Modelo de metástasis de ganglios linfáticos de drenaje para evaluar la dinámica de las células T CD8+ específicas del antígeno durante la tumorigénesis

Resumen

El diseño experimental presentado aquí proporciona un modelo reproductivo útil para los estudios de células T CD8⁺ específicas de antígeno durante la metástasis de ganglios linfáticos (LN), que excluye la perturbación de las células T CD8⁺ espectadoras.

Resumen

Las células T CD8⁺ específicas del antígeno tumoral de los ganglios linfáticos drenantes adquieren una importancia acumulativa en el montaje de la respuesta inmunitaria antitumoral durante la tumorigénesis. Sin embargo, en muchos casos, las células cancerosas forman loci metastásicos en los ganglios linfáticos antes de seguir haciendo metástasis en órganos distantes. No se sabe hasta qué punto las respuestas locales y sistemáticas de las células T CD8⁺ se vieron influidas por la metástasis de la LN. Con este fin, establecimos un modelo murino de metástasis LN combinado con una línea celular de melanoma B16F10-GP que expresa el neoantígeno sustituto derivado del virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV), la glicoproteína (GP) y los ratones transgénicos P14 que albergan receptores de células T (TCR) específicos del péptido derivado de GP GP_33-41 presentado por la molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I H-2D^b. Este protocolo permite el estudio de las respuestas de los linfocitos T CD8⁺ específicos de antígeno durante la metástasis de LN. En este protocolo, a los ratones C57BL/6J se les implantaron por vía subcutánea células B16F10-GP, seguidas de una transferencia adoptiva con células P14 vírgenes. Cuando el tumor subcutáneo creció hasta aproximadamente 5 mm de diámetro, se extirpó el tumor primario y se inyectaron células B16F10-GP directamente en el ganglio linfático que drena el tumor (TdLN). A continuación, se monitorizó la dinámica de los linfocitos T CD8⁺ durante el proceso de metástasis de LN. En conjunto, este modelo ha proporcionado un enfoque para investigar con precisión las respuestas inmunitarias de las células T CD8⁺ específicas de antígeno durante la metástasis de LN.

Introducción

La inmunoterapia contra el cáncer, especialmente el bloqueo de puntos de control inmunitario (BCI), ha revolucionado la terapia contra el cáncer¹. El BCI bloquea los inmunorreceptores coinhibidores (como PD-1, Tim-3, LAG-3 y TIGIT), que se expresan en gran medida en los linfocitos T CD8⁺ agotados en el microambiente tumoral (TME), lo que conduce a la revitalización de los linfocitos T CD8⁺ agotados². Teniendo en cuenta la heterogeneidad de los linfocitos T CD8⁺ agotados, la evidencia acumulada reveló que los linfocitos T CD8⁺ específicos del tumor derivados de la periferia, inc....

Protocolo

Los ratones C57BL/6J (referidos a ratones B6) y los ratones transgénicos P14 naïve ^9,27 utilizados tenían entre 6 y 10 semanas de edad y pesaban entre 18 y 22 g. Tanto el sexo masculino como el femenino se incluyeron sin aleatorización ni cegamiento. Todos los estudios en animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Agrícola de Qingdao.

1. Preparación del medio y reactivos

1. Prepare el medio de cultivo de células de melanoma B16F10-GP, denominado D10 (medio DMEM completo) a....

Discusión

Durante la tumorigénesis, las células presentadoras de antígenos (APC, por sus siglas en inglés) engullen a los antígenos tumorales y migran a TdLN, donde preparan las células T CD8⁺. Después del cebado y la activación, las células T CD8⁺ abandonan la TdLN y se infiltran en el tumor para destruir las células tumorales^. A través de la resección de TdLN y la administración de FTY720 que bloquea la salida de las células inmunitarias de los órganos linfoides, vario.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	KIRGEN	KG2211
100 U insulin syringe	BD Biosciences	320310
15 mL conical tube	BEAVER	43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma	T48402-25G
2-Methyl-2-butanol	Sigma	240486-100ML
70 μm nylon cell strainer	BD Falcon	352350
APC anti-mouse CD45.1	BioLegend	110714	Clone:A20
B16-GP cell line	Beijing Biocytogen Co.Ltd, China	Custom
BSA-V (bovine serum albumin)	Bioss	bs-0292P
cell culture dish	BEAVER	43701/43702/43703
centrifuge	Eppendorf	5810R-A462/5424R
cyclophosphamide	Sigma	C0768-25G
Cyclophosphamide (CTX)	Sigma	PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
EDTA	Sigma	EDS-500g
FACS tubes	BD Falcon	352052
fetal bovine serum	Gibco	10270-106
flow cytometer	BD	FACSCanto II
hemocytometer	PorLab Scientific	HM330
isoflurane	RWD life science	R510-22-16
KHCO3	Sangon Biotech	A501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199
needle carrier	RWD Life Science	F31034-14
NH4Cl	Sangon Biotech	A501569-0500
paraformaldehyde	Beyotime	P0099-500ml
PE anti-mouse TCR Vα2	BioLegend	127808	Clone:B20.1
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a	BioLegend	100734	Clone:53-6.7
RPMI-1640	Sigma	R8758-500ML
sodium azide	Sigma	S2002
surgical forceps	RWD Life Science	F12005-10
surgical scissors	RWD Life Science	S12003-09
suture thread	RWD Life Science	F34004-30
trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ml