ПЦР с блокированием дикого типа в сочетании с секвенированием по Сэнгеру для выявления низкочастотных соматических мутаций

Резюме

В данной статье представлено применение метода низкочастотного детектирования, основанного на секвенировании по Сэнгеру при ангиоиммунобластной лимфоме. Дают основание для применения данного метода при других заболеваниях.

Аннотация

При мониторинге минимальной остаточной болезни (МОБ) после лечения опухолей существуют более высокие требования к нижнему пределу обнаружения, чем при выявлении мутаций лекарственной устойчивости и мутаций циркулирующих опухолевых клеток во время терапии. Традиционное секвенирование по Сэнгеру имеет 5%-20% обнаружения мутаций дикого типа, поэтому его предел обнаружения не может соответствовать соответствующим требованиям. Технологии блокирования дикого типа, которые, как сообщается, преодолевают эту проблему, включают амплификацию смещения блокаторов (BDA), нерасширяемые заблокированные нуклеиновые кислоты (LNA), зонды, специфичные для горячих точек (HSSP) и т. д. Эти технологии используют определенные олигонуклеотидные последовательности для блокирования дикого типа или распознавания дикого типа, а затем комбинируют это с другими методами для предотвращения амплификации дикого типа и амплификации мутантных мутантов, что приводит к таким характеристикам, как высокая чувствительность, гибкость и удобство. В этом протоколе используется BDA, блокирующая ПЦР дикого типа в сочетании с секвенированием по Сэнгеру, для оптимизации обнаружения низкочастотных соматических мутаций RHOA G17V, а чувствительность обнаружения может достигать 0,5%, что может обеспечить основу для мониторинга МОБ ангиоиммунобластной Т-клеточной лимфомы.

Введение

Минимальная остаточная болезнь (МОБ) — это небольшое количество раковых клеток, которые все еще присутствуют в организме после лечения. Благодаря своему небольшому количеству, они не приводят к каким-либо физическим признакам или симптомам. Они часто остаются незамеченными с помощью традиционных методов, таких как микроскопическая визуализация и/или отслеживание аномальных сывороточных белков в крови. Положительный результат теста на МОБ указывает на наличие остаточных пораженных клеток. Отрицательный результат означает, что остаточные больные клетки отсутствуют. После лечения рака оставшиеся в организме раковые клетки могут активизироваться и начать размножаться, вызывая рецидив заболевания. Обнаружение МОБ свидетельствует о том, что либо лечение не было полностью эффективным, либо лечение было незавершенным. Другой причиной МОБ-положительных результатов после лечения может быть то, что не все раковые клетки реагировали на терапию или потому что раковые клетки стали устойчивыми к используемым лекарствам^.

Ангиоиммунобластная Т-клеточная лимфома (АИТЛ) является подтипом периферической Т-клеточной лимфомы (ПТКЛ), происходящей из Т-фолликулярных хелперов²; это наиболее распространенный тип Т-клеточной лимфомы, на долю которого приходится около 15%-20% PTCL³. Это группа родственных злокачественных новообразований, которые поражают лимфатическую систему. Исходной клеткой является фолликулярная Т-хелперная клетка. Классификация ВОЗ 2016 года классифицирует его как ангиоиммунобластическую Т-клеточную лимфому⁴. В 2022 г. ВОЗ переименовала его в узловую Т-фолликулярную хелперную лимфому ангиоиммунобластного типа (nTFHL-AI) вместе с узловой Т-фолликулярной хелперной лимфомой фолликулярного типа (nTFHL-F) и узловой Т-фолликулярной хелперной лимфомой, не уточненной иначе (nTFHL-NOS), которые в совокупности именуются узловой фолликулярной хелперной Т-клеточной лимфомой (nTFHL). Это было сделано для выявления его важных клинических и иммунофенотипических особенностей и сходных сигнатур экспрессии гена Т-фолликулярного хелпера (TFH) и мутантов. Генетически nTFHL-AI характеризуется прогрессирующим приобретением соматических мутаций в ранних гемопоэтических стволовых клетках через мутации TET2 и DNMT3A, в то время как мутации RHOA и IDH2 также присутствуют в опухолевых клетках TFH⁵. Несколько исследований показали, что мутация RHOA G17V встречается у 50%-80% пациентов с AITL 6,7,8,9. Белок RHOA, кодируемый геном RHOA, активируется связыванием с гуанозинтрифосфатом (ГТФ) и инактивируется связыванием с гуанозиндифосфатом (GDP). При активации он может связываться с различными эффекторными белками и регулировать различные биологические процессы. Физиологически RHOA опосредует миграцию и полярность Т-клеток, играет роль в развитии тимоцитов и опосредует активацию сигнальных рецепторов пре-Т-клеток (пре-TCR)¹⁰. Мутация RHOA G17V является мутацией, приводящей к потере функции, которая играет ведущую роль в патогенезе лимфомы¹¹. Обнаружение его низкочастотной мутации полезно для мониторинга МОБ AITL.

Секвенирование по Сэнгеру уже более 40 лет используется в качестве золотого стандарта для обнаружения известных и неизвестных мутаций. Тем не менее, его предел обнаружения составляет всего 5%-20%, что ограничивает его применение для обнаружения низкочастотных мутаций^12,13. При секвенировании по Сэнгеру чувствительность обнаружения может быть снижена до 0,1% путем замены традиционной ПЦР на BDA, технологию блокирования дикой природы¹⁴. Технология BDA в основном добавляет несовпадающий праймер, комплементарный мутантному типу, при разработке обычных праймеров для конкуренции с диким типом, чтобы достичь цели амплификации мутантного типа. Ключом к проектированию грунтовки является несоответствие праймера и модификация клеммы. В то же время, согласно структурному принципу ДНК, разница между свободной энергией Гиббса двух праймеров составляет от 0,8 ккал/моль до 5 ккал/моль. Еще одним ключевым шагом в этой методике является подавление амплификации дикого типа путем регулировки соотношения диких и блокирующих праймеров^14,15.

В настоящее время распространенными методами выявления низкочастотных соматических мутаций являются аллель-специфическая ПЦР на основе ПЦР (аллель-специфическая полимеразная цепная реакция, ASPCR), амплификационно-рефрактерная мутационная система PCR (amplification-refractory mutation system-PCR, ARMS-PCR), используемая для генотипирования SNP с помощью рефрактерных праймеров. Разработка праймеров для мутантных и нормальных аллелей позволяет селективно амплифицировать и проводить цифровую ПЦР (Droplet Digital PCR, ddPCR) — метод проведения цифровой ПЦР, основанный на технологии капель водно-масляной эмульсии¹⁶. Образец фракционируют на 20 000 капель, и для каждой капли проводят ПЦР-амплификацию молекул-матриц с чувствительностью 1 х ^10-5; амплификация смещения блокеров (BDA) также является методом обогащения редких аллелей на основе ПЦР, используемым для точного обнаружения и количественного определения SNV и инделов с концентрацией до 0,01% VAF в среде с высокой мультиплексированностью; технология заблокированных нуклеиновых кислот (нерасширяемая заблокированная нуклеиновая кислота, LNA) — класс высокоаффинных аналогов РНК, в которых кольцо рибозы заперто в идеальной конформации для связывания по методу Уотсона-Крика; зонды, специфичные для горячих точек (Hot-Spot-Specific Probe, HSSP), перекрывают целевую последовательность праймера, включают одну мутацию и модифицируются спейсером C3 на конце C3^' для предотвращения амплификации с помощью qPCR 14,16,17,18. Когда мутация в последовательности существует, HSSP конкурентно присоединяется к целевой мутации и предотвращает связывание праймера с целевой мутантной последовательностью, что останавливает амплификацию последовательности; NGS (next-generation sequencing) - высокопроизводительное секвенирование иммуноглобулинов (igHTS) Персонализированное профилирование рака методом глубокого секвенирования (CAAP-seq), это метод нового поколения, основанный на секвенировании, используемый для количественной оценки циркулирующей ДНК в раковых клетках (чувствительность составляет 1 x ^10-4); и так далее. Среди них большинство методов основаны на ПЦР и могут обнаруживать только небольшое количество сайтов мутаций, а методы, основанные на NGS, могут обнаруживать несколько сайтов, но стоимость высока, а процесс сложен 14,16,17,18. Были сообщения об обнаружении низкочастотных мутаций RHOA G17V на основе количественной ПЦР, но предел обнаружения может достигать только около 2%¹⁹. Нет сообщений об обнаружении низкочастотной мутации RHOA G17V на основе секвенирования по Сэнгеру. Здесь мы демонстрируем повышение чувствительности, достигнутое BDA, блочной ПЦР дикого типа в сочетании с секвенированием по Сэнгеру, для оптимизации обнаружения низкочастотных соматических мутаций RHOA G17V, при этом чувствительность обнаружения может достигать 0,5%. Также предоставляются дополнительные данные для IDH2 и JAK1.

В данной статье представлен подробный протокол схемы детектирования низкочастотных мутаций RHOA G17V методом секвенирования по Сэнгеру, а также приведены рекомендации по разработке более низкочастотных детектирующих мутаций на основе платформы секвенирования Сэнгера. Этот метод может быть использован для обнаружения и мониторинга возможных мутаций лекарственной устойчивости и минимальных остатков в опухолях.

протокол

Данное исследование было одобрено комитетом по рассмотрению медицинской этики Центральной больницы Юнчжоу (номер одобрения: 2024022601). Участники дали информированное согласие.

1. Дизайн грунтовки

1. Традиционная конструкция грунтовки: Разработка грунтовок в соответствии с указанными правилами проектирования грунтовки²⁰, разработка грунтовки NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome). Для сайта мутации RHOA G17V все референсные последовательности для конструирования обычных праймеров представляют собой мутировавшую последовательность оснований. Убедитесь, что разработанные праймеры с обратной амплификацией содержат последовательность сайта мутации, а температура отжига праймеров составляет около 60 °C.
2. Конструкция грунтовки BDA
   1. Спроектируйте дикий блокирующий праймер длиной около 20-30 пар оснований (.н.), содержащий 2-4 модифицированных основания, и модифицированные основания, состоящие из А и Т. Убедитесь, что блокирующий праймер имеет 6-14.о., перекрывающихся с праймером амплификации мутаций, используемым для конкуренции с праймером амплификации мутаций.
   2. Спроектируйте грунтовку с температурой отжига для окончательно разработанных мутантных амплификационных грунтовок и диких блокирующих грунтовок, установленной при температуре около 60 °C, и разницей в свободной энергии Гиббса между 0,8-5 ккал/моль. Подробные правила расчета см. в литературе¹⁵.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если спроектированные грунтовки не соответствуют вышеуказанным условиям, основания могут быть добавлены или вычтены вручную для корректировки. Окончательный перечень разработанных грунтовок приведен в таблицах 1 и 2.

2. Пробоподготовка и экстракция ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспериментальные проверочные образцы получены из образцов периферической крови, костного мозга или солидных опухолей пациентов с лимфомой человека. Было обнаружено 10 положительных образцов: 3 образца солидных опухолей, 4 образца костного мозга и 3 образца периферической крови. Есть 30 отрицательных образцов от здоровых людей.

1. Экстракция образцов костного мозга и периферической крови
   1. Добавьте 400 мкл образца костного мозга или периферической крови и реагентов в соответствующие пробирки в соответствии с требованиями и экстрагируйте в соответствии с процедурой экстракции, установленной производителем.
   2. Подготовьте новые пробирки для образцов и пробирки для микроцентрифуг объемом 1,5 мл. Пронумеруйте пробирки с образцами от 1 до 24. Отметьте крышки пробирок объемом 1,5 мл названием образца и датой извлечения в порядке названий на соответствующих пробирках для сбора крови. Отметьте 1-24 на боковой стороне микроцентрифужной пробирки для проверки соответствия один к одному.
   3. Добавьте 40 мкл раствора протеиназы К в пробирку с образцом и добавьте 400 мкл образца цельной крови (для объемов менее 400 мкл заполните до 400 мкл PBS).
   4. Поместите пробирку для образца (1-24), наконечник пипетки (включая крышку пипетки) и пробирку для сбора в соответствующие положения. Извлеките ДНК в соответствии с процедурой производителя.
2. Экстракция образцов с фиксированным формалином парафином (FFPE)
   1. Поместите образцы и реактивы в соответствующие пробирки в соответствии с требованиями и извлеките в соответствии с процедурой экстракции производителя.
   2. Добавьте 1,1 мл буфера для хранения протеиназы К (раствор ФК) в сухой порошок протеиназы К, вортекс, и хорошо перемешайте до получения раствора протеиназы К с концентрацией 10 мг/мл. Хранить при температуре -20 °C.
   3. Достаньте раствор протеиназы К и полностью растопите его при комнатной температуре. Включите сухой термостат и установите температуру на уровне 55 °C.
   4. Возьмите микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и напишите на ней название образца. Возьмите менее 30 мг ткани и поместите ее в микроцентрифужную пробирку. Затем добавьте в пробирку 500 мкл буфера депарафина и 20 мкл раствора протеиназы К.
   5. После вихревого перемешивания в течение не менее 10 секунд поместите микроцентрифужную пробирку в сухой термостат и держите ее в тепле при температуре 55 °C в течение 90 минут.
   6. Убедитесь, что спиновая колонна входит в трубку фильтра. После того как инкубация будет завершена, перенесите образец, включая жидкость и ткань, в спиновую колонку. Центрифугируйте при давлении 16 500 x g в течение 5 минут, чтобы центрифугировать всю жидкость в фильтрующую трубку.
   7. Возьмите 1 пробирку с образцом (без колпачка), входящую в комплект, и напишите на ней название образца. Переведите жидкость из пробирки фильтра объемом 400 мкл в пробирку для образца.
   8. После завершения предварительной обработки и подготовки образца поместите соответствующие расходные материалы и реактивы в соответствующие места и произведите экстракцию ДНК в соответствии с инструкциями производителя.
3. Контроль качества ДНК
   1. Измерьте концентрацию и чистоту извлеченной ДНК и убедитесь, что концентрация ДНК составляет ≥ 25 нг/л. Запишите концентрацию ДНК каждого образца и немедленно используйте для последующего обнаружения или заморозьте при -20 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значения OD260/OD280 обычно используются для проверки чистоты образцов ДНК. Нормальное значение OD260/OD280 составляет около 1,7-1,9, что указывает на хорошую чистоту ДНК; если значение OD260/OD280 составляет ≤1,7, это указывает на возможное загрязнение белков; если значение OD260/OD280 равно ≥2,0, это указывает на возможное загрязнение РНК или деградацию ДНК.

3. ПЦР-амплификация

1. Подготовка грунтовок
   1. Приготовление грунтовочного раствора
      1. Достаньте грунтовку, сухой порошок и центрифугируйте при 5400-8400 х г в течение 2-3 минут. Проверьте значение nmol грунтовки и медленно откройте крышку. С помощью пипетки с соответствующим объемом двойной дистиллированной воды (ddH₂O), который в 10 раз превышает значение нМ, медленно добавьте ее вдоль стенки пробирки праймера.
      2. Приготовьте грунтовки в массовом растворе 0,1 нМ/мкл или 100 мкМ (например, значение нМ равно 21,1; соответственно, добавляемая вода равна 211 мкл). Вортекс тщательно перемешайте, затем кратковременно центрифугируйте, чтобы убедиться, что раствор достигает дна каждой лунки. Напишите название праймера, конфигурационные данные и конфигуратора на крышке пробирки. Поместите его в соответствующее место хранения складского раствора.
   2. Приготовление рабочего раствора грунтовки
      1. Пипетка 5 мкл прямого праймера, 5 мкл обратного праймера, 50 мкл исходного раствора праймера дикого типа и 40 мкл ddH₂O в чистой микроцентрифужной пробирке. Повторяйте пипетку в 2-3 раза, перемешайте вихрь и мгновенно раскрутите.
      2. Напишите название грунтовки, дату настройки и человека, который ее настроил, на крышке пробирки и поместите ее в соответствующее место хранения рабочего раствора.
2. Процедура амплификации ПЦР
   1. Для каждой реакции добавьте 5 мкл мастер-смеси ферментов ПЦР-амплификации, 1 мкл рабочего раствора праймера и 1 мкл матрицы ДНК (количество ввода матрицы должно достигать 400 нг, если концентрация ДНК недостаточна; увеличьте объем ДНК и уменьшите объем добавленного ddH₂O) и 3 μл ddH₂O. Vortex смешайте и мгновенно раскрутите.
   2. Поместите реакционную пробирку ПЦР на предварительно установленный инструмент для ПЦР для амплификации ПЦР. Установите программу теплового цикла ПЦР-прибора следующим образом и выполните:
      95 °C в течение 3 мин; 20 циклов по 95 °C в течение 30 с, 68 °C в течение 15 с (снижение на 0,5 °C за цикл), 72 °C в течение 1 мин; 16 циклов при температуре 95 °C в течение 30 с, 58 °C в течение 15 с, 72 °C в течение 1 мин; и 72 °C в течение 10 мин.
3. Проведите гель-электрофорез на продукте ПЦР с 2% агарозой, чтобы проверить, амплифицируется ли фрагмент мишени.
4. Очистка продуктов ПЦР
   1. Доведите purificase I и purificase II до комнатной температуры и мгновенно открутите. Реакцию очистки продукта ПЦР готовят следующим образом: 1 мкл пурификазы I, 0,5 мкл пурификазы II, 3 мкл продукта ПЦР и 3,5 мкл ddH₂O.
   2. Поместите реакционную пробирку ПЦР на предварительно установленный инструмент для ПЦР для амплификации ПЦР. Установите программу термоцикла прибора ПЦР следующим образом и запустите машину:
      37 °C в течение 30 мин, 95 °C в течение 15 мин.

4. Секвенирование продуктов ПЦР после очистки

1. Секвенирование
   1. Доведите мастер-смесь фермента секвенирования амплификации, буфер и ddH₂O до комнатной температуры. После того как реагент разжижается, мгновенно отвращается.
   2. Реакционную систему секвенирования готовят следующим образом: 1,8 мкл буфера для секвенирования, 0,4 мкл мастер-смеси фермента амплификации секвенирования, 1 л праймера для секвенирования, 0,8 мкл очищенного продукта ПЦР и 6 мкл ddH₂O.
   3. Поместите реакционную пробирку ПЦР на предварительно установленный инструмент для ПЦР для амплификации ПЦР. Установите программу теплового цикла ПЦР-прибора следующим образом и работайте: 96 °C в течение 3 мин; 28 циклов при 96 °C в течение 25 с, 56 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 4 мин.
   4. После завершения реакции секвенирования извлеките продукт из инструмента для ПЦР. Храните продукты реакции в холодильнике, защищенном от света месте.
2. Очистка продуктов секвенирования
   1. Тщательно закрутите магнитные шарики. Добавьте 10 μL магнитных шариков и 40 μL 80% спирта в 96-луночный планшет и запечатайте планшет пленкой.
   2. Поместите 96-луночную пластину с магнитными шариками и спиртом на вихревой шейкер на 10 секунд для полного взвешивания и перемешайте магнитные шарики (наблюдая за тем, есть ли на дне выпадение магнитных шариков, и будьте осторожны, чтобы жидкость не попала на герметизирующую пленку). Наденьте его на горизонтальный осциллятор и завяжите резинкой, чтобы он вибрировал в течение 3-5 мин (максимальная передача).
   3. После колебаний положите ПЦР-планшет на магнитную подставку, обратите внимание на ее плотное прижатие. Держите стенд при температуре 4 °C для статической адсорбции в течение 3 минут, а после того, как магнитные шарики все адсорбируются на стене, снимите герметизирующую пленку и слейте отработанную жидкость.
   4. Добавьте в ПЦР-планшет 40 μл 80% спирта, промойте шарики и слейте отработанную жидкость. Положите пластину на впитывающую бумагу и аккуратно похлопайте по ней (не позволяйте ПЦР-пластине отделяться от диска). Повторите 1 раз.
   5. Положите впитывающую бумагу вверх дном вместе с магнитной пластиной в центрифугу при давлении 120 x g для быстрого отжима.
   6. Поместите ПЦР-планшет с магнитными шариками после удаления спирта в духовку при температуре 60 °C на 3-5 минут. Высушите бусины полностью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если духовки нет, поставьте тарелку при комнатной температуре на 10 минут.
   7. Добавьте 40 μL чистой воды после сушки. Поместите герметизирующую пленку на тарелку и встряхните ее на вихревом шейкере в течение 3-5 секунд. Поставьте тарелку на горизонтальный шейкер, плотно завяжите его и встряхивайте в течение 3-5 минут, чтобы очищенный продукт секвенирования растворился.
   8. Вращайте растворенный продукт секвенирования при 180 x g и используйте продукт для геномного анализа с помощью капиллярного электрофореза²¹ (обратите внимание, что поддерживающий диск должен быть добавлен к плате для образца).
3. Анализ результатов секвенирования
   1. Получите результаты секвенирования из программного обеспечения. Обратитесь к руководству по программному обеспечению для получения подробных инструкций по эксплуатации. Используйте опорную последовательность из NCBI.

Результаты

Сравните последовательность тестового образца с эталонной последовательностью, чтобы получить статус мутации тестового образца. Технология WBT-PCR на основе BDA позволяет обнаруживать известную мутацию RHOA G17V и другие низкочастотные мутации в интервале амплификации пр?...

Обсуждение

WTB-ПЦР на основе технологии BDA, описанной в этой статье, вводит несовпадающий праймер, комплементарный мутантному типу при разработке обычных праймеров, чтобы конкурировать с диким типом, подавлять дикий тип и амплифицировать мутантный продукт. Затем продукты WTB-PCR был...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen