Modèle de métastases ganglionnaires drainantes pour évaluer la dynamique des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène au cours de la tumorigenèse

Résumé

Le plan expérimental présenté ici fournit un modèle de reproduction utile pour les études des lymphocytes T CD8⁺ spécifiques de l’antigène au cours des métastases ganglionnaires (LN), ce qui exclut la perturbation des lymphocytes T CD8⁺ témoins.

Résumé

Les lymphocytes T CD8⁺ spécifiques de l’antigène tumoral provenant des ganglions lymphatiques drainants gagnent en importance dans l’augmentation de la réponse immunitaire antitumorale au cours de la tumorigenèse. Cependant, dans de nombreux cas, les cellules cancéreuses forment des loci métastatiques dans les ganglions lymphatiques avant de métastaser davantage dans des organes distants. On ne sait pas dans quelle mesure les réponses locales et systématiques des lymphocytes T CD8⁺ ont été influencées par les métastases de LN. À cette fin, nous avons mis en place un modèle murin de métastases LN combiné à une lignée cellulaire de mélanome B16F10-GP exprimant le néoantigène de substitution dérivé du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV), la glycoprotéine (GP) et les souris transgéniques P14 hébergeant des récepteurs de lymphocytes T (TCR) spécifiques au peptide GP dérivé de la GP_33-41 présenté par la molécule du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I H-2D^b. Ce protocole permet d’étudier les réponses des lymphocytes T CD8⁺ spécifiques à l’antigène au cours des métastases de LN. Dans ce protocole, des souris C57BL/6J ont été implantées par voie sous-cutanée avec des cellules B16F10-GP, suivies d’un transfert adoptif avec des cellules P14 naïves. Lorsque la tumeur sous-cutanée atteignait environ 5 mm de diamètre, la tumeur primaire était excisée et les cellules B16F10-GP étaient directement injectées dans le ganglion lymphatique drainant la tumeur (TdLN). Ensuite, la dynamique des lymphocytes T CD8⁺ a été surveillée pendant le processus de métastase de LN. Collectivement, ce modèle a fourni une approche permettant d’étudier avec précision les réponses immunitaires des lymphocytes T CD8⁺ spécifiques à l’antigène pendant les métastases de LN.

Introduction

L’immunothérapie du cancer, en particulier le blocage des points de contrôle immunitaires (ICB), a révolutionné le traitement du cancer¹. L’ICB bloque les immunorécepteurs co-inhibiteurs (tels que-1, Tim-3, LAG-3 et TIGIT), qui sont fortement exprimés dans les lymphocytes T CD8⁺ épuisés dans le microenvironnement tumoral (TME), ce qui entraîne la revigoration des lymphocytes T CD8⁺ épuisés². Compte tenu de l’hétérogénéité des lymphocytes T CD8⁺ épuisés, l’accumulation de preuves a révélé que les lymphocytes T CD8⁺ spécifiques à la tumeur dérivés de la périphérie, y compris les ....

Protocole

Les souris C57BL/6J (appelées souris B6) et les souris transgéniques naïves P14 ^9,27 utilisées étaient âgées de 6 à 10 semaines et pesaient de 18 à 22 g. Les hommes et les femmes ont été inclus sans randomisation ni mise en aveugle. Toutes les études sur les animaux ont été menées conformément aux directives du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université agricole de Qingdao.

1. Préparation du milieu et des réactifs

1. Préparez le milieu de culture cellulaire de mélanome B16F10-GP, nommé D10 (milieu DMEM complet) en ajoutant du D....

Discussion

Au cours de la tumorigenèse, les cellules présentatrices d’antigènes (APC) engloutissent les antigènes tumoraux et migrent vers le TdLN où elles amorcent les lymphocytes T CD8⁺. Après amorçage et activation, les lymphocytes T CD8⁺ quittent le TdLN et s’infiltrent dans la tumeur pour tuer les cellules tumorales¹⁰. Grâce à la résection du TdLN et à l’administration de FTY720 qui bloquent la sortie des cellules immunitaires des organes lymphoïdes, plusieurs ét.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	KIRGEN	KG2211
100 U insulin syringe	BD Biosciences	320310
15 mL conical tube	BEAVER	43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma	T48402-25G
2-Methyl-2-butanol	Sigma	240486-100ML
70 μm nylon cell strainer	BD Falcon	352350
APC anti-mouse CD45.1	BioLegend	110714	Clone:A20
B16-GP cell line	Beijing Biocytogen Co.Ltd, China	Custom
BSA-V (bovine serum albumin)	Bioss	bs-0292P
cell culture dish	BEAVER	43701/43702/43703
centrifuge	Eppendorf	5810R-A462/5424R
cyclophosphamide	Sigma	C0768-25G
Cyclophosphamide (CTX)	Sigma	PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
EDTA	Sigma	EDS-500g
FACS tubes	BD Falcon	352052
fetal bovine serum	Gibco	10270-106
flow cytometer	BD	FACSCanto II
hemocytometer	PorLab Scientific	HM330
isoflurane	RWD life science	R510-22-16
KHCO3	Sangon Biotech	A501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199
needle carrier	RWD Life Science	F31034-14
NH4Cl	Sangon Biotech	A501569-0500
paraformaldehyde	Beyotime	P0099-500ml
PE anti-mouse TCR Vα2	BioLegend	127808	Clone:B20.1
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a	BioLegend	100734	Clone:53-6.7
RPMI-1640	Sigma	R8758-500ML
sodium azide	Sigma	S2002
surgical forceps	RWD Life Science	F12005-10
surgical scissors	RWD Life Science	S12003-09
suture thread	RWD Life Science	F34004-30
trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ml