Düşük Frekanslı Somatik Mutasyonun Tespiti için Sanger Dizilimi ile Birleştirilmiş Vahşi Tip Bloke Edici PCR

Özet

Bu makale, anjiyoimmünoblastik lenfomada Sanger dizilemesine dayalı düşük frekanslı bir tespit yönteminin uygulamasını tanıtmaktadır. Bu yöntemi diğer hastalıklara uygulamak için bir temel sağlayın.

Özet

Tümör tedavisinden sonra minimal rezidüel hastalığı (MRD) izlerken, tedavi sırasında ilaç direnci mutasyonları ve dolaşımdaki tümör hücresi mutasyonları için tespit edildiğinden daha düşük tespit limiti gereksinimleri vardır. Geleneksel Sanger dizilemesi %5-%20 vahşi tip mutasyon tespitine sahiptir, bu nedenle tespit limiti ilgili gereksinimleri karşılayamaz. Bunun üstesinden geldiği bildirilen vahşi tip engelleme teknolojileri arasında engelleyici yer değiştirme amplifikasyonu (BDA), uzatılamayan kilitli nükleik asit (LNA), sıcak noktaya özgü problar (HSSP) vb. bulunur. Bu teknolojiler, vahşi türü bloke etmek veya vahşi türü tanımak için belirli oligonükleotid dizileri kullanır ve daha sonra bunu, vahşi tip amplifikasyonu önlemek ve mutant amplifikasyonu yükseltmek için diğer yöntemlerle birleştirerek yüksek hassasiyet, esneklik ve rahatlık gibi özelliklere yol açar. Bu protokol, RHOA G17V düşük frekanslı somatik mutasyonların tespitini optimize etmek için Sanger dizilimi ile birleştirilmiş vahşi tip bir bloke edici PCR olan BDA'yı kullanır ve tespit duyarlılığı %0,5'e ulaşabilir, bu da anjiyoimmünoblastik T hücreli lenfomanın MRD izlemesi için bir temel sağlayabilir.

Giriş

Minimal rezidüel hastalık (MRD), tedaviden sonra vücutta hala mevcut olan az sayıda kanser hücresidir. Sayılarının az olması nedeniyle herhangi bir fiziksel belirti veya semptoma yol açmazlar. Genellikle mikroskobik görselleştirme ve/veya kandaki anormal serum proteinlerinin izlenmesi gibi geleneksel yöntemlerle tespit edilmezler. MRD pozitif bir test sonucu, artık hastalıklı hücrelerin varlığını gösterir. Negatif bir sonuç, artık hastalıklı hücrelerin bulunmadığı anlamına gelir. Kanser tedavisi sonrası, vücutta kalan kanser hücreleri aktif hale gelebilir ve çoğalmaya başlayabilir, bu da hastalığın nüksetmesine n....

Protokol

Bu çalışma, Yongzhou Merkez Hastanesi tıbbi etik inceleme komitesi tarafından onaylanmıştır (onay numarası: 2024022601). Katılımcılar bilgilendirilmiş onam verdiler.

1. Astar tasarımı

1. Konvansiyonel astar tasarımı: Astarları bildirilen astar tasarım kurallarına^20'ye göre tasarlayın, astar tasarımı NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome) ile yapılır. RHOA G17V'nin mutasyon bölgesi için, geleneksel primerlerin tasarımı için tüm referans dizileri mutasyona uğramış baz dizisidir. Tasarlanan ters amplifikas....

Tartışmalar

Bu makalede açıklanan BDA teknolojisine dayalı WTB-PCR, vahşi tiple rekabet etmek, vahşi türü bastırmak ve mutant ürünü çoğaltmak için geleneksel primerler tasarlarken, mutant tipe tamamlayıcı uyumsuz bir primer sunar. Daha sonra, WTB-PCR ürünleri mutasyon analizi için dizilendi. WTB-PCR / Sanger'in faydası basitliği ve yüksek hassasiyetidir. Bu yazıda oluşturulan tespit şemasına göre, mevcut Sanger bazlı tahlillerin çoğu, BDA yoluyla baskılayıcı primerle.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen