저빈도 체세포 돌연변이 검출을 위한 Sanger 염기서열분석과 결합된 야생형 차단 PCR

요약

이 기사에서는 혈관면역모세포 림프종에서 Sanger 염기서열분석을 기반으로 하는 저주파 검출 방법의 적용을 소개합니다. 이 방법을 다른 질병에 적용할 수 있는 근거를 제공합니다.

초록

종양 치료 후 최소 잔류 질환(MRD)을 모니터링할 때 약물 내성 돌연변이 및 치료 중 순환 종양 세포 돌연변이를 검출할 때보다 검출 하한에 대한 요구 사항이 더 높습니다. 기존의 Sanger 염기서열분석은 5%-20%의 야생형 돌연변이 검출이 가능하므로 검출 한계가 해당 요구사항을 충족할 수 없습니다. 이를 극복하는 것으로 보고된 야생형 차단 기술에는 BDA(blocker displacement amplification), LNA(Non-extendable locked nucleic acid), HSSP(hot-spot-specific probe) 등이 있습니다. 이러한 기술은 특정 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하여 야생형을 차단하거나 야생형을 인식한 다음 이를 다른 방법과 결합하여 야생형 증폭을 방지하고 돌연변이 증폭을 증폭하여 높은 감도, 유연성 및 편의성과 같은 특성을 제공합니다. 이 프로토콜은 RHOA G17V 저주파 체세포 돌연변이의 검출을 최적화하기 위해 Sanger 염기서열분석과 결합된 야생형 차단 PCR인 BDA를 사용하며, 검출 민감도는 0.5%에 도달할 수 있으며, 이는 혈관면역모세포 T세포 림프종의 MRD 모니터링을 위한 기초를 제공할 수 있습니다.

서문

최소 잔류 질환(MRD)은 치료 후에도 체내에 여전히 존재하는 소수의 암세포입니다. 수가 적기 때문에 신체적 징후나 증상을 일으키지 않습니다. 현미경 시각화 및/또는 혈액 내 비정상적인 혈청 단백질 추적과 같은 기존 방법으로는 감지되지 않는 경우가 많습니다. MRD 양성 검사 결과는 잔류 질환 세포의 존재를 나타냅니다. 음성 결과는 잔류 병든 세포가 없음을 의미합니다. 암 치료 후에는 체내에 남아 있는 암세포가 활성화되어 증식하기 시작하여 질병이 재발할 수 있습니다. MRD를 검출하는 것은 치료가 완전히 효과적이지 않았거나 치료가 불완전했음을 나타냅니다. 치료 후 MRD 양성 결과가 나오는 또 다른 이유는 모든 암세포가 치료에 반응하지 않거나 암세포가 사용된 약물에 내성을 갖게 되었기 때문일 수 있습니다¹.

혈관면역모세포 T세포 림프종(AITL)은 T 소낭선 보조세포에서 유래한 말초 T세포 림프종(PTCL)의 아형이다²; 가장 흔한 유형의 T 세포 림프종으로 PTCL³의 약 15%-20%를 차지합니다. 림프계에 영향을....

프로토콜

이 연구는 Yongzhou Central Hospital의 의료 윤리 검토 위원회(승인 번호: 2024022601)의 승인을 받았습니다. 참가자들은 정보에 입각한 동의를 제공했습니다.

1. 프라이머 디자인

1. 종래의 프라이머 디자인: 보고된 프라이머 디자인 규칙²⁰, NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)에 의한 프라이머 디자인에 따른 프라이머 디자인. RHOA G17V의 돌연변이 부위의 경우, 기존 프라이머 설계를 위한 모든 참조 염기서열은 돌연변이된 염기서열입니다. 설계된 역증폭 프라이머에 돌연변이 부위 염기서열이 포함되어 있고 프라이머의 어닐링 온도가 약 60°C인지 확인합니다.
2. BDA 프라이머 디자인
   1. 2-4개의 변형된 염기와 A와 T로 구성된 변형된 염기를 포함하는 약 20-30개의 염기쌍(bp) 길이로 야생 차단 프라이머를 설계합니다. 차단 프라이머가 돌연변이 증폭 프라이머와 경쟁하는 데 사용되는 돌연변이 증폭 프라이머와 6-....

토론

이 기사에서 설명하는 BDA 기술을 기반으로 한 WTB-PCR은 기존 프라이머를 설계할 때 돌연변이형을 보완하는 불일치 프라이머를 도입하여 야생형과 경쟁하고, 야생형을 억제하고, 돌연변이 산물을 증폭합니다. 그런 다음 돌연변이 분석을 위해 WTB-PCR 산물의 염기서열을 분석했습니다. WTB-PCR/Sanger의 유용성은 단순성과 높은 감도입니다. 이 논문에서 확립된 검출 체계에 따르?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen