野生型封闭 PCR 联合 Sanger 测序检测低频体细胞突变

摘要

本文介绍了基于 Sanger 测序的低频检测方法在血管免疫母细胞淋巴瘤中的应用。为将此方法应用于其他疾病提供依据。

摘要

在肿瘤治疗后监测微小残留病 （MRD） 时，对检测下限的要求高于治疗期间检测耐药突变和循环肿瘤细胞突变时。传统 Sanger 测序具有 5%-20% 的野生型突变检测，因此其检测限无法满足相应要求。据报道可以克服这一问题的野生型封闭技术包括阻断剂置换扩增 （BDA）、不可扩增的锁核酸 （LNA）、热点特异性探针 （HSSP） 等。这些技术使用特异性寡核苷酸序列来阻断野生型或识别野生型，然后将其与其他方法相结合，以防止野生型扩增并扩增突变体扩增，从而具有高灵敏度、灵活性和便利性等特点。该方案使用野生型阻断 PCR 结合 Sanger 测序的 BDA 优化了 RHOA G17V 低频体细胞突变的检测，检测灵敏度可达 0.5%，可为血管免疫母细胞性 T 细胞淋巴瘤的 MRD 监测提供依据。

引言

微小残留病 （MRD） 是指治疗后体内仍然存在的少量癌细胞。由于数量少，它们不会导致任何身体体征或症状。它们通常无法通过传统方法检测到，例如显微镜观察和/或追踪血液中的异常血清蛋白。MRD 阳性检测结果表明存在残留的病变细胞。阴性结果意味着不存在残留的病细胞。癌症治疗后，体内剩余的癌细胞会变得活跃并开始繁殖，导致疾病复发。检测到 MRD 表明治疗不完全有效或治疗不完整。治疗后 MRD 阳性结果的另一个原因可能是并非所有癌细胞都对治疗有反应，或者因为癌细胞对所使用的药物产生了耐药性¹。

血管免疫母细胞性 T 细胞淋巴瘤 （AITL） 是源自滤泡辅助细胞的外周 T 细胞淋巴瘤 （PTCL） 的一种亚型²;它是最常见的 T 细胞淋巴瘤类型，约占 PTCL³ 的 15%-20%。它是一组影响淋巴系统的相关恶性肿瘤。起源细胞是滤泡性 T 辅助细胞。2016 年 WHO 分类将其归类为血管免疫母细胞性 T 细胞淋巴瘤⁴。2022 年，WHO 将其更名为淋巴结 T 滤泡辅助细胞淋巴瘤，血管免疫母细胞型 （nTFHL-AI），与结节性 T 滤泡辅助细胞淋巴瘤，滤泡型 （nTFHL-F） 和淋巴结 T 滤泡辅助细胞淋巴瘤，未另行说明（nTFHL-NOS），统称为结节性滤泡辅助性 T 细胞淋巴瘤 （nTFHL）。这样做是为了确定其重要的临床和免疫表型特征以及类似的滤泡辅助性 T 细胞 （TFH） 基因表达特征和突变体。从遗传学上讲，nTFHL-AI 的特征是通过 TET2 和 DNMT3A 突变在早期造血干细胞中逐渐获得体细胞突变，而 RHOA 和 IDH2 突变也存在于 TFH 肿瘤细胞中⁵。几项研究表明，RHOA G17V 突变发生在 50%-80% 的 AITL 患者中 6,7,8,9。由 RHOA 基因编码的 RHOA 蛋白被三磷酸鸟苷 （GTP） 结合激活，被鸟苷二磷酸 （GDP） 结合灭活。激活后，它可以与多种效应蛋白结合并调节多种生物过程。在生理学上，RHOA 介导 T 细胞迁移和极性，在胸腺细胞发育中发挥作用，并介导前 T 细胞受体 （pre-TCR） 信号转导的激活¹⁰。RHOA G17V 突变是一种功能丧失突变，在淋巴瘤发病机制中起驱动作用¹¹。检测其低频突变有助于 AITL 的 MRD 监测。

40 多年来，Sanger 测序一直被用作检测已知和未知突变的金标准。然而，其检出限仅为 5%-20%，这限制了其在低频突变检测中的应用^12,13。在 Sanger 测序中，通过用 BDA（一种野生封闭技术）代替传统 PCR，可以将检测灵敏度降低到 0.1%¹⁴。BDA 技术在设计常规引物时主要加入与突变型互补的错配引物，与野生型竞争，从而达到扩增突变型的目的。引物设计的关键是错配引物和末端修饰。同时，根据DNA的结构原理，两种引物的吉布斯自由能之差在0.8 kcal/mol和5 kcal/mol之间。该技术的另一个关键步骤是通过调整野生型和封闭引物的比例来抑制野生型扩增^14,15。

目前，常见的低频体细胞突变检测技术包括基于PCR的等位基因特异性PCR（等位基因特异性聚合酶链反应，ASPCR）、扩增-难治性突变系统PCR（amplification-refractory mutation system-PCR，ARMS-PCR），用于借助难治性引物对SNP进行基因分型。为突变和正常等位基因设计引物允许选择性扩增和数字 PCR（微滴数字 PCR，ddPCR），这是一种基于水油乳液液滴技术进行数字 PCR 的方法¹⁶。将样品分离成 20,000 个液滴，对于每个液滴，以 1 x ^10-5 的灵敏度进行模板分子的 PCR 扩增;阻断剂置换扩增 （BDA） 也是一种基于 PCR 的稀有等位基因富集方法，用于在高度多重环境中准确检测和定量低至 0.01% VAF 的 SNV 和插入缺失;锁定核酸技术（不可延伸的锁定核酸，LNA）是一类高亲和力 RNA 类似物，其中核糖环被锁定在 Watson-Crick 结合的理想构象中;热点特异性探针（热点特异性探针，HSSP）与靶引物序列重叠，包含单个突变，并在 C3^' 末端用 C3 间隔区修饰，以防止 qPCR 扩增 14,16,17,18。当序列中存在突变时，HSSP 竞争性地附着在靶突变上，并阻止引物与靶突变序列结合，从而停止序列扩增;基于 NGS（下一代测序）的免疫球蛋白高通量测序 （igHTS） 通过深度测序进行癌症个性化分析 （CAAP-seq），这是一种基于下一代测序的方法，用于量化癌细胞中的循环 DNA（灵敏度为 1 x ^10-4）;等。其中，大多数方法基于 PCR，只能检测少量突变位点，基于 NGS 的方法可以检测多个位点，但成本高，过程复杂 14,16,17,18。已有基于 qPCR 检测 RHOA G17V 低频突变的报道，但检出限只能达到 2%¹⁹ 左右。尚无基于 Sanger 测序检测 RHOA G17V 低频突变的报道。在这里，我们展示了 BDA（一种野生型块 PCR 结合 Sanger 测序）实现的灵敏度增加，以优化 RHOA G17V 低频体细胞突变的检测，检测灵敏度可达 0.5%。此外，还提供了 IDH2 和 JAK1 的其他数据。

本文提供了 Sanger 测序 RHOA G17V 低频检测方案的详细方案，为基于 Sanger 测序平台开发更多低频突变检测提供参考。该方法可用于检测和监测肿瘤中可能的耐药突变和最小残留。

研究方案

本研究经永州市中心医院医学伦理审查委员会批准（批准文号：2024022601）。参与者提供了知情同意。

1. 引物设计

1. 常规引物设计：根据报道的引物设计规则²⁰ 设计引物，引物设计由 NCBI Primer-BLAST （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome）。对于 RHOA G17V 的突变位点，用于设计常规引物的所有参考序列都是突变的碱基序列。确保设计的反向扩增引物包含突变位点序列，并且引物的退火温度约为 60 °C。
2. BDA 引物设计
   1. 设计长度约为 20-30 个碱基对 （bp） 的野生封闭引物，含有 2-4 个修饰碱基，修饰碱基由 A 和 T 组成。确保封闭引物有 6-14 bp 与突变扩增引物重叠，用于与突变扩增引物竞争。
   2. 设计引物，最终设计的突变扩增引物和野生封闭引物的退火温度设置为约 60 °C，吉布斯自由能的差异在 0.8-5 kcal/mol 之间。详细的计算规则可参考文献¹⁵。
      注意：当设计的引物不满足上述条件时，可以手动添加或减去碱基进行调整。最终设计的引物列表如 表 1 和 表 2 所示。

2. 样品制备和 DNA 提取

注：实验验证样本均来自人淋巴瘤患者的外周血、骨髓或实体瘤样本。阳性标本 10 例： 实体瘤标本 3 例，骨髓标本 4 例，外周血标本 3 例。有 30 个来自健康人的阴性样本。

1. 提取骨髓和外周血样本
   1. 根据要求将 400 μL 骨髓或外周血样品和试剂加入相应的试管中，并根据制造商的提取程序提取。
   2. 准备新的样品管和 1.5 mL 微量离心管。将样品管编号为 1-24。按照相应采血管上的名称顺序，在 1.5 mL 试管盖上标记样品名称和提取日期。在微量离心管侧面标记 1-24，用于一对一的对应检查。
   3. 向样品管中加入 40 μL 蛋白酶 K 溶液，并加入 400 μL 全血样品（体积小于 400 μL，用 PBS 填充至 400 μL）。
   4. 将样品管 （1-24）、移液器吸头（包括移液器盖）和收集管放在相应的位置。根据制造商的程序提取 DNA。
2. 福尔马林固定石蜡包埋 （FFPE） 样品的提取
   1. 根据要求将样品和试剂放入相应的试管中，并按制造商的提取程序提取。
   2. 向蛋白酶 K 干粉中加入 1.1 mL 蛋白酶 K 储存缓冲液（PK 溶液），涡旋混合，得到浓度为 10 mg/mL 的蛋白酶 K 溶液。储存在 -20 °C。
   3. 取出蛋白酶 K 溶液，在室温下完全熔化。运行干燥恒温器并将温度设置为 55 °C。
   4. 取 1.5 mL 微量离心管，并在其上写下样品名称。取少于 30 mg 的组织，放入微量离心管中。然后，向试管中加入 500 μL 脱蜡缓冲液和 20 μL 蛋白酶 K 溶液。
   5. 涡旋混合至少 10 秒后，将微量离心管放入干燥的恒温器中，并在 55 °C 下保温 90 分钟。
   6. 确保离心柱适合过滤管。孵育完成后，将样品（包括液体和组织）转移到离心柱中。以 16,500 x g 离心 5 分钟，以将所有液体离心到过滤管中。
   7. 取试剂盒随附的 1 个样品管（无盖），并在上面写下样品名称。将液体从 400 μL 过滤管转移到样品管中。
   8. 样品前处理和制备完成后，将相应的耗材和试剂放置在相应的位置，并根据制造商的说明进行 DNA 提取。
3. DNA 质量控制
   1. 测量提取的 DNA 的浓度和纯度，确保 DNA 浓度≥ 25 ng/μL。记录每个样品的 DNA 浓度并立即用于后续检测，或在 -20 °C 下冷冻。
      注：OD260/OD280 值通常用于测试 DNA 样品的纯度。正常的 OD260/OD280 值约为 1.7-1.9，表明 DNA 纯度良好;如果 OD260/OD280 值为 ≤1.7，则表明可能存在蛋白质污染;如果 OD260/OD280 值为 ≥2.0，则表明可能存在 RNA 污染或 DNA 已被降解。

3. PCR 扩增

1. 引物的制备
   1. 引物储备液的制备
      1. 取出引物干粉，以 5400-8400 x g 离心 2-3 分钟。检查引物的 nmol 值并慢慢打开盖子。使用移液管蘸有相应体积的双蒸水 （ddH₂O），其为 nM 值的 10 倍，沿引物管壁缓慢加入。
      2. 制备 0.1 nM/μL 或 100 μM 储备液的引物（例如，nM 值为 21.1;相应地，要添加的水为 211 μL）。涡旋充分混合，然后短暂离心以确保溶液到达每个孔的底部。在管帽上写下引物名称、配置数据和配置人员。放入相应的贮存液贮存位置。
   2. 引物工作液的制备
      1. 在干净的微量离心管中移液 5 μL 正向引物、5 μL 反向引物、50 μL 野生型引物储备溶液和 40 μL ddH₂O。重复移液 2 次至 3 次，涡旋混合，并立即旋转。
      2. 在管帽上写下引物名称、配置日期和配置者，并将其放入工作溶液的相应存放位置。
2. PCR 扩增程序
   1. 对于每个反应，加入 5 μL PCR 扩增酶预混液、1 μL 引物工作溶液和 1 μL DNA 模板（如果 DNA 浓度不足，模板起始量需要达到 400 ng;增加 DNA 体积并减少添加的 ddH₂O 的体积）和 3 μL ddH₂O。涡旋以立即混合和离心。
   2. 将 PCR 反应管放在预设的 PCR 仪器上进行 PCR 扩增。按如下方式设置 PCR 仪器的热循环程序并运行：
      95 °C 3 分钟;95 °C 20 次循环 30 秒，68 °C 15 秒（每个循环降低 0.5 °C），72 °C 1 分钟;95 °C 持续 30 秒，58 °C 持续 15 秒，72 °C 持续 1 分钟的 16 个循环;和 72 °C 10 分钟。
3. 对含有 2% 琼脂糖的 PCR 产物进行凝胶电泳，以检查目标片段是否被扩增。
4. PCR 产物的纯化
   1. 将纯化酶 I 和纯化酶 II 置于室温下并立即离心。按如下方式制备 PCR 产物纯化反应：1 μL 纯化酶 I、0.5 μL 纯化酶 II、3 μL PCR 产物和 3.5 μL ddH₂O。
   2. 将 PCR 反应管放在预设的 PCR 仪器上进行 PCR 扩增。按如下方式设置 PCR 仪器的热循环程序并运行机器：
      37 °C 30 分钟，95 °C 15 分钟。

4. 纯化后 PCR 产物的测序

1. 测 序
   1. 将测序扩增酶预混液、缓冲液和 ddH₂O 置于室温。试剂液化后，立即离心。
   2. 按如下方式制备测序反应系统：1.8 μL 测序缓冲液、0.4 μL 测序扩增酶预混液、1 μL 测序引物、0.8 μL 纯化的 PCR 产物和 6 μL ddH₂O。
   3. 将 PCR 反应管放在预设的 PCR 仪器上进行 PCR 扩增。按如下方式设置 PCR 仪器的热循环程序并运行：96 °C 3 分钟;96 °C 持续 25 秒，56 °C 持续 15 秒，60 °C 持续 4 分钟的 28 个循环。
   4. 测序反应完成后，从 PCR 仪器中取出产物。将反应产物存放在冰箱中，避光保存。
2. 测序产物的纯化
   1. 彻底涡旋磁珠。向 96 孔板中加入 10 μL 磁珠和 40 μL 80% 酒精，并用薄膜密封板。
   2. 将装有磁珠和酒精的 96 孔板放在涡旋振荡器上 10 秒，以完全悬浮和混合磁珠（观察底部是否有磁珠沉淀，注意不要让液体沾到密封膜上）。将其放在水平振荡器上，并用橡皮筋系住，使其振动 3-5 分钟（最大档位）。
   3. 振荡后，将 PCR 板放在磁力架上，注意压紧。将支架在 4 °C 下保持静态吸附 3 min，待磁珠全部吸附在壁上后，去除密封膜，倒出废液。
   4. 向 PCR 板中加入 40 μL 80% 酒精，冲洗磁珠，然后倒出废液。将板放在吸水纸上并轻轻拍打（不要让 PCR 板与光盘分离）。重复 1 次。
   5. 将吸收纸与磁板一起以 120 x g 的离心机速度倒置放入离心机中，以便快速旋转。
   6. 将含有磁珠的 PCR 板除去后放入 60 °C 的烘箱中 3-5 分钟。将珠子完全擦干。
      注意：如果没有烤箱，请将板在室温下放置 10 分钟。
   7. 干燥后加入 40 μL 纯水。将密封膜放在板上，并在涡旋振荡器上摇动 3-5 秒。将板放在水平摇床上，系紧，摇晃 3-5 分钟，使纯化的测序产物溶解。
   8. 将溶解的测序产物以 180 x g 离心，并使用毛细管电泳²¹ 将该产品用于基因组分析（请注意，需要将支撑盘添加到样品板中）。
3. 测序结果分析
   1. 从软件获取测序结果。详细操作步骤请参考软件手册。使用 NCBI 中的参考序列。

结果

将测试样本的序列与参考序列进行比较，以获得测试样本的突变状态。基于 BDA 的 WBT-PCR 技术可以检测上下游引物扩增区间中已知的 RHOA G17V 突变和其他低频突变。参见 图 1。使用这种方法还分析了另外两个基因，即 IDH2 和 JAK1，分别如图 2 和 图 3。结果表明，该方法在检测低频突变方面相当...

讨论

本文描述的基于 BDA 技术的 WTB-PCR 在设计常规引物以与野生型竞争、抑制野生型和扩增突变产物时，引入了与突变型互补的错配引物。然后，对 WTB-PCR 产物进行测序以进行突变分析。WTB-PCR/Sanger 的实用性在于其简单性和高灵敏度。根据本文建立的检测方案，大多数现有的基于 Sanger 的检测可以通过 BDA 添加抑制器引物，从而提高检测灵敏度。本文引入的 RHOA G17V 突变?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen