PCR bloquante de type sauvage combinée au séquençage de Sanger pour la détection de mutations somatiques à basse fréquence

Résumé

Cet article présente l’application d’une méthode de détection à basse fréquence basée sur le séquençage de Sanger dans le lymphome angio-immunoblastique. Fournir une base pour l’application de cette méthode à d’autres maladies.

Résumé

Lors de la surveillance d’une maladie résiduelle minime (MRM) après un traitement tumoral, les exigences de la limite inférieure de détection sont plus élevées que lors de la détection de mutations de résistance aux médicaments et de mutations des cellules tumorales circulantes pendant le traitement. Le séquençage de Sanger traditionnel a une détection de mutation de type sauvage de 5 à 20 %, de sorte que sa limite de détection ne peut pas répondre aux exigences correspondantes. Les technologies de blocage de type sauvage qui ont été signalées pour surmonter ce problème comprennent l’amplification par déplacement de bloqueur (BDA), l’acide nucléique verrouillé non extensible (LNA), les sondes spécifiques aux points chauds (HSSP), etc. Ces technologies utilisent des séquences d’oligonucléotides spécifiques pour bloquer le type sauvage ou reconnaître le type sauvage, puis combinent cela avec d’autres méthodes pour empêcher l’amplification de type sauvage et amplifier l’amplification mutante, conduisant à des caractéristiques telles qu’une sensibilité élevée, la flexibilité et la commodité. Ce protocole utilise la BDA, une PCR bloquante de type sauvage combinée au séquençage de Sanger, pour optimiser la détection des mutations somatiques à basse fréquence de RHOA G17V, et la sensibilité de détection peut atteindre 0,5 %, ce qui peut servir de base à la surveillance MRM du lymphome T angio-immunoblastique.

Introduction

La maladie résiduelle minime (MRM) est le petit nombre de cellules cancéreuses qui sont encore présentes dans le corps après le traitement. En raison de leur petit nombre, ils n’entraînent aucun signe ou symptôme physique. Ils passent souvent inaperçus par les méthodes traditionnelles, telles que la visualisation microscopique et/ou le suivi des protéines sériques anormales dans le sang. Un résultat de test MRD positif indique la présence de cellules malades résiduelles. Un résultat négatif signifie qu’il n’y a pas de cellules malades résiduelles. Après le traitement du cancer, les cellules cancéreuses restantes dans le corps peuvent devenir actives et commencer à se multiplier, provoquant une rechute de la maladie. La détection de la MRM indique que le traitement n’a pas été complètement efficace ou qu’il était incomplet. Une autre raison des résultats positifs à la MRM après le traitement pourrait être que toutes les cellules cancéreuses n’ont pas répondu au traitement ou parce que les cellules cancéreuses sont devenues résistantes aux médicaments utilisés¹.

Le lymphome T angio-immunoblastique (AITL) est un sous-type de lymphome T périphérique (PTCL) dérivé des cellules T auxiliaires folliculaires² ; c’est le type le plus courant de lymphome à cellules T, représentant environ 15 à 20 % du PTCL³. Il s’agit d’un groupe de tumeurs malignes apparentées qui affectent le système lymphatique. La cellule d’origine est la cellule T auxiliaire folliculaire. La classification de l’OMS de 2016 le classe dans la catégorie Lymphome T angio-immunoblastique⁴. En 2022, l’OMS l’a renommé Lymphome ganglionnaire à cellules auxiliaires folliculaires T de type angio-immunoblastique (nTFHL-AI), ainsi que Lymphome ganglionnaire à cellules auxiliaires folliculaires T de type folliculaire (nTFHL-F) et Lymphome ganglionnaire à cellules auxiliaires T, non spécifié ailleurs (nTFHL-NOS), collectivement appelés lymphome T auxiliaire folliculaire nodulaire (nTFHL). Cela a été fait pour identifier ses caractéristiques cliniques et immunophénotypiques importantes ainsi que les signatures et les mutants similaires de l’expression du gène T follicular helper (TFH). Génétiquement, nTFHL-AI est caractérisé par l’acquisition progressive de mutations somatiques dans les cellules souches hématopoïétiques précoces par le biais de mutations TET2 et DNMT3A, tandis que les mutations RHOA et IDH2 sont également présentes dans les cellules tumorales TFH⁵. Plusieurs études ont montré que la mutation RHOA G17V se produit chez 50 à 80 % des patients atteints d’AITL 6,7,8,9. La protéine RHOA codée par le gène RHOA est activée par la liaison à la guanosine triphosphate (GTP) et inactivée par la liaison à la guanosine diphosphate (GDP). Lorsqu’il est activé, il peut se lier à une variété de protéines effectrices et réguler une variété de processus biologiques. Physiologiquement, RHOA médie la migration et la polarité des lymphocytes T, joue un rôle dans le développement des thymocytes et médie l’activation de la signalisation¹⁰ du récepteur pré-T des lymphocytes T (pré-TCR). La mutation RHOA G17V est une mutation de perte de fonction qui joue un rôle moteur dans la pathogenèse du lymphome¹¹. La détection de sa mutation à basse fréquence est utile pour le suivi de la MRM de l’AITL.

Le séquençage de Sanger est utilisé depuis plus de 40 ans comme référence pour la détection de mutations connues et inconnues. Cependant, sa limite de détection n’est que de 5 à 20 %, ce qui limite son application pour la détection des mutations à basse fréquence^12,13. Dans le séquençage de Sanger, la sensibilité de détection peut être réduite à 0,1 % en remplaçant la PCR traditionnelle par la BDA, une technologie de blocage sauvage¹⁴. La technologie BDA ajoute principalement une amorce dépareillée complémentaire au type mutant lors de la conception d’amorces conventionnelles pour concurrencer le type sauvage afin d’atteindre l’objectif d’amplifier le type mutant. La clé de la conception de l’amorce est l’amorce incohérente et la modification du terminal. Dans le même temps, selon le principe structurel de l’ADN, la différence entre l’énergie libre de Gibbs des deux amorces est comprise entre 0,8 kcal/mol et 5 kcal/mol. Une autre étape clé de cette technique consiste à supprimer l’amplification de type sauvage en ajustant le rapport entre les amorces de type sauvage et les amorces bloquantes^14,15.

À l’heure actuelle, les techniques courantes de détection des mutations somatiques à basse fréquence comprennent la PCR basée sur la PCR (réaction en chaîne par polymérase spécifique de l’allèle, ASPCR), la PCR du système de mutation réfractaire à l’amplification (amplification-refractory mutation system-PCR, ARMS-PCR) utilisée pour le génotypage des SNP à l’aide d’amorces réfractaires. La conception d’amorces pour les allèles mutants et normaux permet l’amplification sélective et la PCR numérique (Droplet Digital PCR, ddPCR), une méthode de PCR numérique basée sur la technologie des gouttelettes d’émulsion eau-huile¹⁶. Un échantillon est fractionné en 20 000 gouttelettes, et pour chaque gouttelette, une amplification PCR des molécules matrices est effectuée avec une sensibilité de 1 x ^10-5 ; l’amplification par déplacement de bloqueur (BDA) est également une méthode d’enrichissement d’allèles rares basée sur la PCR utilisée pour la détection et la quantification précises des SNV et des indels jusqu’à 0,01 % VAF dans un environnement hautement multiplexé ; La technologie des acides nucléiques verrouillés (acide nucléique verrouillé non extensible, LNA) est une classe d’analogues d’ARN de haute affinité dans laquelle le cycle ribose est verrouillé dans la conformation idéale pour la liaison Watson-Crick ; Les sondes spécifiques au point chaud (Hot-Spot-Specific Probe, HSSP) chevauchent la séquence d’amorce cible, incluent une seule mutation et sont modifiées avec un espaceur C3 à ^{l’extrémité} C3' pour empêcher l’amplification par qPCR 14,16,17,18. Lorsqu’une mutation dans la séquence existe, le HSSP se fixe de manière compétitive à la mutation cible et empêche l’amorce de se lier à la séquence mutante cible, ce qui arrête l’amplification de la séquence ; Le séquençage personnalisé du cancer par séquençage profond (CAAP-seq) basé sur le séquençage à haut débit (NGS next-generation sequencing) est une méthode basée sur le séquençage de nouvelle génération utilisée pour quantifier l’ADN circulant dans les cellules cancéreuses (sensibilité est de 1 x ^10-4) ; etc. Parmi eux, la plupart des méthodes sont basées sur la PCR et ne peuvent détecter qu’un petit nombre de sites de mutation, et les méthodes basées sur le NGS peuvent détecter plusieurs sites, mais le coût est élevé et le processus est compliqué 14,16,17,18. Des rapports ont fait état de la détection de mutations à basse fréquence de RHOA G17V sur la base de la qPCR, mais la limite de détection ne peut atteindre qu’environ 2 %¹⁹. Il n’existe aucun rapport sur la détection de la mutation basse fréquence RHOA G17V basée sur le séquençage de Sanger. Ici, nous démontrons l’augmentation de sensibilité obtenue par BDA, une PCR par blocs de type sauvage combinée au séquençage de Sanger, pour optimiser la détection des mutations somatiques à basse fréquence RHOA G17V, et la sensibilité de détection peut atteindre 0,5%. Des données supplémentaires pour IDH2 et JAK1 sont également fournies.

Cet article fournit un protocole détaillé du schéma de détection basse fréquence RHOA G17V par séquençage Sanger et fournit une référence pour le développement d’une détection de mutation à basse fréquence basée sur la plateforme de séquençage Sanger. Cette méthode peut être utilisée pour détecter et surveiller d’éventuelles mutations de résistance aux médicaments et des résidus minimaux dans les tumeurs.

Protocole

Cette étude a été approuvée par le comité d’éthique médicale de l’hôpital central de Yongzhou (numéro d’approbation : 2024022601). Les participants ont donné leur consentement éclairé.

1. Conception de l’apprêt

1. Conception conventionnelle des amorces : Concevoir les amorces selon les règles de conception des amorces²⁰, conception des amorces par NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome). Pour le site de mutation de RHOA G17V, toutes les séquences de référence pour la conception d’amorces conventionnelles sont la séquence de base mutée. Assurez-vous que les amorces d’amplification inverse conçues contiennent la séquence du site de mutation et que la température de recuit des amorces est d’environ 60 °C.
2. Conception d’amorce BDA
   1. Concevez l’amorce bloquante sauvage d’une longueur d’environ 20 à 30 paires de bases (pb), contenant 2 à 4 bases modifiées, et les bases modifiées composées de A et T. Assurez-vous que l’amorce bloquante a 6 à 14 pb chevauchant l’amorce d’amplification de mutation, utilisée pour concurrencer l’amorce d’amplification de mutation.
   2. Concevez l’amorce avec une température de recuit pour les amorces d’amplification mutante finales et les amorces bloquantes sauvages réglées à environ 60 °C, et la différence d’énergie libre de Gibbs entre 0,8 et 5 kcal/mol. Pour les règles de calcul détaillées, reportez-vous à la littérature¹⁵.
      REMARQUE : Lorsque les apprêts conçus ne répondent pas aux conditions ci-dessus, les bases peuvent être ajoutées ou soustraites manuellement pour l’ajustement. La liste finale des amorces est présentée dans les tableaux 1 et 2.

2. Préparation de l’échantillon et extraction de l’ADN

REMARQUE : Les échantillons de vérification expérimentale proviennent tous d’échantillons de sang périphérique, de moelle osseuse ou de tumeurs solides de patients atteints de lymphome humain. Il y avait 10 échantillons positifs : 3 étaient des échantillons de tumeurs solides, 4 étaient des échantillons de moelle osseuse et 3 étaient des échantillons de sang périphérique. Il y a 30 échantillons négatifs provenant de personnes en bonne santé.

1. Prélèvement d’échantillons de moelle osseuse et de sang périphérique
   1. Ajouter 400 μL d’échantillon de moelle osseuse ou de sang périphérique et de réactifs dans les tubes correspondants selon les exigences et extraire selon la procédure d’extraction du fabricant.
   2. Préparez de nouveaux tubes d’échantillon et des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml. Numérotez les tubes d’échantillon de 1 à 24. Marquez le nom de l’échantillon et la date d’extraction sur les couvercles des tubes de 1,5 mL dans l’ordre des noms sur les tubes de prélèvement sanguin correspondants. Marquez 1-24 sur le côté du tube de la microcentrifugeuse pour le contrôle individuel de la correspondance.
   3. Ajouter 40 μL de solution de protéinase K dans le tube d’échantillon et ajouter 400 μL d’échantillon de sang total (pour les volumes inférieurs à 400 μL, remplir à 400 μL avec du PBS).
   4. Placez le tube d’échantillon (1-24), l’embout de la pipette (y compris le couvercle de la pipette) et le tube de prélèvement dans les positions correspondantes. Extrayez l’ADN selon la procédure du fabricant.
2. Extraction d’échantillons de formol fixé et noyé en paraffine (FFPE)
   1. Placez les échantillons et les réactifs dans les tubes correspondants selon les exigences et extrayez selon la procédure d’extraction du fabricant.
   2. Ajouter 1,1 mL de tampon de stockage de protéinase K (solution PK) à la poudre sèche de protéinase K, vortex, et bien mélanger pour obtenir une solution de protéinase K avec une concentration de 10 mg/mL. Conserver à -20 °C.
   3. Sortez la solution de protéinase K et faites-la fondre complètement à température ambiante. Faites fonctionner le thermostat sec et réglez la température à 55 °C.
   4. Prenez un tube de microcentrifugation de 1,5 ml et inscrivez-y le nom de l’échantillon. Prenez moins de 30 mg de tissu et mettez-le dans le tube de la microcentrifugeuse. Ensuite, ajoutez 500 μL de tampon de déparaffine et 20 μL de solution de protéinase K dans le tube.
   5. Après avoir mélangé au vortex pendant au moins 10 s, placez le tube de microcentrifugation dans un thermostat sec et maintenez-le au chaud à 55 °C pendant 90 min.
   6. Assurez-vous que la colonne d’essorage s’insère dans le tube filtrant. Une fois l’incubation terminée, transférez l’échantillon, y compris le liquide et les tissus, dans la colonne de centrifugation. Centrifugeuse à 16 500 x g pendant 5 min pour centrifuger tout le liquide dans le tube filtrant.
   7. Prenez 1 tube d’échantillon (sans bouchon) inclus avec le kit et écrivez le nom de l’échantillon dessus. Transférez le liquide du tube filtrant de 400 μL dans le tube d’échantillon.
   8. Une fois le prétraitement et la préparation de l’échantillon terminés, placez les consommables et réactifs correspondants dans les positions correspondantes et effectuez l’extraction de l’ADN conformément aux instructions du fabricant.
3. Contrôle de la qualité de l’ADN
   1. Mesurez la concentration et la pureté de l’ADN extrait et assurez-vous que la concentration d’ADN est ≥ 25 ng/μL. Notez la concentration d’ADN de chaque échantillon et utilisez-la immédiatement pour une détection ultérieure ou congelez-la à -20 °C.
      REMARQUE : Les valeurs OD260/OD280 sont généralement utilisées pour tester la pureté des échantillons d’ADN. La valeur normale OD260/OD280 est d’environ 1,7-1,9, ce qui indique que la pureté de l’ADN est bonne ; si la valeur OD260/OD280 est ≤1,7, cela indique qu’il peut y avoir contamination par les protéines ; si la valeur OD260/OD280 est ≥2,0, cela indique qu’il peut y avoir une contamination par l’ARN ou que l’ADN a été dégradé.

3. Amplification par PCR

1. Préparation des apprêts
   1. Préparation de la solution mère d’apprêt
      1. Sortez la poudre sèche d’apprêt et centrifugez-la à 5400-8400 x g pendant 2-3 min. Vérifiez la valeur nmol de l’amorce et ouvrez lentement le couvercle. À l’aide d’une pipette avec le volume correspondant d’eau distillée Double (ddH₂O), qui est 10x de la valeur nM, ajoutez-la lentement le long de la paroi du tube d’amorce.
      2. Préparez les amorces à une solution mère de 0,1 nM/μL ou 100 μM (par exemple, la valeur nM est de 21,1 ; en conséquence, l’eau à ajouter est de 211 μL). Mélangez soigneusement au vortex, puis centrifugez brièvement pour vous assurer que la solution atteint le fond de chaque puits. Écrivez le nom de l’amorce, les données de configuration et la personne chargée de la configuration sur le capuchon du tube. Placez-le dans l’emplacement de stockage de la solution mère correspondant.
   2. Préparation de la solution de travail de l’apprêt
      1. Pipeter 5 μL d’amorce directe, 5 μL d’amorce inverse, 50 μL de solution mère d’amorce de type sauvage et 40 μL de ddH₂O dans un tube de microcentrifugation propre. Pipette à plusieurs reprises 2x-3x, vortex pour mélanger, et tournez instantanément.
      2. Écrivez le nom de l’amorce, la date de configuration et la personne qui l’a configurée sur le capuchon du tube et placez-le dans l’emplacement de stockage correspondant de la solution de travail.
2. Procédure d’amplification PCR
   1. Pour chaque réaction, ajoutez 5 μL de mélange maître d’enzymes d’amplification PCR, 1 μL de solution d’amorce de travail et 1 μL de matrice d’ADN (la quantité d’entrée de la matrice doit atteindre 400 ng, si la concentration d’ADN n’est pas suffisante ; augmentez le volume d’ADN et réduisez le volume de ddH₂O ajouté) et 3 μL de ddH₂O. Vortex pour mélanger et essorer instantanément.
   2. Placez le tube de réaction PCR sur l’instrument PCR prédéfini pour l’amplification PCR. Réglez le programme de cycle thermique de l’instrument PCR comme suit et exécutez :
      95 °C pendant 3 min ; 20 cycles de 95 °C pendant 30 s, 68 °C pendant 15 s (diminution de 0,5 °C par cycle), 72 °C pendant 1 min ; 16 cycles de 95 °C pendant 30 s, 58 °C pendant 15 s, 72 °C pendant 1 min ; et 72 °C pendant 10 min.
3. Effectuez une électrophorèse sur gel sur le produit PCR avec de l’agarose à 2 % pour vérifier si le fragment cible est amplifié.
4. Purification des produits PCR
   1. Amenez purificase I et purificase II à température ambiante et éteignez instantanément. Préparez la réaction de purification du produit PCR comme suit : 1 μL de purificase I, 0,5 μL de purificase II, 3 μL de produit PCR et 3,5 μL de ddH₂O.
   2. Placez le tube de réaction PCR sur l’instrument PCR prédéfini pour l’amplification PCR. Réglez le programme de cycle thermique de l’instrument PCR comme suit et faites fonctionner la machine :
      37 °C pendant 30 min, 95 °C pendant 15 min.

4. Séquençage des produits PCR après purification

1. Séquençage
   1. Amenez le mélange maître d’enzymes d’amplification de séquençage, le tampon et le ddH₂O à température ambiante. Une fois le réactif liquéfié, débranchez-le instantanément.
   2. Préparez le système de réaction de séquençage comme suit : 1,8 μL de tampon de séquençage, 0,4 μL de mélange maître d’enzymes d’amplification de séquençage, 1 μL d’amorce de séquençage, 0,8 μL de produit PCR purifié et 6 μL de ddH₂O.
   3. Placez le tube de réaction PCR sur l’instrument PCR prédéfini pour l’amplification PCR. Réglez le programme de cycle thermique de l’instrument PCR comme suit et exécutez-le : 96 °C pendant 3 min ; 28 cycles de 96 °C pendant 25 s, 56 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 4 min.
   4. Une fois la réaction de séquençage terminée, retirez le produit de l’instrument de PCR. Conservez les produits de réaction au réfrigérateur, à l’abri de la lumière.
2. Purification des produits de séquençage
   1. Vortex les perles magnétiques à fond. Ajoutez 10 μL de billes magnétiques et 40 μL d’alcool à 80 % dans la plaque à 96 puits et scellez la plaque avec un film.
   2. Placez la plaque à 96 puits avec les billes magnétiques et l’alcool sur l’agitateur vortex pendant 10 s pour suspendre complètement et mélanger les billes magnétiques (en observant s’il n’y a pas de précipitation des billes magnétiques au fond et en faisant attention de ne pas mettre le liquide sur le film d’étanchéité). Mettez-le sur un oscillateur horizontal et attachez-le avec un élastique pour qu’il vibre pendant 3 à 5 minutes (vitesse maximale).
   3. Après avoir oscillé, placez la plaque PCR sur le support magnétique, veillez à la presser fermement. Maintenez le support à 4 °C pour l’adsorption statique pendant 3 min, et une fois que les billes magnétiques sont toutes adsorbées sur le mur, retirez le film d’étanchéité et versez le liquide usé.
   4. Ajoutez 40 μL d’alcool à 80 % dans la plaque PCR, rincez les billes et videz les déchets liquides. Placez la plaque sur du papier absorbant et tapotez-la doucement (ne laissez pas la plaque PCR se séparer du disque). Répétez l’opération 1 fois.
   5. Placez le papier absorbant à l’envers avec la plaque magnétique dans la centrifugeuse à 120 x g pour un essorage rapide.
   6. Mettez la plaque PCR contenant les billes magnétiques après avoir retiré l’alcool dans le four à 60 °C pendant 3 à 5 min. Séchez complètement les perles.
      REMARQUE : S’il n’y a pas de four, placez la plaque à température ambiante pendant 10 min.
   7. Ajouter 40 μL d’eau pure après séchage. Placez le film d’étanchéité sur la plaque et secouez-le sur un agitateur vortex pendant 3 à 5 s. Placez la plaque sur un shaker horizontal, attachez-la fermement et secouez-la pendant 3 à 5 minutes pour dissoudre le produit de séquençage purifié.
   8. Faites tourner le produit de séquençage dissous à 180 x g et utilisez le produit pour l’analyse génomique à l’aide de l’électrophorèse capillaire²¹ (notez que le disque de support doit être ajouté à la carte d’échantillonnage).
3. Analyse des résultats de séquençage
   1. Obtenez les résultats du séquençage à partir du logiciel. Reportez-vous au manuel du logiciel pour les procédures d’utilisation détaillées. Utilisez la séquence de référence de NCBI.

Résultats

Comparez la séquence de l’échantillon de test avec la séquence de référence pour obtenir le statut de mutation de l’échantillon de test. La technologie WBT-PCR basée sur BDA peut détecter la mutation connue RHOA G17V et d’autres mutations à basse fréquence dans l’intervalle d’amplification des amorces en amont et en aval. Voir la figure 1. Deux gènes supplémentaires, à savoir IDH2 et JAK1, ont également été analys?...

Discussion

La WTB-PCR basée sur la technologie BDA, décrite dans cet article, introduit une amorce non appariée complémentaire au type mutant lors de la conception d’amorces conventionnelles pour concurrencer le type sauvage, supprimer le type sauvage et amplifier le produit mutant. Ensuite, les produits WTB-PCR ont été séquencés pour l’analyse des mutations. L’utilité de WTB-PCR/Sanger réside dans sa simplicité et sa grande sensibilité. Selon le schéma de détection établi dans...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen