) ، والتي يتم التعبير عنها بشكل كبير في خلايا CD8 ⁺ T المنهكة في البيئة المكروية للورم (TME) ، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا التائية CD8 ⁺ T المنهكة². بالنظر إلى عدم تجانس خلايا CD8 ⁺ T المستنفدة ، كشفت الأدلة المتراكمة أن خلايا CD8 ⁺ T الخاصة بالورم المشتقة من المحيط ، بما في ذلك تصريف العقدة الليمفاوية (dLN) ، ولكن ليس في TME ، تتوسط في فعالية ICB^3،4،

Protocol

كانت الفئران C57BL / 6J (المشار إليها بالفئران B6) والفئران المعدلة وراثيا P14 الساذجة ^9,27 المستخدمة من 6 إلى 10 أسابيع من العمر تزن 18-22 جم. تم تضمين كل من الذكور والإناث دون عشوائية أو تعمية. أجريت جميع الدراسات على وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام في جامعة تشينغداو الزراعية.

1. تحضير الوسط والكواشف

1. قم بإعداد وسط زراعة خلايا سرطان الجلد B16F10-GP ، المسمى D10 (وسط DMEM الكامل) عن طريق إضافة DMEM ، مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، 1٪ L-glutamine مع 100 وحدة / مل بوروميسين إضافية. الحفاظ على D10 معقم وتخزينها لمد....

النتائج

يظهر الرسم التخطيطي لهذا التصميم التجريبي في الشكل 1 أ. تم زرع ما مجموعه 5 × 10⁵ خلايا B16F10-GP في 100 ميكرولتر من PBS تحت الجلد (s.c.) في المنطقة الأربية الثنائية للفئران CD45.2 C57BL / 6J. بعد 7 أيام ، تم حقن هذه الفئران الحاملة للورم داخل الصفاق (i.p.) ب 4 ملغ CTX ، تليها النقل بالتبني لخلايا .......

Discussion

أثناء تكوين الورم ، تبتلع الخلايا المقدمة للمستضد (APCs) مستضدات الورم وتهاجر إلى TdLN حيث تقوم بتجهيز خلايا CD8 ⁺ T. بعد التحضير والتنشيط ، تترك خلايا CD8 ⁺ T TdLN وتتسلل إلى الورم لقتل الخلايا السرطانية¹⁰. من خلال استئصال TdLN وإدارة FTY720 التي تمنع خروج الخلايا المناعية من الأعض?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	KIRGEN	KG2211
100 U insulin syringe	BD Biosciences	320310
15 mL conical tube	BEAVER	43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma	T48402-25G
2-Methyl-2-butanol	Sigma	240486-100ML
70 μm nylon cell strainer	BD Falcon	352350
APC anti-mouse CD45.1	BioLegend	110714	Clone:A20
B16-GP cell line	Beijing Biocytogen Co.Ltd, China	Custom
BSA-V (bovine serum albumin)	Bioss	bs-0292P
cell culture dish	BEAVER	43701/43702/43703
centrifuge	Eppendorf	5810R-A462/5424R
cyclophosphamide	Sigma	C0768-25G
Cyclophosphamide (CTX)	Sigma	PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
EDTA	Sigma	EDS-500g
FACS tubes	BD Falcon	352052
fetal bovine serum	Gibco	10270-106
flow cytometer	BD	FACSCanto II
hemocytometer	PorLab Scientific	HM330
isoflurane	RWD life science	R510-22-16
KHCO3	Sangon Biotech	A501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199
needle carrier	RWD Life Science	F31034-14
NH4Cl	Sangon Biotech	A501569-0500
paraformaldehyde	Beyotime	P0099-500ml
PE anti-mouse TCR Vα2	BioLegend	127808	Clone:B20.1
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a	BioLegend	100734	Clone:53-6.7
RPMI-1640	Sigma	R8758-500ML
sodium azide	Sigma	S2002
surgical forceps	RWD Life Science	F12005-10
surgical scissors	RWD Life Science	S12003-09
suture thread	RWD Life Science	F34004-30
trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ml