Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Tümör Oluşumu Sırasında Antijene Özgü CD8+ T Hücrelerinin Dinamiğinin Değerlendirilmesi için Drenaj Lenf Nodu Metastazı Modeli
* Bu yazarlar eşit katkıda bulunmuştur
Bu Makalede
Özet
Burada sunulan deneysel tasarım, lenf nodu (LN) metastazı sırasında antijene özgü CD8+ T hücrelerinin çalışmaları için yararlı bir üreme modeli sağlar, bu da seyirci CD8+ T hücrelerinin bozulmasını dışlar.
Özet
Drenaj lenf nodlarından tümör antijenine özgü CD8+ T hücreleri, tümör oluşumu sırasında anti-tümör immün yanıtının oluşturulmasında biriken bir önem kazanır. Bununla birlikte, çoğu durumda, kanser hücreleri, uzak organlara daha fazla metastaz yapmadan önce lenf düğümlerinde metastatik lokuslar oluşturur. Lokal ve sistematik CD8+ T hücresi yanıtlarının LN metastazından ne ölçüde etkilendiği belirsizliğini korumaktadır. Bu amaçla, lenfositik koriomenenjit virüsü (LCMV), glikoprotein (GP) ve sınıf I majör histouyumluluk kompleksi (MHC) molekülü H-2Db tarafından sunulan GP kaynaklı peptit GP33-41'e özgü T hücresi reseptörlerini (TCR'ler) barındıran T hücresi reseptörlerini (TCR'ler) barındıran vekil neoantijeni eksprese eden bir B16F10-GP melanom hücre hattı ile birleştirilmiş bir murin LN metastaz modeli oluşturduk. Bu protokol, LN metastazı sırasında antijene özgü CD8+ T hücresi yanıtlarının incelenmesini sağlar. Bu protokolde, C57BL / 6J fareleri deri altına B16F10-GP hücreleri ile implante edildi, ardından saf P14 hücreleri ile evlat edinme transferi yapıldı. Subkutan tümörün çapı yaklaşık 5 mm'ye ulaştığında, primer tümör eksize edildi ve B16F10-GP hücreleri doğrudan tümör drenaj lenf noduna (TdLN) enjekte edildi. Daha sonra, LN metastazı sürecinde CD8+ T hücrelerinin dinamikleri izlendi. Toplu olarak, bu model, LN metastazı sırasında antijene özgü CD8 + T hücresi immün yanıtlarını kesin olarak araştırmak için bir yaklaşım sağlamıştır.
Giriş
Kanser immünoterapisi, özellikle bağışıklık kontrol noktası blokajı (ICB), kanser tedavisinde devrim yarattı1. ICB, tümör mikroçevresindeki (TME) tükenmiş CD8 + T hücrelerinde yüksek oranda eksprese edilen koinhibitör immünoreseptörleri (PD-1, Tim-3, LAG-3 ve TIGIT gibi) bloke eder ve tükenmiş CD8 + T hücrelerinin yeniden canlanmasına yol açar2. Tükenmiş CD8 + T hücrelerinin heterojenliği göz önüne alındığında, biriken kanıtlar, drenaj lenf nodu (dLN) dahil olmak üzere periferden türetilen, ancak TME'de olmayan, tümöre özgü CD8 + T hücrelerinin ICB
Protokol
Kullanılan C57BL/6J fareleri (B6 farelerine atıfta bulunulur) ve saf P14 transgenik fareler 9,27 6-10 haftalıkken 18-22 g ağırlığındaydı. Hem erkek hem de dişi, randomizasyon veya körleme olmadan dahil edildi. Tüm hayvan çalışmaları, Qingdao Ziraat Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür.
1. Ortam ve reaktiflerin hazırlanması
- DMEM,% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 penisilin / streptomisin,% 1 L-glutamin ve ilave 100 U / mL puromisin ekleyerek D10 (tam DMEM ortamı) olarak adlandırılan B16F10-GP ....
Temsili Sonuçlar
Bu deneysel tasarımın şematik diyagramı Şekil 1A'da gösterilmiştir. 100 μL PBS'de toplam 5 x 105 B16F10-GP hücresi, CD45.2 C57BL/6J farelerinin bilateral kasık bölgesine subkutan olarak (s.c.) implante edildi. 7 gün sonra, bu tümör taşıyan farelere intraperitoneal (i.p.) 4 mg CTX enjekte edildi, ardından kuyruk intravenöz (i.v.) enjeksiyon yoluyla 5 x 105 CD45.1 + P14 hücrelerinin evlat edinici transferi yapıldı. Tümörler yaklaşık 3-5.......
Tartışmalar
Tümör oluşumu sırasında, antijen sunan hücreler (APC'ler) tümör antijenlerini yutar ve CD8+ T hücrelerini hazırladıkları TdLN'ye göç eder. Hazırlama ve aktivasyondan sonra, CD8 + T hücreleri TdLN'yi terk eder ve tümör hücrelerini öldürmek için tümöre sızar10. TdLN rezeksiyonu ve lenfoid organlardan bağışıklık hücrelerinin çıkışını bloke eden FTY720'nin uygulanması yoluyla, birkaç çalışma TdLN'nin PD-1/PD-L1 kontrol noktası tedavisini.......
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin'in Seçkin Genç Akademisyenleri için Ulusal Bilim Vakfı (No. 82122028'den LX'e), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82173094'den LX'e), Chong Qing Doğa Bilimleri Vakfı (No. 2023NSCQ-BHX0087'dan SW'ye) tarafından desteklenmiştir.
....Malzemeler
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Referanslar
- Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
- Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N.
Yeniden Basımlar ve İzinler
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiDaha Fazla Makale Keşfet
This article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır