低頻度体細胞突然変異の検出のためのサンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCR

要約

この記事では、血管免疫芽球性リンパ腫におけるサンガーシーケンシングに基づく低周波検出法の応用について紹介します。この方法を他の病気に適用するための基礎を提供します。

要約

腫瘍治療後の微小残存病変(MRD)をモニタリングする場合、治療中の薬剤耐性変異や循環腫瘍細胞変異を検出する場合よりも、検出下限の要件が高くなります。従来のサンガーシーケンシングは、5%〜20%の野生型変異検出を備えているため、その検出限界は対応する要件を満たすことができません。これを克服するために報告されている野生型ブロッキング技術には、ブロッカー変位増幅(BDA)、拡張不可能なロック核酸(LNA)、ホットスポット特異的プローブ(HSSP)などがあります。これらの技術は、特定のオリゴヌクレオチド配列を用いて野生型をブロックしたり、野生型を認識したりした後、他の方法と組み合わせることで野生型増幅を防止し、変異体増幅を増幅することで、高感度、柔軟性、利便性などの特性を生かしています。このプロトコルは、RHOA G17V低周波体細胞変異の検出を最適化するために、サンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロッキングPCRであるBDAを使用し、検出感度は0.5%に達することができ、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫のMRDモニタリングの基礎を提供できます。

概要

微小残存病変(MRD)は、治療後も体内にまだ存在する少数のがん細胞です。数が少ないため、身体的な兆候や症状を引き起こすことはありません。それらは、顕微鏡による可視化や血液中の異常な血清タンパク質の追跡など、従来の方法では検出されないことがよくあります。MRD陽性の検査結果は、残存した疾患細胞の存在を示します。陰性の結果は、残存した疾患細胞が存在しないことを意味します。がん治療後、体内に残っているがん細胞が活性化して増殖し始め、病気が再発する可能性があります。MRDの検出は、治療が完全に効果的ではなかったか、治療が不完全であったことを示しています。治療後にMRD陽性の結果が出るもう一つの理由は、すべてのがん細胞が治療に反応しなかったこと、またはがん細胞が使用した薬剤に耐性を持つようになったためである可能性があります¹。

血管免疫芽球性T細胞リンパ腫(AITL)は、T濾胞性ヘルパー細胞²に由来する末梢性T細胞リンパ腫(PTCL)のサブタイプです。これは最も一般的なタイプのT細胞リンパ腫であり、PTCL^の約15%〜20%を占めています3。これは、リンパ系に影響を与える関連する悪性腫瘍のグループです。起源の細胞は濾胞性Tヘルパー細胞です。2016年のWHO分類では、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫⁴に分類されています。2022年、WHOは、この病院をNodal T-follicular helper cell lymphoma, angioimmunoblastic-type (nTFHL-AI)と改名し、Nodal T-follicular helper cell lymphoma, follicular-type (nTFHL-F)およびNodal T-follicular helper cell lymphoma, not otherwise specified(nTFHL-NOS)と改名し、結節性濾胞性ヘルパーT細胞リンパ腫(nTFHL)と総称しました。これは、その重要な臨床的および免疫表現型の特徴、および類似のT濾胞性ヘルパー(TFH)遺伝子発現シグネチャーおよび変異体を同定するために行われました。遺伝的には、nTFHL-AIは、TET2およびDNMT3A変異を介して初期の造血幹細胞における体細胞変異の進行性獲得を特徴とし、一方、RHOAおよびIDH2変異はTFH腫瘍細胞にも存在する⁵。いくつかの研究は、RHOA G17V変異がAITL患者の50%〜80%で発生することを示しています6,7,8,9。RHOA遺伝子によってコードされるRHOAタンパク質は、グアノシン三リン酸(GTP)結合によって活性化され、グアノシン二リン酸(GDP)結合によって不活性化されます。活性化されると、さまざまなエフェクタータンパク質に結合し、さまざまな生物学的プロセスを調節できます。生理学的には、RHOAはT細胞の遊走と極性を媒介し、胸腺細胞の発生に関与し、プレT細胞受容体(pre-TCR)シグナル伝達の活性化を媒介します¹⁰。RHOA G17V変異は、リンパ腫の病因¹¹において推進的な役割を果たす機能喪失型変異である。その低周波変異の検出は、AITLのMRDモニタリングに役立ちます。

サンガーシーケンシングは、既知および未知の変異を検出するためのゴールドスタンダードとして40年以上にわたって使用されてきました。しかし、その検出限界はわずか5%〜20%であり、低頻度の突然変異検出^12,13への適用が制限される。サンガーシーケンシングでは、従来のPCRを野生ブロッキング技術であるBDAに置き換えることにより、検出感度を0.1%に低下させることができます¹⁴。BDA技術は、変異型を増幅するという目的を達成するために、野生型と競合するように従来のプライマーを設計する際に、主に変異型に相補的なミスマッチプライマーを添加する。プライマー設計の鍵となるのは、ミスマッチプライマーと末端修飾です。同時に、DNAの構造原理によれば、2つのプライマーのギブス自由エネルギーの差は0.8 kcal / molと5 kcal / molの間です。この技術におけるもう一つの重要なステップは、野生型とブロッキングプライマーの比率を調整することによって野生型増幅を抑制することである^14,15。

現在、一般的な低頻度体細胞突然変異検出技術には、PCRベースの対立遺伝子特異的PCR(対立遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応、ASPCR)、増幅難治性突然変異システムPCR(増幅難治性突然変異システム-PCR、ARMS-PCR)が含まれます。変異体および正常対立遺伝子のプライマーを設計することにより、選択的増幅およびデジタルPCR(Droplet Digital PCR、ddPCR)、水-油エマルジョン液滴技術に基づくデジタルPCRの実施方法¹⁶が可能になる。サンプルを20,000個の液滴に分画し、各液滴について、テンプレート分子のPCR増幅を1 x ^10-5の感度で行います。ブロッカー変位増幅(BDA)は、高度にマルチプレックス化された環境でSNVおよびインデルを0.01%VAFまで正確に検出および定量するために使用されるPCRベースの希少対立遺伝子濃縮法でもあります。ロック核酸技術(非拡張型ロック核酸、LNA)は、リボース環がWatson-Crick結合の理想的なコンフォメーションにロックされている高親和性RNAアナログの一種です。ホットスポット特異的プローブ(Hot-Spot-Specific Probe、HSSP)は、標的プライマー配列とオーバーラップし、単一の変異を含み、qPCR 14,16,17,18による増幅を防ぐために、C3'末端にC3スペーサーで修飾されています。配列に変異が存在する場合、HSSPは標的変異に競合的に結合し、プライマーが標的変異体配列に結合するのを防ぎ、配列増幅を停止します。NGS(次世代シーケンシング)ベースの免疫グロブリンハイスループットシーケンシング(igHTS)ディープシーケンシングによるがん個別プロファイリング(CAAP-seq)は、がん細胞の循環DNAを定量するために使用される次世代シーケンシングベースの方法です(感度は1 x ^10-4です)。等。その中で、ほとんどの方法はPCRに基づいており、少数の突然変異部位しか検出できず、NGSベースの方法は複数の部位を検出できますが、コストが高く、プロセスは複雑です14,16,17,18。qPCRに基づくRHOA G17V低周波変異の検出に関する報告がありますが、検出限界は約2%¹⁹にしか達できません。サンガーシーケンシングに基づくRHOA G17V低周波変異の検出に関する報告はありません。ここでは、RHOA G17V低頻度体細胞変異の検出を最適化するために、サンガーシーケンシングと組み合わせた野生型ブロックPCRであるBDAによって達成される感度の向上を示し、検出感度は0.5%に達することができます。IDH2 と JAK1 の追加データも提供されます。

この記事では、サンガーシーケンシングによるRHOAG17V低周波検出スキームの詳細なプロトコルを提供し、サンガーシーケンシングプラットフォームに基づくより低周波変異検出の開発のためのリファレンスを提供します。この方法は、腫瘍内の薬剤耐性変異の可能性と最小限の残留物を検出し、モニタリングするために使用できます。

プロトコル

本研究は、永州中央病院の医療倫理審査委員会(承認番号:2024022601)によって承認されました。参加者はインフォームドコンセントを提供しました。

1.プライマーデザイン

1. 従来のプライマー設計:報告されたプライマー設計規則²⁰に従ってプライマーを設計し、NCBI Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)によるプライマー設計。RHOA G17Vの変異部位については、従来のプライマーの設計のためのすべての参照配列が変異塩基配列です。設計された逆増幅プライマーに変異部位配列が含まれており、プライマーのアニーリング温度が約60°Cであることを確認してください。
2. BDAプライマーデザイン
   1. 約20-30塩基対(bp)の長さで野生ブロッキングプライマーを設計し、2-4の修飾塩基を含み、AとT.ブロッキングプライマーが突然変異増幅プライマーと重なる6-14bpを有することを確認します。
   2. 最終的に設計された変異体増幅プライマーと野生ブロッキングプライマーのアニーリング温度を約60°Cに設定し、ギブス自由エネルギーの差を0.8〜5 kcal/molに設定してプライマーを設計します。詳細な計算ルールについては、文献¹⁵を参照してください。
      注:設計されたプライマーが上記の条件を満たさない場合は、塩基を手動で追加または減算して調整することができます。最終的にデザインされたプライマーリストを 表1 と 表2に示します。

2. サンプル調製とDNA抽出

注:実験的検証サンプルはすべて、ヒトリンパ腫患者の末梢血、骨髄、または固形腫瘍サンプルから供給されています。陽性検体は10例で、うち3例は固形腫瘍検体、4検体は骨髄検体、3検体は末梢血検体でした。健康な人から30の陰性サンプルがあります。

1. 骨髄および末梢血サンプルの抽出
   1. 要件に応じて400μLの骨髄または末梢血サンプルと試薬を対応するチューブに加え、メーカーの抽出手順に従って抽出します。
   2. 新しいサンプルチューブと1.5mLの微量遠心チューブを準備します。サンプルチューブに1〜24の番号を付けます。1.5 mLチューブカバーに、対応する採血チューブの名前の順にサンプル名と抽出日をマークします。微量遠心チューブの側面に1-24のマークを付けて、1対1の対応確認ができます。
   3. 40 μL のプロテイナーゼ K 溶液をサンプルチューブに加え、400 μL の全血サンプルを加えます (容量が 400 μL 未満の場合は、PBS を 400 μL まで充填します)。
   4. 置くampファイルチューブ(1-24)、ピペットチップ(ピペットカバーを含む)、および収集チューブを対応する位置に。製造元の指示に従ってDNAを抽出します。
2. ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプルの抽出
   1. 要件に応じてサンプルと試薬を対応するチューブに入れ、メーカーの抽出手順に従って抽出します。
   2. プロテイナーゼK乾燥粉末に1.1mLのプロテイナーゼK保存緩衝液(PK溶液)を加え、ボルテックスでよく混ぜ合わせ、濃度10 mg/mLのプロテイナーゼK溶液を得ます。-20°Cで保存してください。
   3. プロテイナーゼK溶液を取り出し、室温で完全に溶かします。ドライサーモスタットを作動させ、温度を55°Cに設定します。
   4. 1.5mLの微量遠心チューブを用意し、サンプル名を記入します。30 mg未満の組織を取り、マイクロ遠心チューブに入れます。.次に、500 μLのDeparaffin Bufferと20 μLのプロテイナーゼK溶液をチューブに加えます。
   5. 少なくとも10秒間ボルテックス混合した後、マイクロ遠心チューブを乾燥サーモスタットに入れ、55°Cで90分間保温します。
   6. スピンカラムがフィルターチューブに収まっていることを確認してください。インキュベーションが完了したら、液体や組織などのサンプルをスピンカラムに移します。16,500 x g で5分間遠心分離し、すべての液体をフィルターチューブに遠心分離します。
   7. キットに付属のサンプルチューブ(キャップなし)を1本取り、サンプル名を記入してください。400 μLのフィルターチューブからサンプルチューブに液体を移します。
   8. サンプルの前処理と調製が完了したら、対応する消耗品と試薬を対応する位置に置き、製造元の指示に従ってDNA抽出を行います。
3. DNA品質管理
   1. 抽出したDNAの濃度と純度を測定し、DNA濃度が≥25 ng/μLであることを確認します。各サンプルのDNA濃度を記録し、すぐにその後の検出に使用するか、-20°Cで凍結します。
      注:OD260/OD280値は、通常、DNAサンプルの純度を試験するために使用されます。通常のOD260 / OD280値は約1.7〜1.9であり、DNAの純度が良好であることを示しています。OD260/OD280の値が≤1.7の場合、タンパク質汚染がある可能性があることを示しています。OD260/OD280の値が≥2.0の場合は、RNAの汚染またはDNAの劣化の可能性があります。

3. PCR増幅

1. プライマーの調製
   1. プライマーストック溶液の調製
      1. プライマー乾燥粉末を取り出し、5400-8400 x g で2〜3分間遠心分離します。プライマーのnmol値を確認し、ゆっくりと蓋を開けます。nM値の10倍である対応する容量の二重蒸留水(ddH₂O)のピペットを使用して、プライマーチューブの壁に沿ってゆっくりと追加します。
      2. 0.1 nM/μLまたは100 μMのストック溶液(例:nM値が21.1の場合、添加する水は211 μL)でプライマーを調製します。ボルテックスで十分に混合し、次に短時間遠心分離して、溶液が各ウェルの底に到達することを確認します。チューブキャップにプライマー名、設定データ、設定担当者を記入します。対応するストックソリューションの保管場所に入れます。
   2. プライマー作業溶液の調製
      1. きれいな微量遠心チューブに、フォワードプライマー5 μL、リバースプライマー5 μL、野生型プライマーストック溶液50 μL、ddH₂O40 μLをピペットで入れます。ピペットは2x-3xを繰り返し、ボルテックスで混合し、瞬時にスピンオフします。
      2. プライマーの名前、設定日、およびそれを設定した人をチューブキャップに記入し、作業溶液の対応する保管場所に入れます。
2. PCR増幅手順
   1. 各反応ごとに、5 μL の PCR 増幅酵素マスターミックス、1 μL のプライマーワーキング溶液、および 1 μL の DNA テンプレート (テンプレートのインプット量が 400 ng に達する必要があります。DNA 濃度が十分でない場合は、DNA の量を増やし、添加した ddH₂O の量を減らします)、および 3 μL の ddH₂O を加えます。
   2. PCR増幅のために、PCR反応チューブをプリセットPCR装置に置きます。PCR装置のサーマルサイクルプログラムを次のように設定し、実行します。
      95°Cで3分間;95 °C で 30 秒、68 °C で 15 秒 (サイクルあたり 0.5 °C 減少)、72 °C で 1 分間の 20 サイクル。95 °C で 30 秒、58 °C で 15 秒、72 °C で 1 分間を 16 サイクル。72°Cで10分間。
3. 2%アガロースを用いたPCR産物でゲル電気泳動を行い、標的フラグメントが増幅されるかどうかを確認します。
4. PCR産物の精製
   1. ピュリフィカーゼIとピュリフィカーゼIIを室温に戻して、すぐにスピンオフします。PCR産物精製反応液は、1 μLの精製酵素I、0.5 μLの精製酵素II、3 μLのPCR産物、および3.5 μLのddH₂Oで調製します。
   2. PCR増幅のために、PCR反応チューブをプリセットPCR装置に置きます。PCR装置のサーマルサイクルプログラムを次のように設定し、マシンを実行します。
      37°Cで30分、95°Cで15分。

4. 精製後のPCR産物のシーケンシング

1. シークエンシング
   1. シーケンシング増幅酵素マスターミックス、バッファー、およびddH₂Oを室温に戻します。試薬が液化した後、すぐにスピンオフします。
   2. シーケンシング反応システムは、1.8 μLのシーケンシングバッファー、0.4 μLのシーケンシング増幅酵素マスターミックス、1 μLのシーケンシングプライマー、0.8 μLの精製PCR産物、および6 μLのddH₂Oを調製します。
   3. PCR増幅のために、PCR反応チューブをプリセットPCR装置に置きます。PCR装置のサーマルサイクルプログラムを次のように設定し、96°Cで3分間実行します。96 °C で 25 秒、56 °C で 15 秒、60 °C で 4 分間を 28 サイクル。
   4. シーケンシング反応が終了したら、製品をPCR装置から取り出します。反応生成物は、光から保護された冷蔵庫に保管してください。
2. シーケンシング産物の精製
   1. 磁気ビーズを徹底的にボルテックスします。10 μLの磁気ビーズと40 μLの80%アルコールを96ウェルプレートに加え、プレートをフィルムで密封します。
   2. 磁気ビーズとアルコールを入れた96ウェルプレートをボルテックスシェーカーに10秒間置き、磁気ビーズを完全に懸濁して混合します(底部に磁気ビーズの沈殿があるかどうかを観察し、シーリングフィルムに液体が付着しないように注意してください)。水平発振器に載せ、輪ゴムで結んで3〜5分間振動させます(最大ギア)。
   3. 振動後、PCRプレートを磁気スタンドに置き、しっかりと押すように注意してください。静電気吸着のためにスタンドを4°Cに3分間保持し、磁気ビーズがすべて壁に吸着された後、シーリングフィルムをはがして廃液を注ぎます。
   4. PCRプレートに80%アルコール40μLを加え、ビーズを洗い流し、廃液を注ぎます。プレートを吸収紙の上に置き、軽くたたいます(PCRプレートをディスクから離さないでください)。1回繰り返します。
   5. 吸収紙を逆さまにして磁気プレートと一緒に遠心分離機に120 x g で入れ、すばやく回転させます。
   6. アルコールを取り出した後、磁気ビーズを含むPCRプレートを60°Cのオーブンに3〜5分間入れます。ビーズを完全に乾かします。
      注意: オーブンがない場合は、プレートを室温で10分間置きます。
   7. 乾燥後、純水40μLを加えます。シーリングフィルムをプレートに置き、ボルテックスシェーカーで3〜5秒間振とうします。プレートを水平シェーカーに置き、しっかりと結び、3〜5分間振とうして精製したシーケンシング生成物を溶解します。
   8. 溶解したシーケンシング産物を180 x g で回転させ、キャピラリー電気泳動²¹ を用いたゲノム解析に使用します(支持ディスクをサンプルボードに追加する必要があることに注意してください)。
3. シーケンシング結果の解析
   1. ソフトウェアからシーケンシング結果を取得します。詳細な操作手順については、ソフトウェアのマニュアルを参照してください。NCBIのリファレンス配列を使用してください。

結果

試験サンプルの配列と参照配列を比較して、試験サンプルの変異状態を取得します。BDAベースのWBT-PCR技術は、アップストリームおよびダウンストリームプライマーの増幅間隔で既知のRHOA G17V変異およびその他の低頻度変異を検出できます。 図 1 を参照してください。さらに、 IDH2 と JAK1の2つの遺伝子も、それぞれ ...

ディスカッション

本稿で紹介するBDA技術に基づくWTB-PCRは、従来のプライマーを設計する際に、変異型に相補的なミスマッチプライマーを導入し、野生型を抑制し、変異体産物を増幅します。その後、WTB-PCR産物の配列決定を行い、変異解析を行いました。WTB-PCR/Sangerの有用性は、そのシンプルさと高感度です。この論文で確立された検出スキームによれば、既存のほとんどのサンガー?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen