저빈도 체세포 돌연변이 검출을 위한 Sanger 염기서열분석과 결합된 야생형 차단 PCR

요약

이 기사에서는 혈관면역모세포 림프종에서 Sanger 염기서열분석을 기반으로 하는 저주파 검출 방법의 적용을 소개합니다. 이 방법을 다른 질병에 적용할 수 있는 근거를 제공합니다.

초록

종양 치료 후 최소 잔류 질환(MRD)을 모니터링할 때 약물 내성 돌연변이 및 치료 중 순환 종양 세포 돌연변이를 검출할 때보다 검출 하한에 대한 요구 사항이 더 높습니다. 기존의 Sanger 염기서열분석은 5%-20%의 야생형 돌연변이 검출이 가능하므로 검출 한계가 해당 요구사항을 충족할 수 없습니다. 이를 극복하는 것으로 보고된 야생형 차단 기술에는 BDA(blocker displacement amplification), LNA(Non-extendable locked nucleic acid), HSSP(hot-spot-specific probe) 등이 있습니다. 이러한 기술은 특정 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하여 야생형을 차단하거나 야생형을 인식한 다음 이를 다른 방법과 결합하여 야생형 증폭을 방지하고 돌연변이 증폭을 증폭하여 높은 감도, 유연성 및 편의성과 같은 특성을 제공합니다. 이 프로토콜은 RHOA G17V 저주파 체세포 돌연변이의 검출을 최적화하기 위해 Sanger 염기서열분석과 결합된 야생형 차단 PCR인 BDA를 사용하며, 검출 민감도는 0.5%에 도달할 수 있으며, 이는 혈관면역모세포 T세포 림프종의 MRD 모니터링을 위한 기초를 제공할 수 있습니다.

서문

최소 잔류 질환(MRD)은 치료 후에도 체내에 여전히 존재하는 소수의 암세포입니다. 수가 적기 때문에 신체적 징후나 증상을 일으키지 않습니다. 현미경 시각화 및/또는 혈액 내 비정상적인 혈청 단백질 추적과 같은 기존 방법으로는 감지되지 않는 경우가 많습니다. MRD 양성 검사 결과는 잔류 질환 세포의 존재를 나타냅니다. 음성 결과는 잔류 병든 세포가 없음을 의미합니다. 암 치료 후에는 체내에 남아 있는 암세포가 활성화되어 증식하기 시작하여 질병이 재발할 수 있습니다. MRD를 검출하는 것은 치료가 완전히 효과적이지 않았거나 치료가 불완전했음을 나타냅니다. 치료 후 MRD 양성 결과가 나오는 또 다른 이유는 모든 암세포가 치료에 반응하지 않거나 암세포가 사용된 약물에 내성을 갖게 되었기 때문일 수 있습니다¹.

혈관면역모세포 T세포 림프종(AITL)은 T 소낭선 보조세포에서 유래한 말초 T세포 림프종(PTCL)의 아형이다²; 가장 흔한 유형의 T 세포 림프종으로 PTCL³의 약 15%-20%를 차지합니다. 림프계에 영향을 미치는 관련 악성 종양의 그룹입니다. 기원 세포는 여포 T 도우미 세포입니다. 2016년 WHO는 이 질환을 혈관면역모세포 T세포 림프종⁴로 분류하고 있습니다. 2022년 WHO는 이를 결절 T-여포 보조 세포 림프종, 혈관면역모세포형(nTFHL-AI)으로 이름을 변경했으며, 달리 명시되지 않은 결절 T-여포 보조세포 림프종(nTFHL-NOS)과 함께 결절 여포 보조세포 림프종(nTFHL-NOS)으로 이름을 변경했으며, 통칭하여 결절성 여포 보조세포 T 세포 림프종(nTFHL)이라고 합니다. 이는 중요한 임상적 및 면역표현형 특징과 유사한 T follicular helper (TFH) 유전자 발현 시그니처 및 돌연변이를 확인하기 위해 수행되었습니다. 유전적으로 nTFHL-AI는 TET2 및 DNMT3A 돌연변이를 통해 초기 조혈모세포에서 체세포 돌연변이가 점진적으로 획득되는 것이 특징이며, RHOA 및 IDH2 돌연변이는 TFH 종양 세포에도 존재한다⁵. 여러 연구에 따르면 RHOA G17V 돌연변이는 AITL 환자의 50%-80%에서 발생합니다 6,7,8,9. RHOA 유전자에 의해 암호화된 RHOA 단백질은 구아노신 삼인산(GTP) 결합에 의해 활성화되고 구아노신 이인산(GDP) 결합에 의해 비활성화됩니다. 활성화되면 다양한 효과기 단백질에 결합하고 다양한 생물학적 과정을 조절할 수 있습니다. 생리학적으로 RHOA는 T세포 이동과 극성을 매개하고, 흉선세포 발달에 중요한 역할을 하며, pre-T세포 수용체(pre-TCR) 신호전달의 활성화를 매개한다¹⁰. RHOA G17V 돌연변이는 림프종 발병기전을 주도하는 역할을 하는 기능 상실 돌연변이입니다¹¹. 저주파 돌연변이의 검출은 AITL의 MRD 모니터링에 도움이 됩니다.

Sanger 염기서열분석은 알려진 돌연변이와 알려지지 않은 돌연변이의 검출을 위한 황금 표준으로 40년 이상 사용되어 왔습니다. 그러나 검출 한계는 5%-20%에 불과하여 저주파 돌연변이 검출에 대한 적용을 제한합니다^12,13. Sanger 염기서열분석에서는 기존 PCR을 와일드 블로킹 기술인 BDA로 대체하여 검출 민감도를 0.1%로 낮출 수 있다¹⁴. BDA 기술은 주로 기존 프라이머를 설계할 때 돌연변이형에 보완적인 미스매치 프라이머를 추가하여 야생형과 경쟁하도록 함으로써 돌연변이형을 증폭시키는 목적을 달성합니다. 프라이머 설계의 핵심은 미스매치 프라이머와 말단 수정입니다. 동시에 DNA의 구조 원리에 따라 두 프라이머의 Gibbs 자유 에너지 차이는 0.8kcal/mol과 5kcal/mol 사이입니다. 이 기술의 또 다른 중요한 단계는 야생형과 차단 프라이머^14,15의 비율을 조정하여 야생형 증폭을 억제하는 것입니다.

현재 일반적인 저빈도 체세포 돌연변이 검출 기술로는 난치프라이머를 이용하여 SNP의 유전형 분석에 사용되는 PCR 기반 대립유전자 특이적 PCR(대립유전자 특이적 중합효소연쇄반응, ASPCR), 증폭불응성 돌연변이 시스템 PCR(증폭-불응성 돌연변이 시스템-PCR, ARMS-PCR) 등이 있습니다. 돌연변이 및 정상 대립유전자에 대한 프라이머를 설계하면 선택적 증폭 및 디지털 PCR(Droplet Digital PCR, ddPCR)이 가능하며, 이는 물-오일 에멀젼 액적 기술¹⁶을 기반으로 하는 디지털 PCR을 수행하는 방법입니다. 샘플은 20,000개의 액적으로 분류되고 각 액적에 대해 템플릿 분자의 PCR 증폭은 1 x ^10-5의 감도로 수행됩니다. 차단제 변위 증폭(BDA)은 고도로 다중화된 환경에서 0.01% VAF까지 SNV 및 indels의 정확한 검출 및 정량화에 사용되는 PCR 기반 희귀 대립유전자 농축 방법이기도 합니다. 고정 핵산 기술(Non-extendable locked nucleic acid, LNA)은 리보스 고리가 Watson-Crick 결합을 위한 이상적인 형태로 고정되어 있는 고친화성 RNA 유사체의 한 종류입니다. 핫스팟 특이적 프로브(Hot-Spot-Specific Probe, HSSP)는 타겟 프라이머 염기서열과 겹치고, 단일 돌연변이를 포함하며, qPCR^14,16,17,18에 의한 증폭을 방지하기 위해 C3^' 말단에서 C3 스페이서로 변형됩니다. 염기서열에 돌연변이가 존재하면 HSSP는 경쟁적으로 표적 돌연변이에 부착하고 프라이머가 표적 돌연변이 염기서열에 결합하는 것을 방지하여 염기서열 증폭을 중단합니다. NGS(차세대 염기서열분석) 기반 면역글로불린 고처리량 염기서열분석(igHTS) 심층 염기서열분석(CAAP-seq)에 의한 암 맞춤형 프로파일링은 암세포의 순환 DNA를 정량화하는 데 사용되는 차세대 염기서열분석 기반 방법입니다(민감도는 1 x ^10-4). 등. 그 중 대부분의 방법은 PCR을 기반으로 하여 소수의 돌연변이 부위만 검출할 수 있으며, NGS 기반 방법은 여러 부위를 검출할 수 있지만 비용이 많이 들고 과정이 복잡합니다 14,16,17,18. qPCR을 기반으로 한 RHOA G17V 저주파 돌연변이 검출에 대한 보고가 있었지만 검출 한계는 약 2%에 불과합니다¹⁹. Sanger 염기서열분석을 기반으로 한 RHOA G17V 저주파 돌연변이 검출에 대한 보고는 없습니다. 여기에서는 RHOA G17V 저주파 체세포 돌연변이의 검출을 최적화하기 위해 Sanger 염기서열분석과 결합된 야생형 블록 PCR인 BDA에 의해 달성된 감도 증가를 보여주며 검출 민감도는 0.5%에 도달할 수 있습니다. IDH2 및 JAK1에 대한 추가 데이터도 제공됩니다.

이 기사에서는 Sanger 염기서열분석에 의한 RHOA G17V 저주파 검출 체계에 대한 자세한 프로토콜을 제공하고 Sanger 염기서열분석 플랫폼을 기반으로 한 더 낮은 주파수 돌연변이 검출 개발을 위한 참조를 제공합니다. 이 방법은 종양에서 가능한 약물 내성 돌연변이와 최소 잔류물을 검출하고 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구는 Yongzhou Central Hospital의 의료 윤리 검토 위원회(승인 번호: 2024022601)의 승인을 받았습니다. 참가자들은 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.

1. 프라이머 디자인

1. 종래의 프라이머 디자인: 보고된 프라이머 디자인 규칙²⁰, NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)에 의한 프라이머 디자인에 따른 프라이머 디자인. RHOA G17V의 돌연변이 부위의 경우, 기존 프라이머 설계를 위한 모든 참조 염기서열은 돌연변이된 염기서열입니다. 설계된 역증폭 프라이머에 돌연변이 부위 염기서열이 포함되어 있고 프라이머의 어닐링 온도가 약 60°C인지 확인합니다.
2. BDA 프라이머 디자인
   1. 2-4개의 변형된 염기와 A와 T로 구성된 변형된 염기를 포함하는 약 20-30개의 염기쌍(bp) 길이로 야생 차단 프라이머를 설계합니다. 차단 프라이머가 돌연변이 증폭 프라이머와 경쟁하는 데 사용되는 돌연변이 증폭 프라이머와 6-14bp 겹치는지 확인합니다.
   2. 최종 설계된 돌연변이 증폭 프라이머 및 야생 차단 프라이머의 어닐링 온도를 약 60°C로 설정하고 Gibbs 자유 에너지의 차이를 0.8-5kcal/mol 사이로 설정하여 프라이머를 설계합니다. 자세한 계산 규칙은 문헌¹⁵를 참조하십시오.
      알림: 설계된 프라이머가 위의 조건을 충족하지 않는 경우 조정을 위해 염기를 수동으로 추가하거나 뺄 수 있습니다. 최종적으로 설계된 프라이머 목록은 표 1 및 표 2에 나타내었다.

2. 시료 전처리 및 DNA 추출

참고: 실험적 검증 샘플은 모두 인간 림프종 환자의 말초 혈액, 골수 또는 고형 종양 샘플에서 채취한 것입니다. 양성 샘플은 10개였으며 3개는 고형 종양 샘플, 4개는 골수 샘플, 3개는 말초 혈액 샘플이었습니다. 건강한 사람들로부터의 30개의 음성 샘플이 있습니다.

1. 골수 및 말초 혈액 샘플 추출
   1. 요구 사항에 따라 400μL의 골수 또는 말초 혈액 샘플 및 시약을 해당 튜브에 추가하고 제조업체의 추출 절차에 따라 추출합니다.
   2. 새 시료 튜브와 1.5mL 미세 원심분리기 튜브를 준비합니다. 샘플 튜브에 1-24로 번호를 매깁니다. 1.5mL 튜브 덮개에 해당 혈액 수집 튜브의 이름 순서대로 샘플 이름과 추출 날짜를 표시합니다. 일대일 대응 확인을 위해 마이크로 원심분리기 튜브 측면에 1-24를 표시합니다.
   3. 40 μL의 proteinase K 용액을 시료 튜브에 추가하고 400 μL의 전혈 시료를 추가합니다(부피가 400 μL 미만인 경우 PBS로 400 μL까지 채웁니다).
   4. 샘플 튜브(1-24), 피펫 팁(피펫 커버 포함) 및 수집 튜브를 해당 위치에 놓습니다. 제조업체의 절차에 따라 DNA를 추출합니다.
2. FFPE(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded) 시료 추출
   1. 요구 사항에 따라 샘플과 시약을 해당 튜브에 넣고 제조업체의 추출 절차에 따라 추출합니다.
   2. 1.1mL의 proteinase K 저장 완충액(PK 용액)을 proteinase K 건조 분말, 와류에 넣고 잘 혼합하여 10mg/mL 농도의 proteinase K 용액을 얻습니다. -20 °C에서 보관하십시오.
   3. proteinase K 용액을 꺼내 실온에서 완전히 녹입니다. 건조 온도 조절기를 실행하고 온도를 55°C로 설정합니다.
   4. 1.5mL 미세 원심분리기 튜브를 가져와서 샘플 이름을 씁니다. 30mg 미만의 조직을 가져다가 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 그런 다음 500 μL의 Deparaffin Buffer와 20 μL proteinase K 용액을 튜브에 추가합니다.
   5. 최소 10초 동안 와류를 혼합한 후 마이크로 원심분리기 튜브를 건조한 온도 조절기에 넣고 55°C에서 90분 동안 따뜻하게 유지합니다.
   6. 스핀 컬럼이 필터 튜브에 맞는지 확인하십시오. 배양이 완료된 후 액체 및 조직을 포함한 샘플을 스핀 컬럼으로 옮깁니다. 16,500 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 모든 액체를 필터 튜브로 원심분리합니다.
   7. 키트에 포함된 1개의 샘플 튜브(캡 제외)를 가져와서 샘플 이름을 씁니다. 400μL 필터 튜브에서 샘플 튜브로 액체를 옮깁니다.
   8. 시료 전처리 및 준비가 완료된 후 해당 소모품과 시약을 해당 위치에 놓고 제조업체의 지침에 따라 DNA 추출을 수행합니다.
3. DNA 품질 관리
   1. 추출된 DNA의 농도와 순도를 측정하고 DNA 농도가 ≥ 25ng/μL인지 확인합니다. 각 샘플의 DNA 농도를 기록하고 후속 검출을 위해 즉시 사용하거나 -20°C에서 동결합니다.
      참고: OD260/OD280 값은 일반적으로 DNA 샘플의 순도를 테스트하는 데 사용됩니다. 정상적인 OD260/OD280 값은 약 1.7-1.9로 DNA 순도가 양호함을 나타냅니다. OD260/OD280 값이 ≤1.7이면 단백질 오염이 있을 수 있음을 나타냅니다. OD260/OD280 값이 ≥2.0이면 RNA 오염이 있거나 DNA가 분해되었을 수 있음을 나타냅니다.

3. PCR 증폭

1. 프라이머의 준비
   1. 프라이머 스톡 용액의 준비
      1. 프라이머 건조 분말과 원심분리기를 5400-8400 x g 에서 2-3분 동안 꺼냅니다. 프라이머의 nmol 값을 확인하고 천천히 뚜껑을 엽니다. nM 값의 10배인 해당 부피의 이중 증류수(_{ddH 2}O)가 있는 피펫을 사용하여 프라이머 튜브의 벽을 따라 천천히 추가합니다.
      2. 0.1nM/μL 또는 100μM 원액에서 프라이머를 준비합니다(예: nM 값은 21.1, 이에 따라 추가할 물은 211μL). Vortex를 철저히 혼합한 다음 잠시 원심분리하여 용액이 각 웰의 바닥에 도달하도록 합니다. 튜브 캡에 프라이머 이름, 구성 데이터 및 구성 담당자를 기록합니다. 해당 스톡 용액 보관 위치에 넣으십시오.
   2. primer working solution의 준비
      1. 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브에 5 μL의 포워드 프라이머, 5 μL의 리버스 프라이머, 50 μL의 와일드타입 프라이머 스톡 용액 및 40 μL의 ddH₂O를 피펫팅합니다. 피펫을 2x-3x 반복하고 소용돌이를 일으켜 혼합하고 즉시 스핀오프합니다.
      2. 튜브 캡에 프라이머의 이름, 구성 날짜, 프라이머를 구성한 사람을 기록하고 작업 용액의 해당 보관 위치에 넣습니다.
2. PCR 증폭 절차
   1. 각 반응에 대해 PCR 증폭 효소 마스터 믹스 5μL, 프라이머 작업 용액 1μL 및 DNA 템플릿 1μL(DNA 농도가 충분하지 않은 경우 템플릿 입력량이 400ng에 도달해야 함, DNA의 부피를 늘리고 ddH₂O 첨가의 부피를 줄임) 및 3 μL의 ddH₂O. Vortex를 추가하여 즉시 혼합하고 스핀오프합니다.
   2. PCR 증폭을 위해 사전 설정된 PCR 기기에 PCR 반응 튜브를 놓습니다. PCR 기기의 열 사이클 프로그램을 다음과 같이 설정하고 실행합니다.
      95 °C에서 3분 동안; 30초 동안 95°C의 20회 주기, 68초 동안 15°C(주기당 0.5°C 감소), 72분 동안 1°C; 30초 동안 95°C, 15초 동안 58°C, 1분 동안 72°C의 16회 주기; 72°C에서 10분 동안 가열합니다.
3. 2% 아가로스가 있는 PCR 산물에 대해 겔 전기영동을 수행하여 타겟 단편이 증폭되었는지 확인합니다.
4. PCR 산물의 정제
   1. 퓨리피케이스 I과 퓨리피케이스 II를 실온에 두고 즉시 스핀오프합니다. PCR 산물 정제 반응을 다음과 같이 준비한다: 1 μL의 purificase I, 0.5 μL의 purificase II, 3 μL의 PCR 산물, 및 3.5 μL의_ddH2O.
   2. PCR 증폭을 위해 사전 설정된 PCR 기기에 PCR 반응 튜브를 놓습니다. PCR 기기의 열 사이클 프로그램을 다음과 같이 설정하고 기계를 실행합니다.
      37°C에서 30분, 95°C에서 15분

4. 정제 후 PCR 산물의 염기서열분석

1. 시퀀싱
   1. 염기서열분석 증폭 효소 마스터 믹스, 완충액 및 ddH₂O를 실온으로 가져옵니다. 시약이 액화되면 즉시 스핀오프합니다.
   2. 1.8 μL의 염기서열분석 완충액, 0.4 μL의 염기서열분석 증폭 효소 마스터 믹스, 1 μL의 염기서열분석 프라이머, 0.8 μL의 정제된 PCR 산물, 및 6 μL의_ddH2O와 같이 염기서열분석 반응 시스템을 준비합니다.
   3. PCR 증폭을 위해 사전 설정된 PCR 기기에 PCR 반응 튜브를 놓습니다. PCR 기기의 열 사이클 프로그램을 다음과 같이 설정하고 실행하십시오: 96분 동안 3°C; 25초 동안 96°C, 15초 동안 56°C, 4분 동안 60°C의 28주기
   4. 염기서열분석 반응이 완료된 후 PCR 기기에서 생성물을 제거합니다. 반응 생성물을 빛으로부터 보호된 냉장고에 보관하십시오.
2. 염기서열분석 산물의 정제
   1. 마그네틱 비드를 철저히 소용돌이치십시오. 10 μL의 마그네틱 비드와 40 μL의 80 % 알코올을 96 웰 플레이트에 추가하고 플레이트를 필름으로 밀봉합니다.
   2. 마그네틱 비드와 알코올이 있는 96웰 플레이트를 볼텍스 셰이커에 10초 동안 올려 마그네틱 비드를 완전히 매달고 혼합합니다(바닥에 마그네틱 비드 침전이 있는지 관찰하고 밀봉 필름에 액체가 닿지 않도록 주의). 수평 발진기에 놓고 고무 밴드로 묶어 3-5분(최대 기어) 동안 진동시킵니다.
   3. 진동 후 PCR 플레이트를 마그네틱 스탠드에 놓고 단단히 누르는 데 주의하십시오. 스탠드를 4°C에서 3분 동안 정전기 흡착을 위해 유지하고 마그네틱 비드가 벽에 모두 흡착된 후 밀봉 필름을 제거하고 폐액을 붓습니다.
   4. PCR 플레이트에 40μL의 80% 알코올을 추가하고 비드를 헹구고 폐액을 붓습니다. 플레이트를 흡수성 종이에 놓고 부드럽게 두드립니다(PCR 플레이트가 디스크에서 분리되지 않도록 하십시오). 1회 반복합니다.
   5. 흡수지를 자성판과 함께 거꾸로 뒤집어 120 x g 의 원심분리기에 넣고 빠르게 회전시킵니다.
   6. 알코올을 제거한 후 마그네틱 비드가 들어있는 PCR 플레이트를 60°C의 오븐에 3-5분 동안 넣습니다. 비드를 완전히 말리십시오.
      알림: 오븐이 없으면 접시를 실온에서 10분 동안 두십시오.
   7. 건조 후 순수한 물 40μL를 추가합니다. 밀봉 필름을 플레이트에 놓고 와류 셰이커에 3-5초 동안 흔듭니다. 플레이트를 수평 셰이커에 놓고 단단히 묶고 3-5분 동안 흔들어 정제된 시퀀싱 산물을 녹입니다.
   8. 용해된 염기서열분석 산물을 180 x g 에서 회전시키고 모세관 전기영동²¹ 을 사용하여 게놈 분석에 제품을 사용합니다(지지 디스크를 샘플 보드에 추가해야 함).
3. 염기서열분석 결과 분석
   1. 소프트웨어에서 염기서열분석 결과를 얻습니다. 자세한 작동 절차는 소프트웨어 설명서를 참조하십시오. NCBI의 참조 시퀀스를 사용합니다.

결과

테스트 샘플의 염기서열을 참조 염기서열과 비교하여 테스트 샘플의 돌연변이 상태를 얻습니다. BDA 기반 WBT-PCR 기술은 업스트림 및 다운스트림 프라이머의 증폭 간격에서 알려진 RHOA G17V 돌연변이 및 기타 저주파 돌연변이를 검출할 수 있습니다. 그림 1을 참조하십시오. 두 개의 추가 유전자, 즉 IDH2 및 JAK1도 이 방법을 사용하여 각각

토론

이 기사에서 설명하는 BDA 기술을 기반으로 한 WTB-PCR은 기존 프라이머를 설계할 때 돌연변이형을 보완하는 불일치 프라이머를 도입하여 야생형과 경쟁하고, 야생형을 억제하고, 돌연변이 산물을 증폭합니다. 그런 다음 돌연변이 분석을 위해 WTB-PCR 산물의 염기서열을 분석했습니다. WTB-PCR/Sanger의 유용성은 단순성과 높은 감도입니다. 이 논문에서 확립된 검출 체계에 따르?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen