PCR de bloqueo de tipo salvaje combinada con secuenciación Sanger para la detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia

Resumen

En este artículo se presenta la aplicación de un método de detección de baja frecuencia basado en la secuenciación de Sanger en el linfoma angioinmunoblástico. Proporcionar una base para aplicar este método a otras enfermedades.

Resumen

Cuando se monitorea la enfermedad residual mínima (ERM) después del tratamiento tumoral, hay requisitos más altos del límite inferior de detección que cuando se detectan mutaciones de resistencia a los medicamentos y mutaciones de células tumorales circulantes durante el tratamiento. La secuenciación tradicional de Sanger tiene un 5%-20% de detección de mutaciones de tipo salvaje, por lo que su límite de detección no puede cumplir con los requisitos correspondientes. Las tecnologías de bloqueo de tipo salvaje que se ha informado que superan esto incluyen la amplificación de desplazamiento de bloqueadores (BDA), el ácido nucleico bloqueado no extensible (LNA), las sondas específicas de puntos calientes (HSSP), etc. Estas tecnologías utilizan secuencias específicas de oligonucleótidos para bloquear el tipo salvaje o reconocer el tipo salvaje y luego combinarlo con otros métodos para evitar la amplificación del tipo salvaje y amplificar la amplificación de mutantes, lo que da lugar a características como alta sensibilidad, flexibilidad y comodidad. Este protocolo utiliza BDA, una PCR de bloqueo de tipo salvaje combinada con secuenciación de Sanger, para optimizar la detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia RHOA G17V, y la sensibilidad de detección puede alcanzar el 0,5%, lo que puede proporcionar una base para el seguimiento de la ERM del linfoma angioinmunoblástico de células T.

Introducción

La enfermedad residual mínima (ERM) es la pequeña cantidad de células cancerosas que aún están presentes en el cuerpo después del tratamiento. Debido a su pequeño número, no provocan ningún signo o síntoma físico. A menudo pasan desapercibidos por los métodos tradicionales, como la visualización microscópica y/o el seguimiento de proteínas séricas anormales en la sangre. Un resultado positivo de la prueba de ERM indica la presencia de células enfermas residuales. Un resultado negativo significa que las células enfermas residuales están ausentes. Después del tratamiento contra el cáncer, las células cancerosas res....

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el comité de revisión de ética médica del Hospital Central de Yongzhou (número de aprobación: 2024022601). Los participantes dieron su consentimiento informado.

1. Diseño de imprimación

1. Diseño de imprimación convencional: Diseñe los cebadores de acuerdo con las reglas de diseño de cebadores²⁰ informadas, el diseño de cebadores por NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome). Para el sitio de mutación de RHOA G17V, todas las secuencias de referencia para el diseño de cebadores....

Discusión

La WTB-PCR basada en la tecnología BDA, descrita en este artículo, introduce un cebador no coincidente complementario al tipo mutante cuando se diseñan cebadores convencionales para competir con el tipo salvaje, suprimir el tipo salvaje y amplificar el producto mutante. A continuación, se secuenciaron los productos WTB-PCR para el análisis de mutaciones. La utilidad de WTB-PCR/Sanger es su simplicidad y alta sensibilidad. De acuerdo con el esquema de detección establecido en este t.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen