PCR bloquante de type sauvage combinée au séquençage de Sanger pour la détection de mutations somatiques à basse fréquence

Résumé

Cet article présente l’application d’une méthode de détection à basse fréquence basée sur le séquençage de Sanger dans le lymphome angio-immunoblastique. Fournir une base pour l’application de cette méthode à d’autres maladies.

Résumé

Lors de la surveillance d’une maladie résiduelle minime (MRM) après un traitement tumoral, les exigences de la limite inférieure de détection sont plus élevées que lors de la détection de mutations de résistance aux médicaments et de mutations des cellules tumorales circulantes pendant le traitement. Le séquençage de Sanger traditionnel a une détection de mutation de type sauvage de 5 à 20 %, de sorte que sa limite de détection ne peut pas répondre aux exigences correspondantes. Les technologies de blocage de type sauvage qui ont été signalées pour surmonter ce problème comprennent l’amplification par déplacement de bloqueur (BDA), l’acide nucléique verrouillé non extensible (LNA), les sondes spécifiques aux points chauds (HSSP), etc. Ces technologies utilisent des séquences d’oligonucléotides spécifiques pour bloquer le type sauvage ou reconnaître le type sauvage, puis combinent cela avec d’autres méthodes pour empêcher l’amplification de type sauvage et amplifier l’amplification mutante, conduisant à des caractéristiques telles qu’une sensibilité élevée, la flexibilité et la commodité. Ce protocole utilise la BDA, une PCR bloquante de type sauvage combinée au séquençage de Sanger, pour optimiser la détection des mutations somatiques à basse fréquence de RHOA G17V, et la sensibilité de détection peut atteindre 0,5 %, ce qui peut servir de base à la surveillance MRM du lymphome T angio-immunoblastique.

Introduction

La maladie résiduelle minime (MRM) est le petit nombre de cellules cancéreuses qui sont encore présentes dans le corps après le traitement. En raison de leur petit nombre, ils n’entraînent aucun signe ou symptôme physique. Ils passent souvent inaperçus par les méthodes traditionnelles, telles que la visualisation microscopique et/ou le suivi des protéines sériques anormales dans le sang. Un résultat de test MRD positif indique la présence de cellules malades résiduelles. Un résultat négatif signifie qu’il n’y a pas de cellules malades résiduelles. Après le traitement du cancer, les cellules cancéreuses restantes ....

Protocole

Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique médicale de l’hôpital central de Yongzhou (numéro d’approbation : 2024022601). Les participants ont donné leur consentement éclairé.

1. Conception de l’apprêt

1. Conception conventionnelle des amorces : Concevoir les amorces selon les règles de conception des amorces²⁰, conception des amorces par NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome). Pour le site de mutation de RHOA G17V, toutes les séquences de référence pour la conception d’amorces conventionnelles....

Discussion

La WTB-PCR basée sur la technologie BDA, décrite dans cet article, introduit une amorce non appariée complémentaire au type mutant lors de la conception d’amorces conventionnelles pour concurrencer le type sauvage, supprimer le type sauvage et amplifier le produit mutant. Ensuite, les produits WTB-PCR ont été séquencés pour l’analyse des mutations. L’utilité de WTB-PCR/Sanger réside dans sa simplicité et sa grande sensibilité. Selon le schéma de détection établi dans.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen