종양 형성 중 항원 특이적 CD8+ T 세포의 역학을 평가하기 위한 배액 림프절 전이 모델

요약

여기에 제시된 실험 설계는 림프절(LN) 전이 중 항원 특이적 CD8⁺ T 세포 연구에 유용한 생식 모델을 제공하며, 이는 방관자 CD8⁺ T 세포의 섭동을 배제합니다.

초록

림프절 배액의 종양 항원 특이적 CD8⁺ T 세포는 종양 형성 중 항종양 면역 반응을 증가시키는 데 축적되는 중요성을 얻습니다. 그러나 많은 경우 암세포는 림프절에서 전이성 유전자좌를 형성한 후 멀리 떨어진 장기로 전이됩니다. 국소 및 체계적인 CD8⁺ T 세포 반응이 LN 전이에 의해 어느 정도 영향을 받았는지는 아직 불분명합니다. 이를 위해 림프구성 맥락막염 바이러스(LCMV), 당단백질(GP) 및 클래스 I 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자 H-2D^b에 의해 제시된 GP 유래 펩타이드 GP_33-41에 특이적인 T세포 수용체(TCR)를 보유한 P14 형질전환 마우스에서 유래한 대리 신생항원을 발현하는 B16F10-GP 흑색종 세포주와 결합된 murine LN 전이 모델을 설정했습니다. 이 프로토콜은 LN 전이 중 항원 특이적 CD8⁺ T 세포 반응을 연구할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 C57BL/6J 마우스에 B16F10-GP 세포를 피하 이식한 후 naive P14 세포로 입양 이식했습니다. 피하종양이 직경 약 5mm까지 커지면 원발성 종양을 절제하고, B16F10-GP 세포를 종양 배액 림프절(TdLN)에 직접 주입하였다. 그런 다음 LN 전이 과정에서 CD8⁺ T 세포의 역학을 모니터링했습니다. 종합적으로, 이 모델은 LN 전이 중 항원 특이적 CD8⁺ T 세포 면역 반응을 정밀하게 조사하기 위한 접근 방식을 제공했습니다.

서문

암 면역 요법, 특히 면역 관문 차단(ICB)은 암 치료에 혁명을 일으켰습니다¹. ICB는 종양미세환경(TME)에서 소진된 CD8⁺ T 세포에서 많이 발현되는 동산화 면역 수용체(PD-1, Tim-3, LAG-3, TIGIT 등)를 차단하여 소진된 CD8⁺ T 세포를 활성화시킨다². 소진된 CD8⁺ T 세포의 이질성을 고려할 때, 축적된 증거에 따르면 TME가 아닌 배액 림프절(dLN)을 포함하여 말초에서 유래한 종양 특이적 CD8⁺ T 세포가 ICB ^3,4,5,6,7,8의 효능을 매개하는 것으로 나타났습니다. 최근 TdLN 유래 TCF-1⁺TOX^- 종양 특이적 기억 CD8⁺ T세포(TdLN-T_TSM)는....

프로토콜

사용된 C57BL/6J 마우스(B6 마우스라고 함) 및 나이브 P14 형질전환 마우스(^9,27)는 6-10주령의 체중 18-22g이었다. 남성과 여성 모두 무작위 배정이나 눈가림 없이 포함되었습니다. 모든 동물 연구는 칭다오 농업 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 배지 및 시약의 준비

1. DMEM, 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1% L-글루타민과 100U/mL 퓨로마이신을 추가하여 D10(완전 DMEM 배지)이라는 B16F10-GP 흑색종 세포 배양 배지를 준비합니다. 멸균 D10을 유지하고 2-4 °C에서 최대 2주 동안 보관하십시오.
2. 2% FBS, 1640% 페니실린/스트렙토마이신 및 1% L-글루타민과 함께 1%의 RPMI-1을 첨가하여 R1 배지(적혈구 용해 종료용)를 준비합니다.
3. 2% FBS 및 0.01%의 아지드화나트륨이 포함된 1x 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가하여 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충액을 준비합니다. 아지드화 나트륨을 첨가하면 FACS 완충액의 보관....

토론

종양형성 과정에서 항원제시세포(APC)는 종양항원을 삼키고 TdLN으로 이동하여 CD8⁺ T 세포를 프라이밍합니다. 프라이밍 및 활성화 후, CD8⁺ T 세포는 TdLN을 떠나 종양에 침투하여 종양 세포를 죽인다¹⁰. 림프구에서 면역세포의 출구를 차단하는 TdLN 절제와 FTY720 투여를 통해 여러 연구에서 PD-1/PD-L1 체크포인트 요법의 효능을 보장하는 데 있어 TdLN의 중추적인 역할을 입?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL centrifuge tube	KIRGEN	KG2211
100 U insulin syringe	BD Biosciences	320310
15 mL conical tube	BEAVER	43008
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)	Sigma	T48402-25G
2-Methyl-2-butanol	Sigma	240486-100ML
70 μm nylon cell strainer	BD Falcon	352350
APC anti-mouse CD45.1	BioLegend	110714	Clone:A20
B16-GP cell line	Beijing Biocytogen Co.Ltd, China	Custom
BSA-V (bovine serum albumin)	Bioss	bs-0292P
cell culture dish	BEAVER	43701/43702/43703
centrifuge	Eppendorf	5810R-A462/5424R
cyclophosphamide	Sigma	C0768-25G
Cyclophosphamide (CTX)	Sigma	PHR1404
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	C11995500BT
EDTA	Sigma	EDS-500g
FACS tubes	BD Falcon	352052
fetal bovine serum	Gibco	10270-106
flow cytometer	BD	FACSCanto II
hemocytometer	PorLab Scientific	HM330
isoflurane	RWD life science	R510-22-16
KHCO3	Sangon Biotech	A501195-0500
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation	Life Technologies	L10199
needle carrier	RWD Life Science	F31034-14
NH4Cl	Sangon Biotech	A501569-0500
paraformaldehyde	Beyotime	P0099-500ml
PE anti-mouse TCR Vα2	BioLegend	127808	Clone:B20.1
Pen Strep Glutamine (100x)	Gibco	10378-016
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a	BioLegend	100734	Clone:53-6.7
RPMI-1640	Sigma	R8758-500ML
sodium azide	Sigma	S2002
surgical forceps	RWD Life Science	F12005-10
surgical scissors	RWD Life Science	S12003-09
suture thread	RWD Life Science	F34004-30
trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ml