تحضير بذور النخيل الصلبة لتحليل قياس الطيف الكتلي بالليزر بمساعدة المصفوفة / تصوير التأين

Summary

يهدف هذا البروتوكول إلى وصف إرشادات مفصلة حول تحضير أقسام عينات البذور الصلبة ذات المحتوى المائي المنخفض لتحليل نظام الرصد الدولي MALDI-IMS ، والحفاظ على التوزيع الأصلي للتحليلات ووفرتها وتوفير إشارة عالية الجودة ودقة مكانية.

Abstract

يتم تطبيق قياس الطيف الكتلي للامتزاز بالليزر / تصوير التأين بمساعدة المصفوفة (MALDI-IMS) لتحديد المركبات في بيئاتها الأصلية. وكثيرا ما يستخدم نظام الرصد الدولي حاليا في التحليل السريري. ومع ذلك ، يوجد منظور ممتاز لتطبيق هذه التقنية بشكل أفضل لفهم المعلومات الفسيولوجية للمركبات الكيميائية في الأنسجة النباتية. ومع ذلك، قد يكون التحضير صعبا بالنسبة لعينات محددة من المواد النباتية، حيث يتطلب نظام الرصد الدولي التابع ل MALDI شرائح رقيقة (12-20 ميكرومتر) للحصول على البيانات المناسبة والتحليل الناجح. وبهذا المعنى، قمنا سابقا بتطوير بروتوكول تحضير العينات للحصول على مقاطع رقيقة من البذور الصلبة Euterpe oleracea (نخيل الأساي)، مما يتيح رسم الخرائط الجزيئية بواسطة MALDI-IMS.

هنا ، نظهر أن البروتوكول المطور مناسب لإعداد بذور أخرى من نفس الجنس. باختصار ، استند البروتوكول إلى غمر البذور في ماء منزوع الأيونات لمدة 24 ساعة ، وتضمين عينات بالجيلاتين ، وتقسيمها في جهاز تبريد متأقلم. بعد ذلك ، لترسب المصفوفة ، تم إقران منصة حركة xy برذاذ إبرة التأين بالرش الكهربائي (ESI) باستخدام حمض 1: 1 (v / v) 2،5-dihydroxybenzoic (DHB) ومحلول ميثانول مع 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك عند 30 مجم / مل. تمت معالجة بيانات بذور E. precatoria و E. edulis باستخدام برنامج لرسم خريطة لأنماط الأيض الخاصة بهم.

تم تعيين الأوليغومرات السداسية داخل شرائح العينة لإثبات كفاية البروتوكول لتلك العينات ، حيث من المعروف أن تلك البذور تحتوي على كميات كبيرة من المنان ، وهو بوليمر من المانوز السداسي. نتيجة لذلك ، تم تحديد قمم oligomers hex ، ممثلة ب [M + K] ⁺ adducts من (Δ = 162 Da). وهكذا، فإن بروتوكول تحضير العينات، الذي سبق تطويره خصيصا لبذور E. oleracea ، مكن أيضا من تحليل MALDI-IMS لبذرتين أخريين من بذور النخيل الصلب. باختصار ، يمكن أن تشكل الطريقة أداة قيمة للبحث في علم التشريح المورفولوجي وعلم وظائف الأعضاء للمواد النباتية ، خاصة من العينات المقاومة للقطع.

Introduction

يعد قياس الطيف الكتلي للتصوير بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI-IMS) طريقة قوية تسمح بتعيين جزيء حيوي ثنائي الأبعاد ، وتوفر فحصا غير مستهدف للمركبات المؤينة ، وتحدد توزيعها المكاني ، خاصة في العينات البيولوجية ^1,2. على مدى عقدين من الزمن ، مكنت هذه التقنية من الكشف والتعرف في وقت واحد على الدهون والببتيدات والكربوهيدرات والبروتينات والمستقلبات الأخرى والجزيئات الاصطناعية مثل الأدوية العلاجية ^3,4. يسهل MALDI-IMS التحليل الكيميائي في سطح عينة الأنسجة دون عوامل استخراج أو تنقية أو فصل أو وضع العلامات أو تلطيخ العينات البيولوجية. ومع ذلك ، من أجل التحليل الن....

Protocol

تم التبرع ببذور Euterpe precatoria من قبل المعهد الوطني ل Pesquisas da Amazônia (ماناوس ، البرازيل) ، وتم التبرع ببذور Euterpe edulis من قبل Silo - Arte e Latitude Rural (Resende ، البرازيل) بعد عملية إزالة اللب الصناعي. تم حفظ البذور في صناديق بلاستيكية محكمة الغلق في درجة حرارة الغرفة.

1. التحليل الطيفي الكتلي للتصوير بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI-IMS)

1. بروتوكول تقسيم البذور
   1. اترك ثلاث بذور من كل نوع تجلس في ماء منزوع الأيونات لمدة 24 ساعة.
   2. في اليوم التالي ، قم بتشغيل cryostat (انظر جدول المواد) واتركه يصل إلى -20 درجة مئوية.
   3. أخرج البذور الرطبة من ا....

النتائج

وقد مكن البروتوكول المبتكر نظام الرصد الدولي من تحليل نظام الرصد الدولي التابع ل MALDI-IMS لبذور E. precatoria و E. edulis. نتيجة لذلك ، يمكننا تأكيد الوزن الجزيئي للكربوهيدرات ودرجة البلمرة (DP) كتوضيح هيكلي جزئي. أظهرت المعلومات الجزيئية المقدمة من تحليل MALDI-IMS (الشكل 1

Discussion

تتكون النباتات من أنسجة متخصصة لوظائف كيميائية حيوية محددة. ولذلك، يجب تصميم بروتوكول تحضير العينات لنظام الرصد الدولي التابع ل MALDI-IMS وفقا لمختلف الأنسجة النباتية ذات الخواص الفيزيائية والكيميائية المحددة، حيث يجب أن تحافظ العينات على توزيعها الأصلي للتحليل ووفرتها للحصول على إشارة عا?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	149357
APCI needle	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	602193
AxiDraw V3 xy motion platform	Evil Mad Scientist, CA, USA	2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software			creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape	3M, USA	1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		image acquisition
FTMS Processing	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		data calibration
Gelatin from bovine skin	Sigma Aldrich Co, MO, USA	G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany	0358 38926
indium tin oxide coated glass slide	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8237001
Inkscape	Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter	Buehler, Illinois, USA
Methanol	J.T.Baker	9093-03
Mili-Q water			18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher HealthCare, Texas, USA	4585
Parafilm "M" Sealing Film	Amcor	HS234526B
Quanta 450 FEG	FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V	Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump	kdScientific, MA, USA	78-9100K
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	302031
X-Max spectrometer	Oxford Instruments, Ableton, UK