PCR de bloqueo de tipo salvaje combinada con secuenciación Sanger para la detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia

Resumen

En este artículo se presenta la aplicación de un método de detección de baja frecuencia basado en la secuenciación de Sanger en el linfoma angioinmunoblástico. Proporcionar una base para aplicar este método a otras enfermedades.

Resumen

Cuando se monitorea la enfermedad residual mínima (ERM) después del tratamiento tumoral, hay requisitos más altos del límite inferior de detección que cuando se detectan mutaciones de resistencia a los medicamentos y mutaciones de células tumorales circulantes durante el tratamiento. La secuenciación tradicional de Sanger tiene un 5%-20% de detección de mutaciones de tipo salvaje, por lo que su límite de detección no puede cumplir con los requisitos correspondientes. Las tecnologías de bloqueo de tipo salvaje que se ha informado que superan esto incluyen la amplificación de desplazamiento de bloqueadores (BDA), el ácido nucleico bloqueado no extensible (LNA), las sondas específicas de puntos calientes (HSSP), etc. Estas tecnologías utilizan secuencias específicas de oligonucleótidos para bloquear el tipo salvaje o reconocer el tipo salvaje y luego combinarlo con otros métodos para evitar la amplificación del tipo salvaje y amplificar la amplificación de mutantes, lo que da lugar a características como alta sensibilidad, flexibilidad y comodidad. Este protocolo utiliza BDA, una PCR de bloqueo de tipo salvaje combinada con secuenciación de Sanger, para optimizar la detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia RHOA G17V, y la sensibilidad de detección puede alcanzar el 0,5%, lo que puede proporcionar una base para el seguimiento de la ERM del linfoma angioinmunoblástico de células T.

Introducción

La enfermedad residual mínima (ERM) es la pequeña cantidad de células cancerosas que aún están presentes en el cuerpo después del tratamiento. Debido a su pequeño número, no provocan ningún signo o síntoma físico. A menudo pasan desapercibidos por los métodos tradicionales, como la visualización microscópica y/o el seguimiento de proteínas séricas anormales en la sangre. Un resultado positivo de la prueba de ERM indica la presencia de células enfermas residuales. Un resultado negativo significa que las células enfermas residuales están ausentes. Después del tratamiento contra el cáncer, las células cancerosas restantes en el cuerpo pueden activarse y comenzar a multiplicarse, lo que provoca una recaída de la enfermedad. La detección de ERM es indicativa de que el tratamiento no fue completamente eficaz o que el tratamiento fue incompleto. Otra razón para los resultados positivos de ERM después del tratamiento podría ser que no todas las células cancerosas respondieron a la terapia o porque las células cancerosas se volvieron resistentes a los medicamentos utilizados^.

El linfoma angioinmunoblástico de células T (AITL) es un subtipo de linfoma periférico de células T (PTCL) derivado de células T foliculares auxiliares²; es el tipo más común de linfoma de células T, que representa alrededor del 15% al 20% de PTCL³. Es un grupo de neoplasias malignas relacionadas que afectan al sistema linfático. La célula de origen es la célula T auxiliar folicular. La clasificación de la OMS de 2016 lo categoriza como linfoma angioinmunoblástico de células T⁴. En 2022, la OMS lo rebautizó como linfoma nodal de células foliculares auxiliares de tipo angioinmunoblástico (nTFHL-AI), junto con linfoma de células auxiliares foliculares foliculares nodales (nTFHL-F) y linfoma de células auxiliares foliculares T nodales, no especificado de otro modo (nTFHL-NOS), denominados colectivamente linfoma de células T auxiliares foliculares nodulares (nTFHL). Esto se hizo para identificar sus importantes características clínicas e inmunofenotípicas y las firmas y mutantes similares de expresión génica de T folicular helper (TFH). Genéticamente, nTFHL-AI se caracteriza por la adquisición progresiva de mutaciones somáticas en células madre hematopoyéticas tempranas a través de mutaciones TET2 y DNMT3A, mientras que las mutaciones RHOA e IDH2 también están presentes en células tumorales TFH⁵. Varios estudios han demostrado que la mutación RHOA G17V ocurre en el 50%-80% de los pacientes con AITL ^6,7,8,9. La proteína RHOA codificada por el gen RHOA se activa por la unión del trifosfato de guanosina (GTP) y se inactiva por la unión del difosfato de guanosina (GDP). Cuando se activa, puede unirse a una variedad de proteínas efectoras y regular una variedad de procesos biológicos. Fisiológicamente, RHOA media la migración y polaridad de las células T, desempeña un papel en el desarrollo de los timocitos y media la activación de la señalización del receptor de células pre-T (pre-TCR)¹⁰. La mutación RHOA G17V es una mutación de pérdida de función que desempeña un papel determinante en la patogénesis del linfoma¹¹. La detección de su mutación de baja frecuencia es útil para la monitorización de la ERM de AITL.

La secuenciación de Sanger se ha utilizado durante más de 40 años como el estándar de oro para la detección de mutaciones conocidas y desconocidas. Sin embargo, su límite de detección es solo del 5%-20%, lo que limita su aplicación para la detección de mutaciones de baja frecuencia^12,13. En la secuenciación de Sanger, la sensibilidad de detección puede disminuirse hasta el 0,1% sustituyendo la PCR tradicional por BDA, una tecnología de bloqueo de la naturaleza^{salvaje 14}. La tecnología BDA agrega principalmente un cebador no coincidente complementario al tipo mutante cuando se diseñan cebadores convencionales para competir con el tipo salvaje y lograr el propósito de amplificar el tipo mutante. La clave para el diseño del cebador es el cebador no coincidente y la modificación del terminal. Al mismo tiempo, de acuerdo con el principio estructural del ADN, la diferencia entre la energía libre de Gibbs de los dos cebadores está entre 0,8 kcal/mol y 5 kcal/mol. Otro paso clave en esta técnica es suprimir la amplificación de tipo salvaje ajustando la proporción de cebadores de tipo salvaje y bloqueante^14,15.

En la actualidad, las técnicas comunes de detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia incluyen PCR específica de alelos basada en PCR (reacción en cadena de la polimerasa específica de alelo, ASPCR), sistema de mutación refractaria a la amplificación PCR (sistema de mutación refractaria a la amplificación-PCR, ARMS-PCR) utilizada para el genotipado de SNP con la ayuda de cebadores refractarios. El diseño de cebadores para los alelos mutantes y normales permite la amplificación selectiva y la PCR digital (Droplet Digital PCR, ddPCR), un método para realizar PCR digital que se basa en la tecnología de gotas de emulsión agua-aceite¹⁶. Una muestra se fracciona en 20.000 gotas y, para cada gota, se realiza una amplificación por PCR de las moléculas madre con una sensibilidad de 1 x ^10-5; la amplificación por desplazamiento de bloqueadores (BDA) es también un método de enriquecimiento de alelos raros basado en PCR que se utiliza para la detección y cuantificación precisas de SNV e indels de hasta 0,01% de VAF en un entorno altamente multiplexado; La tecnología de ácido nucleico bloqueado (ácido nucleico bloqueado no extensible, LNA), es una clase de análogos de ARN de alta afinidad en los que el anillo de ribosa está bloqueado en la conformación ideal para la unión de Watson-Crick; Las sondas específicas de puntos calientes (Hot-Spot-Specific Probe, HSSP), se superponen a la secuencia de cebadores objetivo, incluyen una sola mutación y se modifican con un espaciador C3 en el extremo ^C3' para evitar la amplificación por qPCR 14,16,17,18. Cuando existe una mutación en la secuencia, el HSSP se adhiere competitivamente a la mutación objetivo y evita que el cebador se una a la secuencia mutante objetivo, lo que detiene la amplificación de la secuencia; NGS (secuenciación de próxima generación) - secuenciación de inmunoglobulinas de alto rendimiento (igHTS) Perfil personalizado del cáncer por secuenciación profunda (CAAP-seq), es un método basado en secuenciación de próxima generación que se utiliza para cuantificar el ADN circulante en las células cancerosas (la sensibilidad es 1 x ^10-4); etcetera. Entre ellos, la mayoría de los métodos se basan en PCR y solo pueden detectar un pequeño número de sitios de mutación, y los métodos basados en NGS pueden detectar múltiples sitios, pero el costo es alto y el proceso es complicado 14,16,17,18. Ha habido informes sobre la detección de mutaciones de baja frecuencia en RHOA G17V basadas en la qPCR, pero el límite de detección solo puede alcanzar alrededor del 2%¹⁹. No hay informes sobre la detección de la mutación de baja frecuencia RHOA G17V basada en la secuenciación de Sanger. Aquí, demostramos el aumento de la sensibilidad logrado por BDA, una PCR en bloque de tipo salvaje combinada con la secuenciación de Sanger, para optimizar la detección de mutaciones somáticas de baja frecuencia RHOA G17V, y la sensibilidad de detección puede alcanzar el 0,5%. También se proporcionan datos adicionales para IDH2 y JAK1.

Este artículo proporciona un protocolo detallado del esquema de detección de baja frecuencia RHOA G17V mediante secuenciación de Sanger y proporciona una referencia para el desarrollo de más detección de mutaciones de baja frecuencia basada en la plataforma de secuenciación de Sanger. Este método se puede utilizar para detectar y monitorizar posibles mutaciones de resistencia a los fármacos y residuos mínimos en los tumores.

Protocolo

Este estudio fue aprobado por el comité de revisión de ética médica del Hospital Central de Yongzhou (número de aprobación: 2024022601). Los participantes dieron su consentimiento informado.

1. Diseño de imprimación

1. Diseño de imprimación convencional: Diseñe los cebadores de acuerdo con las reglas de diseño de cebadores²⁰ informadas, el diseño de cebadores por NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome). Para el sitio de mutación de RHOA G17V, todas las secuencias de referencia para el diseño de cebadores convencionales son la secuencia de bases mutada. Asegúrese de que los cebadores de amplificación inversa diseñados contengan la secuencia del sitio de mutación y que la temperatura de recocido de los cebadores sea de aproximadamente 60 °C.
2. Diseño de imprimación BDA
   1. Diseñe el cebador de bloqueo salvaje con una longitud de aproximadamente 20-30 pares de bases (pb), que contenga de 2 a 4 bases modificadas, y las bases modificadas compuestas por A y T. Asegúrese de que el cebador de bloqueo tenga una superposición de 6-14 pb con el cebador de amplificación de mutación, utilizado para competir con el cebador de amplificación de mutación.
   2. Diseñe el cebador con una temperatura de recocido para los cebadores de amplificación mutante y los cebadores de bloqueo salvaje diseñados finalmente establecidos en aproximadamente 60 °C, y la diferencia en la energía libre de Gibbs entre 0,8 y 5 kcal/mol. Para conocer las reglas de cálculo detalladas, consulte la literatura¹⁵.
      NOTA: Cuando los cebadores diseñados no cumplen con las condiciones anteriores, las bases se pueden agregar o restar manualmente para su ajuste. La lista final de imprimaciones diseñadas se muestra en la Tabla 1 y la Tabla 2.

2. Preparación de la muestra y extracción de ADN

NOTA: Todas las muestras experimentales de verificación provienen de muestras de sangre periférica, médula ósea o tumores sólidos de pacientes con linfoma humano. Hubo 10 muestras positivas: 3 fueron muestras de tumores sólidos, 4 fueron muestras de médula ósea y 3 fueron muestras de sangre periférica. Hay 30 muestras negativas de personas sanas.

1. Extracción de muestras de médula ósea y sangre periférica
   1. Añadir 400 μL de médula ósea o muestra de sangre periférica y reactivos en los tubos correspondientes según los requisitos y extraer según el procedimiento de extracción del fabricante.
   2. Prepare nuevos tubos de muestra y tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Numere los tubos de muestra del 1 al 24. Marque las tapas de los tubos de 1,5 ml con el nombre de la muestra y la fecha de extracción en el orden de los nombres en los tubos de extracción de sangre correspondientes. Marque 1-24 en el costado del tubo de microcentrífuga para verificar la correspondencia uno a uno.
   3. Añada 40 μL de solución de proteinasa K al tubo de muestra y añada 400 μL de muestra de sangre entera (para volúmenes inferiores a 400 μL, llene hasta 400 μL con PBS).
   4. Coloque el tubo de muestra (1-24), la punta de la pipeta (incluida la tapa de la pipeta) y el tubo de recolección en las posiciones correspondientes. Extraiga el ADN de acuerdo con el procedimiento del fabricante.
2. Extracción de muestras fijadas en formol e integradas en parafina (FFPE)
   1. Coloque las muestras y los reactivos en los tubos correspondientes de acuerdo con los requisitos y extraiga de acuerdo con el procedimiento de extracción del fabricante.
   2. Añada 1,1 mL de tampón de almacenamiento de proteinasa K (solución PK) al polvo seco de proteinasa K, vórtice, y mezcle bien para obtener una solución de proteinasa K con una concentración de 10 mg/mL. Conservar a -20 °C.
   3. Saque la solución de proteinasa K y derrítala completamente a temperatura ambiente. Haga funcionar el termostato seco y ajuste la temperatura a 55 °C.
   4. Tome un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y escriba el nombre de la muestra en él. Tome menos de 30 mg de tejido y colóquelo en el tubo de microcentrífuga. A continuación, añada 500 μL de tampón de desparafina y 20 μL de solución de proteinasa K al tubo.
   5. Después de mezclar en vórtice durante al menos 10 s, coloque el tubo de microcentrífuga en un termostato seco y manténgalo caliente a 55 °C durante 90 min.
   6. Asegúrese de que la columna de centrifugado encaje en el tubo del filtro. Una vez completada la incubación, transfiera la muestra, incluidos el líquido y el tejido, a la columna de centrifugación. Centrifugar a 16.500 x g durante 5 min para centrifugar todo el líquido en el tubo del filtro.
   7. Tome 1 tubo de muestra (sin tapa) incluido con el kit y escriba el nombre de la muestra en él. Transfiera el líquido del tubo de filtro de 400 μL al tubo de muestra.
   8. Una vez completados el pretratamiento y la preparación de la muestra, coloque los consumibles y reactivos correspondientes en las posiciones correspondientes y realice la extracción de ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. Control de calidad del ADN
   1. Mida la concentración y la pureza del ADN extraído y asegúrese de que la concentración de ADN sea ≥ de 25 ng/μL. Registre la concentración de ADN de cada muestra y utilícela inmediatamente para su posterior detección o congelación a -20 °C.
      NOTA: Los valores de OD260/OD280 se utilizan generalmente para probar la pureza de las muestras de ADN. El valor normal de OD260 / OD280 es de aproximadamente 1.7-1.9, lo que indica que la pureza del ADN es buena; si el valor de OD260/OD280 es ≤1,7, indica que puede haber contaminación por proteínas; si el valor de OD260/OD280 es ≥2,0, indica que puede haber contaminación por ARN o que el ADN se ha degradado.

3. Amplificación por PCR

1. Preparación de imprimaciones
   1. Preparación de la solución de imprimación
      1. Saque el polvo seco de imprimación y centrifugue a 5400-8400 x g durante 2-3 min. Verifique el valor nmol de la imprimación y abra lentamente la tapa. Usando una pipeta con el volumen correspondiente de agua destilada doble (ddH₂O), que es 10x el valor nM, agréguelo lentamente a lo largo de la pared del tubo de cebador.
      2. Prepare los cebadores a 0,1 nM/μL o 100 μM de solución madre (por ejemplo, el valor de nM es 21,1; en consecuencia, el agua a añadir es de 211 μL). Mezcle bien el vórtice, luego centrifugue brevemente para asegurarse de que la solución llegue al fondo de cada pozo. Escriba el nombre del cebador, los datos de configuración y la persona de configuración en la tapa del tubo. Colóquelo en la ubicación de almacenamiento de soluciones madre correspondiente.
   2. Preparación de la solución de trabajo de imprimación
      1. Pipetear 5 μL de cebador directo, 5 μL de imprimación inversa, 50 μL de solución de material de imprimación de tipo salvaje y 40 μL de ddH₂O en un tubo de microcentrífuga limpio. Pipetea repetidamente 2x-3x, vórtice para mezclar y centrifugar al instante.
      2. Escriba el nombre del cebador, la fecha de configuración y la persona que lo configuró en la tapa del tubo y colóquelo en la ubicación de almacenamiento correspondiente de la solución de trabajo.
2. Procedimiento de amplificación por PCR
   1. Para cada reacción, agregue 5 μL de mezcla maestra de enzimas de amplificación de PCR, 1 μL de solución de trabajo de cebador y 1 μL de plantilla de ADN (la cantidad de entrada de plantilla debe alcanzar los 400 ng, si la concentración de ADN no es suficiente; aumente el volumen de ADN y reduzca el volumen de ddH₂O agregado) y 3 μL de ddH₂O. Vortex para mezclar y desprenderse instantáneamente.
   2. Coloque el tubo de reacción de PCR en el instrumento de PCR preestablecido para la amplificación de PCR. Configure el programa de ciclo térmico del instrumento PCR de la siguiente manera y ejecute:
      95 °C durante 3 min; 20 ciclos de 95 °C durante 30 s, 68 °C durante 15 s (disminución de 0,5 °C por ciclo), 72 °C durante 1 min; 16 ciclos de 95 °C durante 30 s, 58 °C durante 15 s, 72 °C durante 1 min; y 72 °C durante 10 min.
3. Realizar electroforesis en gel en el producto de PCR con agarosa al 2% para comprobar si el fragmento objetivo está amplificado.
4. Purificación de productos PCR
   1. Lleve la purificasa I y la purificasa II a temperatura ambiente y centrifuga al instante. Prepare la reacción de purificación del producto PCR de la siguiente manera: 1 μL de purificasa I, 0,5 μL de purificasa II, 3 μL de producto PCR y 3,5 μL de ddH₂O.
   2. Coloque el tubo de reacción de PCR en el instrumento de PCR preestablecido para la amplificación de PCR. Configure el programa de ciclo térmico del instrumento PCR de la siguiente manera y haga funcionar la máquina:
      37 °C durante 30 min, 95 °C durante 15 min.

4. Secuenciación de productos PCR después de la purificación

1. Secuenciación
   1. Lleve la mezcla maestra de la enzima de amplificación de secuenciación, el tampón y el ddH₂O a temperatura ambiente. Una vez que el reactivo se haya licuado, centrifuga al instante.
   2. Prepare el sistema de reacción de secuenciación de la siguiente manera: 1,8 μL de tampón de secuenciación, 0,4 μL de mezcla maestra de enzimas de amplificación de secuenciación, 1 μL de cebador de secuenciación, 0,8 μL de producto de PCR purificado y 6 μL de ddH₂O.
   3. Coloque el tubo de reacción de PCR en el instrumento de PCR preestablecido para la amplificación de PCR. Configure el programa de ciclo térmico del instrumento PCR de la siguiente manera y ejecute: 96 °C durante 3 min; 28 ciclos de 96 °C durante 25 s, 56 °C durante 15 s, 60 °C durante 4 min.
   4. Una vez finalizada la reacción de secuenciación, retire el producto del instrumento de PCR. Almacene los productos de reacción en el refrigerador, protegidos de la luz.
2. Purificación de productos de secuenciación
   1. Vórtice las cuentas magnéticas a fondo. Agregue 10 μL de perlas magnéticas y 40 μL de alcohol al 80% a la placa de 96 pocillos y selle la placa con una película.
   2. Coloque la placa de 96 pocillos con perlas magnéticas y alcohol en el agitador de vórtice durante 10 s para suspender y mezclar completamente las perlas magnéticas (observando si hay precipitación de perlas magnéticas en la parte inferior y tenga cuidado de que el líquido no caiga en la película de sellado). Colócalo en un oscilador horizontal y átalo con una banda elástica para que vibre durante 3-5 minutos (marcha máxima).
   3. Después de oscilar, coloque la placa PCR en el soporte magnético, preste atención a presionarla firmemente. Mantenga el soporte a 4 °C para la adsorción estática durante 3 minutos, y después de que todas las perlas magnéticas se hayan adsorbido en la pared, retire la película de sellado y vierta el líquido residual.
   4. Agregue 40 μL de alcohol al 80% a la placa de PCR, enjuague las perlas y vierta el líquido usado. Coloque la placa sobre papel absorbente y dé golpecitos suaves (no deje que la placa PCR se separe del disco). Repita 1 vez.
   5. Coloque el papel absorbente boca abajo junto con la placa magnética en la centrífuga a 120 x g para un giro rápido.
   6. Coloque la placa PCR que contiene las perlas magnéticas después de eliminar el alcohol en el horno a 60 °C durante 3-5 min. Seca las cuentas por completo.
      NOTA: Si no hay horno, coloque la placa a temperatura ambiente durante 10 min.
   7. Añadir 40 μL de agua pura después del secado. Coloque la película de sellado en la placa y agítela en un agitador de vórtice durante 3-5 s. Coloque la placa en un agitador horizontal, átela firmemente y agítela durante 3-5 minutos para disolver el producto de secuenciación purificado.
   8. Gire el producto de secuenciación disuelto a 180 x g y utilice el producto para el análisis genómico mediante electroforesis capilar²¹ (tenga en cuenta que el disco de soporte debe agregarse a la placa de muestras).
3. Análisis de los resultados de la secuenciación
   1. Obtenga los resultados de la secuenciación del software. Consulte el manual del software para conocer los procedimientos de operación detallados. Utilice la secuencia de referencia de NCBI.

Resultados

Compare la secuencia de la muestra de prueba con la secuencia de referencia para obtener el estado de mutación de la muestra de prueba. La tecnología WBT-PCR basada en BDA puede detectar la conocida mutación RHOA G17V y otras mutaciones de baja frecuencia en el intervalo de amplificación de los cebadores aguas arriba y aguas abajo. Véase la figura 1. Dos genes adicionales, a saber, IDH2 y JAK1, también se analizaron utilizando este m?...

Discusión

La WTB-PCR basada en la tecnología BDA, descrita en este artículo, introduce un cebador no coincidente complementario al tipo mutante cuando se diseñan cebadores convencionales para competir con el tipo salvaje, suprimir el tipo salvaje y amplificar el producto mutante. A continuación, se secuenciaron los productos WTB-PCR para el análisis de mutaciones. La utilidad de WTB-PCR/Sanger es su simplicidad y alta sensibilidad. De acuerdo con el esquema de detección establecido en este t...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen