野生型封闭 PCR 联合 Sanger 测序检测低频体细胞突变

摘要

本文介绍了基于 Sanger 测序的低频检测方法在血管免疫母细胞淋巴瘤中的应用。为将此方法应用于其他疾病提供依据。

摘要

在肿瘤治疗后监测微小残留病 （MRD） 时，对检测下限的要求高于治疗期间检测耐药突变和循环肿瘤细胞突变时。传统 Sanger 测序具有 5%-20% 的野生型突变检测，因此其检测限无法满足相应要求。据报道可以克服这一问题的野生型封闭技术包括阻断剂置换扩增 （BDA）、不可扩增的锁核酸 （LNA）、热点特异性探针 （HSSP） 等。这些技术使用特异性寡核苷酸序列来阻断野生型或识别野生型，然后将其与其他方法相结合，以防止野生型扩增并扩增突变体扩增，从而具有高灵敏度、灵活性和便利性等特点。该方案使用野生型阻断 PCR 结合 Sanger 测序的 BDA 优化了 RHOA G17V 低频体细胞突变的检测，检测灵敏度可达 0.5%，可为血管免疫母细胞性 T 细胞淋巴瘤的 MRD 监测提供依据。

引言

微小残留病 （MRD） 是指治疗后体内仍然存在的少量癌细胞。由于数量少，它们不会导致任何身体体征或症状。它们通常无法通过传统方法检测到，例如显微镜观察和/或追踪血液中的异常血清蛋白。MRD 阳性检测结果表明存在残留的病变细胞。阴性结果意味着不存在残留的病细胞。癌症治疗后，体内剩余的癌细胞会变得活跃并开始繁殖，导致疾病复发。检测到 MRD 表明治疗不完全有效或治疗不完整。治疗后 MRD 阳性结果的另一个原因可能是并非所有癌细胞都对治疗有反应，或者因为癌细胞对所使用的药物产生了耐药性¹。

血管免疫母细胞性 T 细胞淋巴瘤 （AITL） 是源自滤泡辅助细胞的外周 T 细胞淋巴瘤 （PTCL） 的一种亚型²;它是最常见的 T 细胞淋巴瘤类型，约占 PTCL³ 的 15%-20%。它是一组影响淋巴系统的相关恶性肿瘤。起源细胞是滤泡性 T 辅助细胞。2016 年 WHO 分类将其归类为血管免疫母细胞性 T 细胞淋巴瘤⁴。2022 年，WHO 将其更名为淋巴结 T 滤泡辅助细胞淋巴瘤，血管免疫母细胞型 （nTFHL-AI），与结节性 T 滤泡辅助细胞淋巴瘤，滤泡型 （nTFHL-F） 和淋巴....

研究方案

本研究经永州市中心医院医学伦理审查委员会批准（批准文号：2024022601）。参与者提供了知情同意。

1. 引物设计

1. 常规引物设计：根据报道的引物设计规则²⁰ 设计引物，引物设计由 NCBI Primer-BLAST （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome）。对于 RHOA G17V 的突变位点，用于设计常规引物的所有参考序列都是突变的碱基序列。确保设计的反向扩增引物包含突变位点序列，并且引物的退火温度约为 60 °C。
2. BDA 引物设计
   1. 设计长度约为 20-30 个碱基对 （bp） 的野生封闭引物，含有 2-4 个修饰碱基，修饰碱基由 A 和 T 组成。确保封闭引物有 6-14 bp 与突变扩增引物重叠，用于与突变扩增引物竞争。
   2. 设计引物，最终设计的突变扩增引物和野生封闭引物的退火温度设置为约 60 °C，吉布斯自由能的差异在 0.8-5 kcal/mol 之间。详细的计算规则可参考文献¹⁵。
      注意：当设计的引物不满足上述条件时，可以手动添加或减去碱基进行调整。最终设计的引物列表如 ....

讨论

本文描述的基于 BDA 技术的 WTB-PCR 在设计常规引物以与野生型竞争、抑制野生型和扩增突变产物时，引入了与突变型互补的错配引物。然后，对 WTB-PCR 产物进行测序以进行突变分析。WTB-PCR/Sanger 的实用性在于其简单性和高灵敏度。根据本文建立的检测方案，大多数现有的基于 Sanger 的检测可以通过 BDA 添加抑制器引物，从而提高检测灵敏度。本文引入的 RHOA G17V 突变?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen