Wildtyp-Blocking-PCR in Kombination mit Sanger-Sequenzierung zum Nachweis niederfrequenter somatischer Mutationen

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird die Anwendung einer niederfrequenten Nachweismethode vorgestellt, die auf der Sanger-Sequenzierung beim angioimmunoblastischen Lymphom basiert. Schaffen Sie eine Grundlage für die Anwendung dieser Methode auf andere Krankheiten.

Zusammenfassung

Bei der Überwachung der minimalen Resterkrankung (MRD) nach Tumorbehandlung bestehen höhere Anforderungen an die untere Nachweisgrenze als bei der Erkennung von Arzneimittelresistenzmutationen und zirkulierenden Tumorzellmutationen während der Therapie. Die traditionelle Sanger-Sequenzierung weist einen Wildtyp-Mutationsnachweis von 5 % bis 20 % auf, so dass die Nachweisgrenze die entsprechenden Anforderungen nicht erfüllen kann. Zu den Wildtyp-Blockierungstechnologien, von denen berichtet wurde, dass sie dieses Problem überwinden, gehören die Blocker-Verdrängungsamplifikation (BDA), die nicht erweiterbare gesperrte Nukleinsäure (LNA), Hot-Spot-spezifische Sonden (HSSP) usw. Diese Technologien verwenden spezifische Oligonukleotidsequenzen, um Wildtyp-Amplifikationen zu blockieren oder zu erkennen, und kombinieren dies dann mit anderen Methoden, um die Wildtyp-Amplifikation zu verhindern und die Mutantenamplifikation zu verstärken, was zu Eigenschaften wie hoher Empfindlichkeit, Flexibilität und Bequemlichkeit führt. Dieses Protokoll verwendet BDA, eine Wildtyp-Blocking-PCR in Kombination mit Sanger-Sequenzierung, um den Nachweis von niederfrequenten somatischen RHOA G17V-Mutationen zu optimieren, und die Nachweisempfindlichkeit kann 0,5 % erreichen, was eine Grundlage für die MRD-Überwachung des angioimmunoblastischen T-Zell-Lymphoms bilden kann.

Einleitung

Unter der minimalen Resterkrankung (MRD) versteht man die geringe Anzahl von Krebszellen, die nach der Behandlung noch im Körper vorhanden sind. Aufgrund ihrer geringen Anzahl führen sie zu keinen körperlichen Anzeichen oder Symptomen. Sie werden mit herkömmlichen Methoden, wie z. B. der mikroskopischen Visualisierung und/oder der Verfolgung abnormaler Serumproteine im Blut, oft nicht entdeckt. Ein positives MRD-Testergebnis weist auf das Vorhandensein von erkrankten Restzellen hin. Ein negatives Ergebnis bedeutet, dass verbleibende kranke Zellen nicht vorhanden sind. Nach der Krebsbehandlung können die verbleibe....

Protokoll

Diese Studie wurde von der medizinischen Ethikkommission des Zentralkrankenhauses von Yongzhou genehmigt (Zulassungsnummer: 2024022601). Die Teilnehmer gaben eine Einverständniserklärung.

1. Design der Grundierung

1. Konventionelles Primerdesign: Primer nach den berichteten Primer Design Rules²⁰ auslegen, Primerdesign durch NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome). Für die Mutationsstelle von RHOA G17V sind alle Referenzsequenzen für das Design konventioneller Primer die mutierte Basensequenz. Stellen Sie....

Diskussion

Die in diesem Artikel beschriebene WTB-PCR auf Basis der BDA-Technologie führt bei der Entwicklung herkömmlicher Primer einen nicht passenden Primer ein, der den Mutantentyp komplementär zum Mutantentyp darstellt, um mit dem Wildtyp zu konkurrieren, den Wildtyp zu unterdrücken und das mutierte Produkt zu amplifizieren. Anschließend wurden die WTB-PCR-Produkte für die Mutationsanalyse sequenziert. Der Nutzen von WTB-PCR/Sanger liegt in seiner Einfachheit und hohen Empfindlichkeit. G.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen