PCR bloccante wild-type combinata con sequenziamento Sanger per il rilevamento di mutazioni somatiche a bassa frequenza

Riepilogo

Questo articolo introduce l'applicazione di un metodo di rilevamento a bassa frequenza basato sul sequenziamento Sanger nel linfoma angioimmunoblastico. Fornire una base per l'applicazione di questo metodo ad altre malattie.

Abstract

Quando si monitora la malattia minima residua (MRD) dopo il trattamento del tumore, ci sono requisiti più elevati del limite inferiore di rilevamento rispetto a quando si rilevano mutazioni di resistenza ai farmaci e mutazioni delle cellule tumorali circolanti durante la terapia. Il sequenziamento Sanger tradizionale ha il 5%-20% di rilevamento di mutazioni wild-type, quindi il suo limite di rilevamento non può soddisfare i requisiti corrispondenti. Le tecnologie di blocco wild-type che sono state segnalate per superare questo problema includono l'amplificazione dello spostamento del bloccante (BDA), l'acido nucleico bloccato non estensibile (LNA), le sonde specifiche per punti caldi (HSSP), ecc. Queste tecnologie utilizzano specifiche sequenze di oligonucleotidi per bloccare o riconoscere il wild-type e quindi combinarle con altri metodi per prevenire l'amplificazione wild-type e amplificare l'amplificazione mutante, portando a caratteristiche come alta sensibilità, flessibilità e convenienza. Questo protocollo utilizza BDA, una PCR bloccante wild-type combinata con il sequenziamento Sanger, per ottimizzare il rilevamento delle mutazioni somatiche a bassa frequenza RHOA G17V e la sensibilità di rilevamento può raggiungere lo 0,5%, il che può fornire una base per il monitoraggio MRD del linfoma angioimmunoblastico a cellule T.

Introduzione

La malattia minima residua (MRD) è il piccolo numero di cellule tumorali che sono ancora presenti nell'organismo dopo il trattamento. A causa del loro piccolo numero, non portano ad alcun segno o sintomo fisico. Spesso non vengono rilevate con i metodi tradizionali, come la visualizzazione microscopica e/o il monitoraggio delle proteine sieriche anomale nel sangue. Un risultato positivo al test MRD indica la presenza di cellule malate residue. Un risultato negativo significa che le cellule malate residue sono assenti. Dopo il trattamento del cancro, le cellule tumorali rimanenti nel corpo possono diventare attive....

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione dell'etica medica dell'ospedale centrale di Yongzhou (numero di approvazione: 2024022601). I partecipanti hanno fornito il consenso informato.

1. Progettazione del primer

1. Progettazione convenzionale del primer: progettazione dei primer secondo le regole di progettazione del primer^{riportate 20}, progettazione del primer di NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome). Per il sito di mutazione di RHOA G17V, tutte le sequenze di riferimento per la proge....

Discussione

La WTB-PCR basata sulla tecnologia BDA, descritta in questo articolo, introduce un primer non corrispondente complementare al tipo mutante quando si progettano primer convenzionali per competere con il tipo selvatico, sopprimere il tipo selvatico e amplificare il prodotto mutante. Quindi, i prodotti WTB-PCR sono stati sequenziati per l'analisi delle mutazioni. L'utilità di WTB-PCR/Sanger è la sua semplicità e l'elevata sensibilità. Secondo lo schema di rilevazione stabilito in questo.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen