Modelo de Metástase de Linfonodo Drenante para Avaliação da Dinâmica de Células T CD8+ Antígeno-Específicas Durante a Tumorigênese

Resumo

O desenho experimental aqui apresentado fornece um modelo reprodutivo útil para o estudo de células T CD8⁺ antígeno-específicas durante metástases linfonodais (LN), o que exclui a perturbação de células T CD8⁺ circunstantes.

Resumo

As células T CD8⁺ antígeno-específicas tumorais provenientes da drenagem de linfonodos ganham importância acumulada na montagem da resposta imune antitumoral durante a tumorigênese. No entanto, em muitos casos, as células cancerosas formam loci metastáticos nos gânglios linfáticos antes de metastatizar para órgãos distantes. Até que ponto as respostas locais e sistemáticas de células T CD8⁺ foram influenciadas pela metástase de NL permanece obscura. Para isso, montamos um modelo de metástase de LN murino combinado com uma linhagem celular de melanoma B16F10-GP expressando o neoantígeno substituto derivado do vírus da coriomeningite linfocítica (LCMV), glicoproteína (GP) e camundongos transgênicos P14 que abrigam receptores de células T (TCRs) específicos para o peptídeo GP_33-41 derivado da GP apresentado pela molécula H-2D^b do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I. Este protocolo permite o estudo da resposta antígeno-específica de células T CD8⁺ durante metástases de NL. Neste protocolo, camundongos C57BL/6J foram implantados subcutaneamente com células B16F10-GP, seguido de transferência adotiva com células P14 virgens. Quando o tumor subcutâneo crescia para aproximadamente 5 mm de diâmetro, o tumor primário era excisado e as células B16F10-GP eram injetadas diretamente no linfonodo de drenagem tumoral (TdLN). Em seguida, a dinâmica das células T CD8⁺ foi monitorada durante o processo de metástase do NL. Coletivamente, este modelo forneceu uma abordagem para investigar precisamente as respostas imunes de células T CD8⁺ antígeno-específicas durante metástases de NL.

Introdução

A imunoterapia do câncer, especialmente o bloqueio do ponto de verificação imune (ICB), revolucionou a terapia do câncer¹. O ICB bloqueia os imunorreceptores coinibitórios (como PD-1, Tim-3, LAG-3 e TIGIT), que são altamente expressos em células T CD8⁺ esgotadas no microambiente tumoral (TME), levando ao revigoramento^{de células T} CD8⁺ esgotadas2. Considerando a heterogeneidade das células T CD8⁺ esgotadas, evidências acumuladas revelaram que células T CD8⁺ tumor-específicas derivadas da periferia, incluindo linfonodos drenantes (dLN), mas não na EMT, medeiam a eficácia do ICB3,....

Protocolo

Os camundongos C57BL/6J (referidos a camundongos B6) e os camundongos transgênicos P14 virgens ^9,27 utilizados tinham de 6 a 10 semanas de idade, pesando 18-22 g. Homens e mulheres foram incluídos sem randomização ou cegamento. Todos os estudos com animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Agrícola de Qingdao.

1. Preparação do meio e dos reagentes

1. Preparar meio de cultura de células de melanoma B16F10-GP, denominado D10 (meio DMEM completo) adicionando DMEM, soro fetal bovino (....

Discussão

Durante a tumorigênese, as células apresentadoras de antígenos (APCs) engolem antígenos tumorais e migram para TdLN, onde formam células T CD8⁺. Após priming e ativação, as células T CD8⁺ deixam o TdLN e infiltram o tumor para matar as células tumorais¹⁰. Através da ressecção de TdLN e da administração de FTY720, que bloqueiam a saída de células imunes dos órgãos linfoides, vários estudos têm demonstrado o papel fundamental do TdLN em garantir a eficácia.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	KIRGEN	KG2211
100 U insulin syringe	BD Biosciences	320310
15 mL conical tube	BEAVER	43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma	T48402-25G
2-Methyl-2-butanol	Sigma	240486-100ML
70 μm nylon cell strainer	BD Falcon	352350
APC anti-mouse CD45.1	BioLegend	110714	Clone:A20
B16-GP cell line	Beijing Biocytogen Co.Ltd, China	Custom
BSA-V (bovine serum albumin)	Bioss	bs-0292P
cell culture dish	BEAVER	43701/43702/43703
centrifuge	Eppendorf	5810R-A462/5424R
cyclophosphamide	Sigma	C0768-25G
Cyclophosphamide (CTX)	Sigma	PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
EDTA	Sigma	EDS-500g
FACS tubes	BD Falcon	352052
fetal bovine serum	Gibco	10270-106
flow cytometer	BD	FACSCanto II
hemocytometer	PorLab Scientific	HM330
isoflurane	RWD life science	R510-22-16
KHCO3	Sangon Biotech	A501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199
needle carrier	RWD Life Science	F31034-14
NH4Cl	Sangon Biotech	A501569-0500
paraformaldehyde	Beyotime	P0099-500ml
PE anti-mouse TCR Vα2	BioLegend	127808	Clone:B20.1
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a	BioLegend	100734	Clone:53-6.7
RPMI-1640	Sigma	R8758-500ML
sodium azide	Sigma	S2002
surgical forceps	RWD Life Science	F12005-10
surgical scissors	RWD Life Science	S12003-09
suture thread	RWD Life Science	F34004-30
trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ml