تفاعل البوليميراز المتسلسل من النوع البري جنبا إلى جنب مع تسلسل سانجر للكشف عن الطفرة الجسدية منخفضة التردد

Summary

تقدم هذه المقالة تطبيق طريقة الكشف منخفضة التردد على أساس تسلسل سانجر في سرطان الغدد الليمفاوية الوعائية. توفير أساس لتطبيق هذه الطريقة على الأمراض الأخرى.

Abstract

عند مراقبة الحد الأدنى المتبقي من المرض (MRD) بعد علاج الورم ، هناك متطلبات أعلى للحد الأدنى للكشف مقارنة بالكشف عن طفرات مقاومة الأدوية وطفرات الخلايا السرطانية المنتشرة أثناء العلاج. يحتوي تسلسل سانجر التقليدي على اكتشاف طفرة من النوع البري بنسبة 5٪ -20٪ ، لذلك لا يمكن أن يلبي حد اكتشافه المتطلبات المقابلة. تشمل تقنيات الحجب من النوع البري التي تم الإبلاغ عنها للتغلب على هذا تضخيم إزاحة المانع (BDA) ، والحمض النووي المقفل غير القابل للتمديد (LNA) ، والمجسات الخاصة بالنقاط الساخنة (HSSP) ، وما إلى ذلك. تستخدم هذه التقنيات تسلسلات قليلة النوكليوتيدات المحددة لمنع النوع البري أو التعرف على النوع البري ثم دمج هذا مع طرق أخرى لمنع تضخيم النوع البري وتضخيم التضخيم الطافر ، مما يؤدي إلى خصائص مثل الحساسية العالية والمرونة والراحة. يستخدم هذا البروتوكول BDA ، وهو تفاعل البوليميراز المتسلسل من النوع البري جنبا إلى جنب مع تسلسل سانجر ، لتحسين الكشف عن الطفرات الجسدية منخفضة التردد RHOA G17V ، ويمكن أن تصل حساسية الكشف إلى 0.5٪ ، والتي يمكن أن توفر أساسا لمراقبة MRD لسرطان الغدد الليمفاوية للخلايا التائية الوعائية.

Introduction

الحد الأدنى من المرض المتبقي (MRD) هو عدد قليل من الخلايا السرطانية التي لا تزال موجودة في الجسم بعد العلاج. نظرا لقلة عددهم ، فإنها لا تؤدي إلى أي علامات أو أعراض جسدية. غالبا ما لا يتم اكتشافها بالطرق التقليدية ، مثل التصور المجهري و / أو تتبع بروتينات المصل غير الطبيعية في الدم. تشير نتيجة اختبار MRD الإيجابية إلى وجود خلايا مريضة متبقية. النتيجة السلبية تعني أن الخلايا المريضة المتبقية غائبة. علاج ما بعد السرطان ، يمكن أن تصبح الخلايا السرطانية المتبقية في الجسم نشطة وتبدأ في التكاثر ، مما يتسبب في انتكاسة المرض. يشير اكتشاف MRD إلى أن العلاج لم يكن فعالا تماما أو أن العلاج لم يكن مكتملا. قد يكون السبب الآخر ....

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة مراجعة الأخلاقيات الطبية في مستشفى يونغتشو المركزي (رقم الموافقة: 2024022601). وقدم المشاركون موافقتهم المستنيرة.

1. تصميم التمهيدي

1. تصميم التمهيدي التقليدي: تصميم الاشعال وفقا لقواعد تصميم التمهيدي المبلغ عنها²⁰ ، تصميم التمهيدي بواسطة NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome). بالنسبة لموقع طفرة RHOA G17V ، فإن جميع التسلسلات المرجعية لتصميم البدايات التقليدية هي تسلسل القاعدة المتحورة. تأكد من أن بادئات التضخيم العكسي المصممة تحتوي على تسلسل موقع الطفرة وأن درج....

النتائج

قارن تسلسل عينة الاختبار بالتسلسل المرجعي للحصول على حالة طفرة عينة الاختبار. يمكن لتقنية WBT-PCR القائمة على BDA اكتشاف طفرة RHOA G17V المعروفة وغيرها من الطفرات منخفضة التردد في فترة التضخيم لبادئات المنبع والمصب. انظر الشكل 1. كما تم تحليل جينين إضافيين ، وهما .......

Discussion

يقدم WTB-PCR المستند إلى تقنية BDA ، الموصوف في هذه المقالة ، برايمر غير متطابق مكمل للنوع الطافر عند تصميم الأوائل التقليدية للتنافس مع النوع البري ، وقمع النوع البري ، وتضخيم المنتج الطافر. بعد ذلك ، تم تسلسل منتجات WTB-PCR لتحليل الطفرة. فائدة WTB-PCR / Sanger هي بساطته وحساسيته العا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen