用于评估肿瘤发生过程中抗原特异性 CD8+ T 细胞动力学的引流淋巴结转移模型

摘要

这里介绍的实验设计为淋巴结 （LN） 转移期间抗原特异性 CD8⁺ T 细胞的研究提供了一个有用的生殖模型，其中排除了旁观者 CD8⁺ T 细胞的扰动。

摘要

来自引流淋巴结的肿瘤抗原特异性 CD8⁺ T 细胞在肿瘤发生过程中增强抗肿瘤免疫反应中变得越来越重要。然而，在许多情况下，癌细胞在进一步转移到远处器官之前在淋巴结中形成转移位点。局部和系统性 CD8⁺ T 细胞反应在多大程度上受到 LN 转移的影响尚不清楚。为此，我们建立了一个小鼠 LN 转移模型，该模型结合 B16F10-GP 黑色素瘤细胞系，该细胞系表达源自淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒 （LCMV）、糖蛋白 （GP） 和 P14 转基因小鼠的替代新抗原，这些小鼠携带 I 类主要组织相容性复合物 （MHC） 分子 H-2D^b 呈递的 GP 衍生肽 GP_33-41 特异性 T 细胞受体 （TCR）。该协议能够研究LN转移期间的抗原特异性CD8 ⁺ T细胞反应。在该方案中，C57BL/6J小鼠皮下植入B16F10-GP细胞，然后用幼稚P14细胞过继转移。当皮下肿瘤长到直径约5mm时，切除原发肿瘤，将B16F10-GP细胞直接注射到肿瘤引流淋巴结（TdLN）中。然后，监测CD8⁺ T细胞在LN转移过程中的动力学。总的来说，该模型提供了一种精确研究 LN 转移过程中抗原特异性 CD8⁺ T 细胞免疫反应的方法。

引言

癌症免疫疗法，尤其是免疫检查点阻断 （ICB），彻底改变了癌症治疗¹。ICB 阻断在肿瘤微环境 （TME） 中耗竭的 CD8⁺ T 细胞中高表达的抑制性免疫受体（如 PD-1、Tim-3、LAG-3 和 TIGIT），导致耗竭的 CD8⁺ T 细胞重新焕发活力²。考虑到耗竭的 CD8⁺ T 细胞的异质性，越来越多的证据表明，来源于外周的肿瘤特异性 CD8⁺ T 细胞，包括引流淋巴结 （dLN），但不在 TME 中，介导 ICB ^3,4,5,6,7,8 的疗效。最近，TdLN 衍生的 TCF-1⁺TOX^- 肿瘤特异性记忆 CD8⁺ T 细胞 （TdLN-T_TSM） 被证实是 ICB 的真正应答者，它体现了传统记忆 T 细胞的多种功能特性，并且在 ICB 处理后可以进一步扩增和....

研究方案

使用的C57BL/6J小鼠（称为B6小鼠）和幼稚P14转基因小鼠^9,27为6-10周龄，体重为18-22g。男性和女性均未纳入随机化或盲法。所有动物研究均按照青岛农业大学机构动物护理和使用委员会的指导方针进行。

1.培养基和试剂的制备

1. 通过加入 DMEM、10% 胎牛血清 （FBS）、1% 青霉素/链霉素、1% L-谷氨酰胺和额外的 100 U/mL 嘌呤霉素，制备名为 D10（完全 DMEM 培养基）的 B16F10-GP 黑色素瘤细胞培养基。保持无菌D10并在2-4°C下储存长达2周。
2. 通过加入含有 2% FBS、1% 青霉素/链霉素和 1% L-谷氨酰胺的 RPMI-1640 来制备 R2 培养基（用于终止红细胞裂解）。
3. 通过加入 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 和 2% FBS 和 0.01% 叠氮化钠来制备荧光激活细胞分选 （FACS） 缓冲液。叠氮化钠的加入可以延长FACS缓冲液的储存时间，可在2-4°C下储存数月。
4. 通过将 155 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃ 和 0.1 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 加入双蒸水中并将其 pH 调节至 7.3 来制备红细胞裂解 （RBL） ....

讨论

在肿瘤发生过程中，抗原呈递细胞 （APC） 吞噬肿瘤抗原并迁移到 TdLN，在那里它们引发 CD8⁺ T 细胞。启动和激活后，CD8⁺ T 细胞离开 TdLN 并浸润肿瘤以杀死肿瘤细胞¹⁰。通过 TdLN 切除术和阻断免疫细胞从淋巴器官退出的 FTY720 给药，多项研究表明 TdLN 在确保 PD-1/PD-L1 检查点治疗的疗效方面发挥着关键作用^34,35。与此一致，.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	KIRGEN	KG2211
100 U insulin syringe	BD Biosciences	320310
15 mL conical tube	BEAVER	43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma	T48402-25G
2-Methyl-2-butanol	Sigma	240486-100ML
70 μm nylon cell strainer	BD Falcon	352350
APC anti-mouse CD45.1	BioLegend	110714	Clone:A20
B16-GP cell line	Beijing Biocytogen Co.Ltd, China	Custom
BSA-V (bovine serum albumin)	Bioss	bs-0292P
cell culture dish	BEAVER	43701/43702/43703
centrifuge	Eppendorf	5810R-A462/5424R
cyclophosphamide	Sigma	C0768-25G
Cyclophosphamide (CTX)	Sigma	PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
EDTA	Sigma	EDS-500g
FACS tubes	BD Falcon	352052
fetal bovine serum	Gibco	10270-106
flow cytometer	BD	FACSCanto II
hemocytometer	PorLab Scientific	HM330
isoflurane	RWD life science	R510-22-16
KHCO3	Sangon Biotech	A501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199
needle carrier	RWD Life Science	F31034-14
NH4Cl	Sangon Biotech	A501569-0500
paraformaldehyde	Beyotime	P0099-500ml
PE anti-mouse TCR Vα2	BioLegend	127808	Clone:B20.1
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a	BioLegend	100734	Clone:53-6.7
RPMI-1640	Sigma	R8758-500ML
sodium azide	Sigma	S2002
surgical forceps	RWD Life Science	F12005-10
surgical scissors	RWD Life Science	S12003-09
suture thread	RWD Life Science	F34004-30
trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ml