Modell der drainierenden Lymphknotenmetastasierung zur Beurteilung der Dynamik antigenspezifischer CD8+ T-Zellen während der Tumorentstehung

Zusammenfassung

Das hier vorgestellte experimentelle Design bietet ein nützliches Reproduktionsmodell für die Untersuchung von antigenspezifischen CD8⁺ T-Zellen während der Metastasierung von Lymphknoten (LN), das die Störung von CD8⁺ T-Zellen ausschließt.

Zusammenfassung

Tumorantigen-spezifische CD8⁺ T-Zellen aus drainierenden Lymphknoten gewinnen eine zunehmende Bedeutung für die Erhöhung der Anti-Tumor-Immunantwort während der Tumorentstehung. In vielen Fällen bilden Krebszellen jedoch metastasierende Loci in Lymphknoten, bevor sie weiter in entfernte Organe metastasieren. Inwieweit die lokalen und systematischen CD8⁺ T-Zell-Antworten durch LN-Metastasen beeinflusst wurden, bleibt unklar. Zu diesem Zweck haben wir ein murines LN-Metastasenmodell in Kombination mit einer B16F10-GP-Melanomzelllinie aufgebaut, die das Surrogat-Neoantigen exprimiert, das aus dem lymphozytären Choriomeningitis-Virus (LCMV), dem Glykoprotein (GP) und P14-transgenen Mäusen stammt, die T-Zell-Rezeptoren (TCRs) beherbergen, die spezifisch für das GP-abgeleitete Peptid GP_33-41 sind, das vom Klasse-I-Major-Histokompatibilitätskomplex (MHC)-Molekül H-2D^b präsentiert wird. Dieses Protokoll ermöglicht die Untersuchung antigenspezifischer CD8⁺ T-Zell-Antworten während der LN-Metastasierung. In diesem Protokoll wurden C57BL/6J-Mäusen subkutan B16F10-GP-Zellen implantiert, gefolgt von einem adoptiven Transfer mit naiven P14-Zellen. Als der subkutane Tumor auf einen Durchmesser von etwa 5 mm anwuchs, wurde der Primärtumor herausgeschnitten und B16F10-GP-Zellen wurden direkt in den tumordrainierenden Lymphknoten (TdLN) injiziert. Anschließend wurde die Dynamik der CD8⁺ T-Zellen während des Prozesses der LN-Metastasierung überwacht. Insgesamt hat dieses Modell einen Ansatz zur präzisen Untersuchung der antigenspezifischen CD8⁺ T-Zell-Immunantworten während der LN-Metastasierung geliefert.

Einleitung

Die Krebsimmuntherapie, insbesondere die Immun-Checkpoint-Blockade (ICB), hat die Krebstherapie revolutioniert¹. ICB blockiert die koinhibitorischen Immunrezeptoren (wie PD-1, Tim-3, LAG-3 und TIGIT), die in erschöpften CD8⁺ T-Zellen in der Tumormikroumgebung (TME) stark exprimiert werden, was zur Wiederbelebung erschöpfter CD8⁺ T-Zellen führt². Unter Berücksichtigung der Heterogenität erschöpfter CD8⁺ T-Zellen zeigten sich häufende Beweise, dass tumorspezifische CD8⁺ T-Zellen, die aus der Peripherie stammen, einschließlich drainierender Lymphknoten (dLN), aber nicht in TME, di....

Protokoll

Die verwendeten C57BL/6J-Mäuse (als B6-Mäuse bezeichnet) und die naiven P14-transgenen Mäuse ^9,27 waren 6-10 Wochen alt und wogen 18-22 g. Sowohl Männer als auch Frauen wurden ohne Randomisierung oder Verblindung eingeschlossen. Alle Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Qingdao Agricultural University durchgeführt.

1. Herstellung von Medium und Reagenzien

1. Bereiten Sie B16F10-GP Melanom-Zellkulturmedium mit dem Namen D10 (vollständiges DMEM-Medium) vor, indem Sie DMEM, 10 % fötales Rin....

Diskussion

Während der Tumorentstehung verschlingen antigenpräsentierende Zellen (APCs) Tumorantigene und wandern zu TdLN, wo sie CD8⁺ T-Zellen primen. Nach dem Priming und der Aktivierung verlassen CD8⁺ T-Zellen das TdLN und infiltrieren den Tumor, um Tumorzellen abzutöten¹⁰. Durch die TdLN-Resektion und die Verabreichung von FTY720, die den Austritt von Immunzellen aus den lymphatischen Organen blockieren, haben mehrere Studien die zentrale Rolle von TdLN bei der Sicherstellung der.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	KIRGEN	KG2211
100 U insulin syringe	BD Biosciences	320310
15 mL conical tube	BEAVER	43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma	T48402-25G
2-Methyl-2-butanol	Sigma	240486-100ML
70 μm nylon cell strainer	BD Falcon	352350
APC anti-mouse CD45.1	BioLegend	110714	Clone:A20
B16-GP cell line	Beijing Biocytogen Co.Ltd, China	Custom
BSA-V (bovine serum albumin)	Bioss	bs-0292P
cell culture dish	BEAVER	43701/43702/43703
centrifuge	Eppendorf	5810R-A462/5424R
cyclophosphamide	Sigma	C0768-25G
Cyclophosphamide (CTX)	Sigma	PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
EDTA	Sigma	EDS-500g
FACS tubes	BD Falcon	352052
fetal bovine serum	Gibco	10270-106
flow cytometer	BD	FACSCanto II
hemocytometer	PorLab Scientific	HM330
isoflurane	RWD life science	R510-22-16
KHCO3	Sangon Biotech	A501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199
needle carrier	RWD Life Science	F31034-14
NH4Cl	Sangon Biotech	A501569-0500
paraformaldehyde	Beyotime	P0099-500ml
PE anti-mouse TCR Vα2	BioLegend	127808	Clone:B20.1
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a	BioLegend	100734	Clone:53-6.7
RPMI-1640	Sigma	R8758-500ML
sodium azide	Sigma	S2002
surgical forceps	RWD Life Science	F12005-10
surgical scissors	RWD Life Science	S12003-09
suture thread	RWD Life Science	F34004-30
trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ml