PCR bloccante wild-type combinata con sequenziamento Sanger per il rilevamento di mutazioni somatiche a bassa frequenza

Riepilogo

Questo articolo introduce l'applicazione di un metodo di rilevamento a bassa frequenza basato sul sequenziamento Sanger nel linfoma angioimmunoblastico. Fornire una base per l'applicazione di questo metodo ad altre malattie.

Abstract

Quando si monitora la malattia minima residua (MRD) dopo il trattamento del tumore, ci sono requisiti più elevati del limite inferiore di rilevamento rispetto a quando si rilevano mutazioni di resistenza ai farmaci e mutazioni delle cellule tumorali circolanti durante la terapia. Il sequenziamento Sanger tradizionale ha il 5%-20% di rilevamento di mutazioni wild-type, quindi il suo limite di rilevamento non può soddisfare i requisiti corrispondenti. Le tecnologie di blocco wild-type che sono state segnalate per superare questo problema includono l'amplificazione dello spostamento del bloccante (BDA), l'acido nucleico bloccato non estensibile (LNA), le sonde specifiche per punti caldi (HSSP), ecc. Queste tecnologie utilizzano specifiche sequenze di oligonucleotidi per bloccare o riconoscere il wild-type e quindi combinarle con altri metodi per prevenire l'amplificazione wild-type e amplificare l'amplificazione mutante, portando a caratteristiche come alta sensibilità, flessibilità e convenienza. Questo protocollo utilizza BDA, una PCR bloccante wild-type combinata con il sequenziamento Sanger, per ottimizzare il rilevamento delle mutazioni somatiche a bassa frequenza RHOA G17V e la sensibilità di rilevamento può raggiungere lo 0,5%, il che può fornire una base per il monitoraggio MRD del linfoma angioimmunoblastico a cellule T.

Introduzione

La malattia minima residua (MRD) è il piccolo numero di cellule tumorali che sono ancora presenti nell'organismo dopo il trattamento. A causa del loro piccolo numero, non portano ad alcun segno o sintomo fisico. Spesso non vengono rilevate con i metodi tradizionali, come la visualizzazione microscopica e/o il monitoraggio delle proteine sieriche anomale nel sangue. Un risultato positivo al test MRD indica la presenza di cellule malate residue. Un risultato negativo significa che le cellule malate residue sono assenti. Dopo il trattamento del cancro, le cellule tumorali rimanenti nel corpo possono diventare attive e iniziare a moltiplicarsi, causando una ricaduta della malattia. Il rilevamento della MRD è indicativo che il trattamento non è stato completamente efficace o che il trattamento è stato incompleto. Un altro motivo per i risultati positivi alla MRD dopo il trattamento potrebbe essere che non tutte le cellule tumorali hanno risposto alla terapia o perché le cellule tumorali sono diventate resistenti ai farmaci utilizzati¹.

Il linfoma angioimmunoblastico a cellule T (AITL) è un sottotipo di linfoma periferico a cellule T (PTCL) derivato dalle cellule T follicolari helper²; è il tipo più comune di linfoma a cellule T, rappresentando circa il 15%-20% del PTCL³. È un gruppo di tumori maligni correlati che colpiscono il sistema linfatico. La cellula di origine è la cellula T helper follicolare. La classificazione dell'OMS del 2016 lo classifica come linfoma angioimmunoblastico a cellule T⁴. Nel 2022, l'OMS lo ha rinominato linfoma a cellule helper follicolari nodali, di tipo angioimmunoblastico (nTFHL-AI), insieme a linfoma a cellule helper follicolari nodali, di tipo follicolare (nTFHL-F) e linfoma a cellule helper follicolari nodali, non altrimenti specificato (nTFHL-NOS), collettivamente denominati linfoma a cellule T helper follicolari nodulari (nTFHL). Questo è stato fatto per identificare le sue importanti caratteristiche cliniche e immunofenotipiche e le firme di espressione genica dell'helper follicolare T (TFH) e i mutanti simili. Geneticamente, nTFHL-AI è caratterizzata dalla progressiva acquisizione di mutazioni somatiche nelle cellule staminali ematopoietiche precoci attraverso mutazioni TET2 e DNMT3A, mentre le mutazioni RHOA e IDH2 sono presenti anche nelle cellule tumorali TFH⁵. Diversi studi hanno dimostrato che la mutazione RHOA G17V si verifica nel 50%-80% dei pazienti AITL 6,7,8,9. La proteina RHOA codificata dal gene RHOA è attivata dal legame con la guanosina trifosfato (GTP) e inattivata dal legame con la guanosina difosfato (GDP). Quando attivato, può legarsi a una varietà di proteine effettrici e regolare una varietà di processi biologici. Fisiologicamente, RHOA media la migrazione e la polarità delle cellule T, svolge un ruolo nello sviluppo dei timociti e media l'attivazione della segnalazione del pre-recettore delle cellule T (pre-TCR)¹⁰. La mutazione RHOA G17V è una mutazione con perdita di funzione che svolge un ruolo determinante nella patogenesi del linfoma¹¹. L'individuazione della sua mutazione a bassa frequenza è utile per il monitoraggio MRD di AITL.

Il sequenziamento Sanger è stato utilizzato per più di 40 anni come gold standard per il rilevamento di mutazioni note e sconosciute. Tuttavia, il suo limite di rilevamento è solo del 5%-20%, il che limita la sua applicazione per il rilevamento di mutazioni a bassa frequenza^12,13. Nel sequenziamento Sanger, la sensibilità di rilevamento può essere ridotta allo 0,1% sostituendo la PCR tradizionale con BDA, una tecnologia di blocco selvaggio¹⁴. La tecnologia BDA aggiunge principalmente un primer non corrispondente complementare al tipo mutante quando si progettano primer convenzionali per competere con il tipo selvatico in modo da raggiungere lo scopo di amplificare il tipo mutante. La chiave per la progettazione dell'innesco è l'innesco non corrispondente e la modifica del terminale. Allo stesso tempo, secondo il principio strutturale del DNA, la differenza tra l'energia libera di Gibbs dei due primer è compresa tra 0,8 kcal/mol e 5 kcal/mol. Un altro passo chiave in questa tecnica è quello di sopprimere l'amplificazione wild-type regolando il rapporto tra i primer wild-type e quelli bloccanti^14,15.

Attualmente, le comuni tecniche di rilevamento delle mutazioni somatiche a bassa frequenza includono la PCR allele-specifica basata sulla PCR (reazione a catena della polimerasi allele-specifica, ASPCR), la PCR del sistema di mutazione refrattario all'amplificazione (amplification-refractory mutation system-PCR, ARMS-PCR) utilizzata per la genotipizzazione degli SNP con l'aiuto di primer refrattari. La progettazione di primer per gli alleli mutanti e normali consente l'amplificazione selettiva e la PCR digitale (Droplet Digital PCR, ddPCR), un metodo per eseguire la PCR digitale basato sulla tecnologia delle gocce di emulsione acqua-olio¹⁶. Un campione viene frazionato in 20.000 goccioline e per ogni gocciolina viene eseguita un'amplificazione PCR delle molecole stampo con una sensibilità di 1 x ^10-5; l'amplificazione dello spostamento del bloccante (BDA) è anche un metodo di arricchimento di alleli rari basato sulla PCR utilizzato per il rilevamento e la quantificazione accurati di SNV e indel fino allo 0,01% di VAF in un ambiente altamente multiplexato; la tecnologia degli acidi nucleici bloccati (acido nucleico bloccato non estensibile, LNA), è una classe di analoghi dell'RNA ad alta affinità in cui l'anello ribosio è bloccato nella conformazione ideale per il legame di Watson-Crick; le sonde hotspot-specifiche (Hot-Spot-Specific Probe, HSSP), si sovrappongono alla sequenza del primer target, includono una singola mutazione e sono modificate con un distanziatore C3 ^{all'estremità} C3' per prevenire l'amplificazione mediante qPCR 14,16,17,18. Quando esiste una mutazione nella sequenza, l'HSSP si attacca in modo competitivo alla mutazione bersaglio e impedisce al primer di legarsi alla sequenza mutante bersaglio, interrompendo l'amplificazione della sequenza; NGS (next-generation sequencing) - based immunoglobulin high-throughput sequencing (igHTS) Cancer Personalized Profiling by Deep Sequencing (CAAP-seq), è un metodo basato sul sequenziamento di nuova generazione utilizzato per quantificare il DNA circolante nelle cellule tumorali (la sensibilità è 1 x ^10-4); and so on. Tra questi, la maggior parte dei metodi si basa sulla PCR e può rilevare solo un piccolo numero di siti di mutazione, mentre i metodi basati su NGS possono rilevare più siti, ma il costo è elevato e il processo è complicato 14,16,17,18. Ci sono state segnalazioni sul rilevamento di mutazioni a bassa frequenza RHOA G17V basate sulla qPCR, ma il limite di rilevamento può raggiungere solo circa il 2%¹⁹. Non esiste un rapporto sul rilevamento della mutazione a bassa frequenza RHOA G17V basata sul sequenziamento Sanger. Qui, dimostriamo l'aumento della sensibilità raggiunto da BDA, una PCR a blocchi wild-type combinata con il sequenziamento Sanger, per ottimizzare il rilevamento delle mutazioni somatiche a bassa frequenza RHOA G17V, e la sensibilità di rilevamento può raggiungere lo 0,5%. Vengono forniti anche dati aggiuntivi per IDH2 e JAK1.

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato dello schema di rilevamento a bassa frequenza RHOA G17V mediante sequenziamento Sanger e fornisce un riferimento per lo sviluppo di un rilevamento di mutazioni a bassa frequenza più ampio basato sulla piattaforma di sequenziamento Sanger. Questo metodo può essere utilizzato per rilevare e monitorare possibili mutazioni di resistenza ai farmaci e residui minimi nei tumori.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione dell'etica medica dell'ospedale centrale di Yongzhou (numero di approvazione: 2024022601). I partecipanti hanno fornito il consenso informato.

1. Progettazione del primer

1. Progettazione convenzionale del primer: progettazione dei primer secondo le regole di progettazione del primer^{riportate 20}, progettazione del primer di NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome). Per il sito di mutazione di RHOA G17V, tutte le sequenze di riferimento per la progettazione di primer convenzionali sono la sequenza base mutata. Assicurarsi che i primer di amplificazione inversa progettati contengano la sequenza del sito di mutazione e che la temperatura di ricottura dei primer sia di circa 60 °C.
2. Design del primer BDA
   1. Progetta il primer bloccante selvaggio con una lunghezza di circa 20-30 paia di basi (bp), contenente 2-4 basi modificate e le basi modificate composte da A e T. Assicurati che il primer bloccante abbia 6-14 bp sovrapposti al primer di amplificazione della mutazione, utilizzato per competere con il primer di amplificazione della mutazione.
   2. Progettare il primer con una temperatura di ricottura per i primer di amplificazione mutante progettati per finali e i primer di blocco selvaggio impostati a circa 60 °C e la differenza di energia libera di Gibbs tra 0,8-5 kcal/mol. Per le regole di calcolo dettagliate, fare riferimento alla letteratura¹⁵.
      NOTA: Quando i primer progettati non soddisfano le condizioni di cui sopra, le basi possono essere aggiunte o sottratte manualmente per la regolazione. L'elenco finale dei primer progettati è mostrato nella Tabella 1 e nella Tabella 2.

2. Preparazione del campione ed estrazione del DNA

NOTA: I campioni di verifica sperimentale provengono tutti da campioni di sangue periferico, midollo osseo o tumori solidi di pazienti con linfoma umano. Ci sono stati 10 campioni positivi: 3 erano campioni di tumori solidi, 4 erano campioni di midollo osseo e 3 erano campioni di sangue periferico. Ci sono 30 campioni negativi di persone sane.

1. Estrazione di campioni di midollo osseo e sangue periferico
   1. Aggiungere 400 μl di campione di midollo osseo o di sangue periferico e reagenti nelle provette corrispondenti in base ai requisiti ed estrarre secondo la procedura di estrazione del produttore.
   2. Preparare nuove provette per campioni e provette per microcentrifuga da 1,5 mL. Numerare le provette del campione da 1 a 24. Contrassegnare i coperchi delle provette da 1,5 ml con il nome del campione e la data di estrazione nell'ordine dei nomi sulle provette per la raccolta del sangue corrispondenti. Contrassegnare 1-24 sul lato della provetta della microcentrifuga per il controllo della corrispondenza uno a uno.
   3. Aggiungere 40 μl di soluzione di proteinasi K alla provetta del campione e aggiungere 400 μl di campione di sangue intero (per volumi inferiori a 400 μl, riempire a 400 μl con PBS).
   4. Posizionare la provetta del campione (1-24), la punta della pipetta (compreso il coperchio della pipetta) e la provetta di raccolta nelle posizioni corrispondenti. Estrarre il DNA secondo la procedura del produttore.
2. Estrazione di campioni di formalina-fissata-paraffina (FFPE)
   1. Mettere i campioni e i reagenti nelle provette corrispondenti in base ai requisiti ed estrarre secondo la procedura di estrazione del produttore.
   2. Aggiungere 1,1 mL di tampone di conservazione della proteinasi K (soluzione PK) alla polvere secca della proteinasi K, vortice e mescolare bene per ottenere una soluzione di proteinasi K con una concentrazione di 10 mg/mL. Conservare a -20 °C.
   3. Estrarre la soluzione di proteinasi K e scioglierla completamente a temperatura ambiente. Far funzionare il termostato a secco e impostare la temperatura a 55 °C.
   4. Prendi una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml e scrivi il nome del campione su di essa. Prelevare meno di 30 mg di fazzoletto e metterlo nella provetta da microcentrifuga. Quindi, aggiungere 500 μL di tampone deparaffina e 20 μL di soluzione di proteinasi K alla provetta.
   5. Dopo aver mescolato a vortice per almeno 10 s, posizionare la provetta da microcentrifuga in un termostato asciutto e mantenerla calda a 55 °C per 90 minuti.
   6. Assicurarsi che la colonna rotante si adatti al tubo del filtro. Al termine dell'incubazione, trasferire il campione, compresi il liquido e il tessuto, nella colonna di rotazione. Centrifugare a 16.500 x g per 5 minuti per centrifugare tutto il liquido nel tubo filtrante.
   7. Prendi 1 provetta per campioni (senza tappo) inclusa con il kit e scrivi il nome del campione su di essa. Trasferire il liquido dalla provetta filtrante da 400 μl alla provetta del campione.
   8. Al termine del pretrattamento e della preparazione del campione, posizionare i materiali di consumo e i reagenti corrispondenti nelle posizioni corrispondenti ed eseguire l'estrazione del DNA secondo le istruzioni del produttore.
3. Controllo di qualità del DNA
   1. Misurare la concentrazione e la purezza del DNA estratto e assicurarsi che la concentrazione di DNA sia ≥ 25 ng/μL. Registrare la concentrazione di DNA di ciascun campione e utilizzarlo immediatamente per il rilevamento successivo o congelarlo a -20 °C.
      NOTA: I valori OD260/OD280 sono generalmente utilizzati per testare la purezza dei campioni di DNA. Il valore normale OD260/OD280 è di circa 1,7-1,9, indicando che la purezza del DNA è buona; se il valore OD260/OD280 è ≤1,7, indica che potrebbe esserci una contaminazione proteica; se il valore OD260/OD280 è ≥2,0, indica che potrebbe esserci una contaminazione da RNA o che il DNA è stato degradato.

3. Amplificazione PCR

1. Preparazione dei primer
   1. Preparazione della soluzione madre di primer
      1. Estrarre il primer in polvere secca e centrifugare a 5400-8400 x g per 2-3 min. Controllare il valore nmol del primer e aprire lentamente il coperchio. Utilizzando una pipetta con il corrispondente volume di acqua bidistillata (ddH₂O), che è 10 volte il valore nM, aggiungerlo lentamente lungo la parete della provetta di innesco.
      2. Preparare i primer a 0,1 nM/μL o 100 μM di soluzione madre (ad esempio, il valore nM è 21,1; di conseguenza, l'acqua da aggiungere è 211 μL). Mescolare accuratamente a vortice, quindi centrifugare brevemente per assicurarsi che la soluzione raggiunga il fondo di ciascun pozzetto. Scrivere il nome dell'innesco, i dati di configurazione e la persona di configurazione sul tappo della provetta. Metterlo nel luogo di stoccaggio della soluzione madre corrispondente.
   2. Preparazione della soluzione di lavoro del primer
      1. Pipettare 5 μL di primer diretto, 5 μL di primer inverso, 50 μL di soluzione madre di primer wildtype e 40 μL di ddH₂O in una provetta per microcentrifuga pulita. Pipettare ripetutamente 2x-3x, vorticare per mescolare e centrifugare all'istante.
      2. Scrivere il nome dell'innesco, la data di configurazione e la persona che lo ha configurato sul tappo del tubo e inserirlo nella posizione di stoccaggio corrispondente della soluzione funzionante.
2. Procedura di amplificazione PCR
   1. Per ogni reazione, aggiungere 5 μl di miscela master di enzimi per l'amplificazione della PCR, 1 μl di soluzione di lavoro del primer e 1 μl di stampo di DNA (la quantità di input del modello deve raggiungere i 400 ng, se la concentrazione di DNA non è sufficiente; aumentare il volume di DNA e ridurre il volume di ddH₂O aggiunti) e 3 μl di ddH₂O. Vortex per miscelare e centrifugare istantaneamente.
   2. Posizionare la provetta di reazione PCR sullo strumento PCR preimpostato per l'amplificazione PCR. Impostare il programma del ciclo termico dello strumento PCR come segue ed eseguire:
      95 °C per 3 min; 20 cicli a 95 °C per 30 s, 68 °C per 15 s (diminuzione di 0,5 °C per ciclo), 72 °C per 1 min; 16 cicli di 95 °C per 30 s, 58 °C per 15 s, 72 °C per 1 min; e 72 °C per 10 min.
3. Eseguire l'elettroforesi su gel sul prodotto PCR con agarosio al 2% per verificare se il frammento target è amplificato.
4. Purificazione di prodotti PCR
   1. Portare purificare I e purificare II a temperatura ambiente e centrifugare immediatamente. Preparare la reazione di purificazione del prodotto PCR come segue: 1 μL di purificato I, 0,5 μL di purificato II, 3 μL di prodotto PCR e 3,5 μL di ddH₂O.
   2. Posizionare la provetta di reazione PCR sullo strumento PCR preimpostato per l'amplificazione PCR. Impostare il programma del ciclo termico dello strumento PCR come segue ed eseguire la macchina:
      37 °C per 30 min, 95 °C per 15 min.

4. Sequenziamento dei prodotti della PCR dopo la purificazione

1. Sequenziamento
   1. Portare la master mix di enzimi di amplificazione del sequenziamento, il tampone e il ddH₂O a temperatura ambiente. Dopo che il reagente si è liquefatto, centrifugare all'istante.
   2. Preparare il sistema di reazione di sequenziamento come segue: 1,8 μL di tampone di sequenziamento, 0,4 μL di master mix di enzimi di amplificazione del sequenziamento, 1 μL di primer di sequenziamento, 0,8 μL di prodotto PCR purificato e 6 μL di ddH₂O.
   3. Posizionare la provetta di reazione PCR sullo strumento PCR preimpostato per l'amplificazione PCR. Impostare il programma del ciclo termico dello strumento PCR come segue ed eseguire: 96 °C per 3 min; 28 cicli a 96 °C per 25 s, 56 °C per 15 s, 60 °C per 4 min.
   4. Al termine della reazione di sequenziamento, rimuovere il prodotto dallo strumento PCR. Conservare i prodotti di reazione in frigorifero, al riparo dalla luce.
2. Purificazione dei prodotti di sequenziamento
   1. Agitare accuratamente le perline magnetiche. Aggiungere 10 μl di microsfere magnetiche e 40 μl di alcol all'80% alla piastra a 96 pozzetti e sigillare la piastra con una pellicola.
   2. Posizionare la piastra a 96 pozzetti con perline magnetiche e alcol sull'agitatore a vortice per 10 s per sospendere e mescolare completamente le perle magnetiche (osservando se c'è precipitazione di microsfere magnetiche sul fondo e facendo attenzione a non far cadere il liquido sulla pellicola sigillante). Mettilo su un oscillatore orizzontale e legalo con un elastico per farlo vibrare per 3-5 minuti (marcia massima).
   3. Dopo l'oscillazione, posizionare la piastra PCR sul supporto magnetico, prestare attenzione a premerla saldamente. Mantenere il supporto a 4 °C per l'adsorbimento statico per 3 minuti e, dopo che le perle magnetiche sono state tutte adsorbite sulla parete, rimuovere la pellicola sigillante e versare il liquido di scarto.
   4. Aggiungere 40 μl di alcol all'80% alla piastra PCR, sciacquare le perle e versare il liquido di scarto. Posizionare la piastra su carta assorbente e tamponarla delicatamente (non lasciare che la piastra PCR si separi dal disco). Ripeti 1 volta.
   5. Mettere la carta assorbente capovolta insieme alla piastra magnetica nella centrifuga a 120 x g per una rotazione rapida.
   6. Mettere la piastra PCR contenente le microsfere magnetiche dopo aver rimosso l'alcol nel forno a 60 °C per 3-5 minuti. Asciugare completamente le perline.
      NOTA: Se non c'è il forno, posizionare la piastra a temperatura ambiente per 10 minuti.
   7. Aggiungere 40 μL di acqua pura dopo l'essiccazione. Posizionare la pellicola sigillante sulla piastra e agitarla su uno shaker a vortice per 3-5 s. Mettere la piastra su uno shaker orizzontale, legarla saldamente e agitarla per 3-5 minuti per sciogliere il prodotto di sequenziamento purificato.
   8. Centrifugare il prodotto di sequenziamento disciolto a 180 x g e utilizzare il prodotto per l'analisi genomica utilizzando l'elettroforesi capillare²¹ (si noti che il disco di supporto deve essere aggiunto alla scheda del campione).
3. Analisi dei risultati del sequenziamento
   1. Ottenere i risultati del sequenziamento dal software. Fare riferimento al manuale del software per le procedure operative dettagliate. Utilizzare la sequenza di riferimento di NCBI.

Risultati

Confrontare la sequenza del campione di prova con la sequenza di riferimento per ottenere lo stato di mutazione del campione di prova. La tecnologia WBT-PCR basata su BDA è in grado di rilevare la mutazione nota RHOA G17V e altre mutazioni a bassa frequenza nell'intervallo di amplificazione dei primer a monte e a valle. Vedere la Figura 1. Con questo metodo sono stati analizzati anche altri due geni, ovvero IDH2 e JAK1, rispettivamente

Discussione

La WTB-PCR basata sulla tecnologia BDA, descritta in questo articolo, introduce un primer non corrispondente complementare al tipo mutante quando si progettano primer convenzionali per competere con il tipo selvatico, sopprimere il tipo selvatico e amplificare il prodotto mutante. Quindi, i prodotti WTB-PCR sono stati sequenziati per l'analisi delle mutazioni. L'utilità di WTB-PCR/Sanger è la sua semplicità e l'elevata sensibilità. Secondo lo schema di rilevazione stabilito in questo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleic acid detector	Q32854	Thermo fisher
PCR amplification kit	P4600	merck
PCR instrument	C1000 Touch	Biorad
proteinase K solution	D3001-2-A	zymo research
proteinase K storage buffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing amplification enzyme kit	P7670-FIN	Qiagen