Preparazione di semi di palma dura per l'analisi di spettrometria di massa con desorbimento/ionizzazione-imaging laser assistita da matrice

Riepilogo

Questo protocollo mirava a descrivere una guida dettagliata sulla preparazione di sezioni di campioni di semi duri a basso contenuto d'acqua per l'analisi MALDI-IMS, mantenendo la distribuzione e l'abbondanza originali degli analiti e fornendo un segnale di alta qualità e una risoluzione spaziale.

Abstract

La spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione-imaging laser assistita da matrice (MALDI-IMS) viene applicata per identificare i composti nei loro ambienti nativi. Attualmente, MALDI-IMS è frequentemente utilizzato nelle analisi cliniche. Tuttavia, esiste un'ottima prospettiva per una migliore applicazione di questa tecnica per comprendere le informazioni fisiologiche dei composti chimici nei tessuti vegetali. Tuttavia, la preparazione può essere impegnativa per campioni specifici da materiali botanici, poiché MALDI-IMS richiede fette sottili (12-20 μm) per un'acquisizione dati appropriata e un'analisi di successo. In questo senso, in precedenza, abbiamo sviluppato un protocollo di preparazione del campione per ottenere sezioni sottili di semi duri di Euterpe oleracea (palma açaí), consentendo la loro mappatura molecolare mediante MALDI-IMS.

Qui, mostriamo che il protocollo sviluppato è adatto per la preparazione di altri semi dello stesso genere. In breve, il protocollo si basava sull'immersione dei semi in acqua deionizzata per 24 ore, sull'inclusione di campioni con gelatina e sul sezionamento in un criostato acclimatato. Quindi, per la deposizione della matrice, una piattaforma di movimento xy è stata accoppiata a uno spruzzo ad ago a ionizzazione elettrospray (ESI) utilizzando una soluzione di acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB) e metanolo 1:1 (v/v) con acido trifluoroacetico allo 0,1% a 30 mg/mL. I dati dei semi di E. precatoria ed E. edulis sono stati elaborati utilizzando un software per mappare i loro modelli di metaboliti.

Gli oligomeri di esoso sono stati mappati all'interno di fette di campione per dimostrare l'adeguatezza del protocollo per quei campioni, poiché è noto che quei semi contengono grandi quantità di mannano, un polimero dell'esoso mannosio. Di conseguenza, sono stati identificati picchi di oligomeri esosi, rappresentati da addotti [M + K]⁺ di (Δ = 162 Da). Pertanto, il protocollo di preparazione del campione, precedentemente sviluppato su misura per i semi di E. oleracea , ha consentito anche l'analisi MALDI-IMS di altri due semi di palma dura. In breve, il metodo potrebbe costituire un valido strumento per la ricerca nella morfo-anatomia e fisiologia dei materiali botanici, in particolare da campioni resistenti al taglio.

Introduzione

La spettrometria di massa a desorbimento/ionizzazione-imaging laser assistita da matrice (MALDI-IMS) è un metodo potente che consente l'assegnazione bidimensionale di biomolecole, fornisce un'indagine non mirata di composti ionizzabili e determina la loro distribuzione spaziale, specialmente nei campioni biologici ^1,2. Per due decenni, questa tecnica ha permesso il rilevamento e l'identificazione simultanei di lipidi, peptidi, carboidrati, proteine, altri metaboliti e molecole sintetiche come i farmaci terapeutici ^3,4. MALDI-IMS facilita l'analisi chimica sulla superficie di un campione di tessuto senza estrazione, purificazione, separazione, etichettatura o colorazione dei campioni biologici. Tuttavia, per un'analisi di successo, un passaggio fondamentale in questa tecnica è la preparazione del campione, in particolare nei tessuti vegetali, che sono specializzati e modificati in organi complessi diffusi a causa dell'acclimatazione ambientale⁵.

A causa delle proprietà fisico-chimiche intrinseche dei tessuti vegetali, è necessario un protocollo adattato per soddisfare i requisiti dell'analisi MALDI-IMS e preservare la forma originale del tessuto durante la preparazione del sezionamento ^6,7. Nel caso di campioni non convenzionali, come i semi, i protocolli stabiliti⁸ non sono applicabili perché questi tessuti hanno pareti cellulari rigide e un basso contenuto di acqua, che possono facilmente causare la frammentazione della sezione e portare alla delocalizzazione del composto⁹.

Il nostro gruppo di ricerca ha pubblicato dati sperimentali sulla mappatura molecolare e un protocollo adattato per l'analisi MALDI-IMS del seme di açaí (Euterpe oleracea Mart.) 10,11,12, che è un sottoprodotto generato in quantità elevate durante la produzione della polpa di açaí¹³ affittabile. L'idea era quella di sviluppare un protocollo per la mappatura in situ di diversi metaboliti nei semi di açaí, contribuendo a suggerire possibili usi per questi scarti agricoli che attualmente non sono in fase di esplorazione commerciale. Tuttavia, a causa della resistenza del seme di açaí, è stato necessario creare un protocollo su misura per ottenere un corretto sezionamento del campione dall'analisi MALDI-IMS.

In questo contesto, la polpa di açaí, importante dal punto di vista economico, ha motivato la crescente commercializzazione di altri frutti di palme del genere Euterpe con caratteristiche organolettiche simili. I frutti delle due palme emergenti che sono stati prodotti su scala industriale in alternativa all'açaí^14,15 sono E. precatoria (nota come açaí-do-amazonas), che cresce nelle zone aride dell'Amazzonia, ed E. edulis (nota come juçara), tipica della foresta atlantica. Tuttavia, il consumo di açaí-do-amazonas e juçara porta allo stesso accumulo di semi resistenti e non commestibili che non vengono utilizzati e non sono stati studiati finora per quanto riguarda la loro composizione chimica dettagliata.

Pertanto, dimostriamo qui che il protocollo precedentemente ideato può essere utilizzato, con pochi adattamenti, per analizzare i semi di E. precatoria ed E. edulis per la mappatura molecolare da parte di MALDI-IMS, dimostrando di essere un potente strumento che può essere utilizzato per l'analisi della composizione di queste risorse e può aiutare a determinare i loro potenziali usi biotecnologici. Inoltre, la descrizione dettagliata qui fornita può aiutare altri con difficoltà simili nella preparazione di materiali resistenti per l'analisi MALDI-IMS.

Protocollo

I semi di Euterpe precatoria sono stati gentilmente donati dall'Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Manaus, Brasile), e i semi di Euterpe edulis sono stati gentilmente donati dal Silo - Arte e Latitude Rural (Resende, Brasile) dopo il processo di spolpamento industriale. I semi sono stati conservati in scatole di plastica sigillate a temperatura ambiente.

1. Spettroscopia di massa per desorbimento/ionizzazione-imaging laser assistita da matrice (MALDI-IMS)

1. Protocollo di sezionamento del seme
   1. Lasciare riposare tre semi di ciascuna specie in acqua deionizzata per 24 ore.
   2. Il giorno dopo, accendere il criostato (vedi Tabella dei materiali) e lasciarlo raggiungere i -20 °C.
   3. Togli i semi bagnati dall'acqua. Tagliare i semi a metà con una lama per microtomo (vedi Tabella dei materiali).
   4. Preparare una soluzione di gelatina fresca e tiepida (10%) (vedere Tabella dei materiali).
   5. Mettere metà del seme su uno stampo e riempirlo con la gelatina fresca. Congelare a -80 °C per 2 ore prima di passare al criostato.
   6. Fissare il seme incorporato al supporto del criostato utilizzando un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT, vedere la tabella dei materiali) e lasciare per 10 minuti all'interno del criostato per l'indurimento dell'OCT.
   7. Aggiungere del nastro biadesivo in rame (vedi Tabella dei materiali) a un vetrino rivestito di ossido di indio-stagno (vetrino ITO; vedi Tabella dei materiali).
   8. Produrre sezioni spesse 20 μm da ciascuna specie e posizionarle sul nastro biadesivo in rame incollato al vetrino ITO.
      NOTA: A questo punto le fette raccolte sui vetrini possono essere conservate in congelatore a -80 °C; In alternativa, procedere alla deposizione della matrice. I vetrini devono essere collocati in una scatola portavetrini, lavati con N₂ gassoso e sigillati con pellicola per evitare l'ossidazione del campione (vedere la tabella dei materiali).
2. Deposizione di matrici
   1. Mettere il vetrino contenente le fette in un essiccatore sottovuoto fino a quando non raggiunge la temperatura ambiente.
   2. Segna i segni di insegnamento usando una penna di correzione in ogni angolo della diapositiva. Eseguire la scansione del vetrino utilizzando uno scanner da tavolo. Impostare la risoluzione di 4.800 ppi.
   3. Utilizzare una bilancia analitica per pesare 30 mg di acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB; vedere Tabella dei materiali) e preparare 1 mL di metanolo:0,1% acido trifluoroacetico (TFA) 1:1 Tabella dei materiali) soluzione per sciogliere il DHB.
   4. Riempire una siringa di vetro da 1 mL (vedere la tabella dei materiali) con la soluzione DHB e posizionarla in una pompa a siringa (vedere la tabella dei materiali) impostata su una portata di 0,8 ml/h.
   5. Utilizzando un tubo in PEEK, collegare la siringa a un ago a ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) (vedere Tabella dei materiali).
   6. Collegare N₂ all'ago APCI e impostarlo su una portata di 12.5 psi .
   7. Fissare l'ago APCI alla piattaforma xy motion (vedere la tabella dei materiali). Assicurarsi che la punta dell'ago APCI sia 4 cm sopra il vetrino.
   8. Utilizzando il software di disegno (vedere la Tabella dei materiali e la Figura supplementare 1), impostare la piattaforma di movimento xy in modo che segua il modello. La dima è costituita da linee orizzontali parallele distanziate di 1 mm.
   9. Per ottenere la deposizione della matrice, attendere che la piattaforma di movimento xy ripeta il modello 20 volte.
      ATTENZIONE: La deposizione della matrice deve essere effettuata in una cappa chimica.
3. Acquisizione di immagini
   1. Posizionare il vetrino nello spettrometro di massa (vedere Tabella dei materiali).
   2. Utilizzare i segni di correzione della penna per impostare i punti di insegnamento sul software di riferimento (vedere Tabella dei materiali).
   3. Impostare la potenza del laser (60%), la messa a fuoco del laser (media), il numero di scatti (100) e la polarità nel software (vedere la tabella dei materiali). Impostare il fattore di riduzione dei dati del 99% e salvare il file FID per la calibrazione dei dati a posteriori. Salvare il metodo.
   4. Delimitare l'area da analizzare utilizzando lo strumento Aggiungi regione di misurazione poligonale del software dello spettrometro di massa. Modificare i parametri della regione di misurazione indicando il metodo salvato nel passaggio precedente e la larghezza del raster a 100 μm (Figura supplementare S4A).
   5. Avviare l'acquisizione delle immagini.
4. Analisi dei dati
   1. Utilizzare il cluster di matrici e i contaminanti noti per creare un elenco di massa nel software di riferimento (vedere la tabella dei materiali) nella scheda del calibrante (Figura supplementare S4B).
      1. Aprire i dati da calibrare nel software di riferimento (vedere Tabella dei materiali). Nella scheda Calibrazione , aprire l'elenco delle masse creato e aprire una finestra di dialogo facendo clic con il pulsante destro del mouse e scegliendo l'opzione Imposta masse di blocco (Figura supplementare S4C).
      2. Selezionare la modalità finestra gaussiana con allargamento gaussiano di 0,5 e allargamento linea di 3,5. Lasciare deselezionata la calibrazione online. Selezionare la modalità (singola), la soglia (1.000) e la tolleranza di massa (5 ppm). Calibrare i dati con il processo e salvare lo strumento dati 2D (Figura supplementare S4C).
   2. Dopo la calibrazione, esportare i dati nel laboratorio SCiLS o in un altro software compatibile e impostare la soglia del valore m/z desiderata (intervallo scelto: da 150 a 2.500).
      N.B.: A seconda delle dimensioni del file o delle caratteristiche del computer, l'operazione potrebbe richiedere del tempo.
   3. Scegli un metodo di normalizzazione tra il conteggio ionico totale (TIC) o il quadrato medio (RMS).
      NOTA: Per questa analisi è stato scelto il TIC.
   4. Se gli analiti da mappare sono noti, tracciare ogni valore m/z per ciascun analita e salvare le immagini generate e il grafico della media spettrale.
      NOTA: In questo lavoro, i valori di m/z degli oligomeri di esoso sono stati scelti considerando l'addotto di potassio.

2. Spettroscopia a dispersione di energia (EDS)

1. Protocollo di sezionamento del seme
   1. Procurarsi una fetta sottile di seme in una sega sezionatrice (vedi Tabella dei materiali).
   2. Tagliare i semi con i seguenti parametri: velocità di taglio di 500 giri/min, carica di carico di 100 N e lama diamantata per wafer da 15 HC (vedere la tabella dei materiali).
      NOTA: Gestire la rimozione manuale delle fibre dai semi a causa della necessaria adesione alla tenuta nelle morse di precisione attaccate al goniometro. Pulire la lama prima dell'uso, tagliando una sezione del seme per evitare l'aggiunta di minerali indesiderati durante l'analisi.
   3. Pulire i campioni con aria compressa per rimuovere tutti i residui di particelle dal taglio (vedere la tabella dei materiali).
   4. Fissare una sezione di seme con nastro biadesivo conduttivo in carbonio (vedi Tabella dei materiali) nel supporto.
2. Condizioni di analisi
   1. Fissare il supporto con una sezione di seme all'interno della camera a vuoto di un microscopio elettronico a scansione (SEM) accoppiato con EDS (vedi Tabella dei materiali).
   2. Acquisire micrografie elettroniche su un microscopio modello con un'accelerazione di 20 kV e una dimensione dello spot di 4,0, utilizzando segnali di elettroni secondari (vedi Tabella dei materiali), elettroni retrodiffusi (rivelatore a stato solido fissato sul pezzo polare) e miscele di questi due tipi di segnali (MIX), costruendo immagini colorate artificialmente.
   3. Per l'acquisizione degli spettri EDS, utilizzare uno spettrometro (vedi Tabella dei Materiali) accoppiato al suddetto SEM. La configurazione delle condizioni dell'acquisizione dell'immagine da EDS è la stessa del SEM.
   4. Impostare i gradi di inclinazione, l'elevazione e l'azimut rispettivamente su 0,0, 35,0 e 0,0.
3. Acquisizione dati
   1. Imposta tre diverse aree con ingrandimento 91x della sezione del seme per acquisire i dati.
   2. Identificare i picchi nello spettro al termine dell'acquisizione o durante l'acquisizione. Utilizzare il pulsante del passaggio Conferma elementi per identificare manualmente i picchi.
   3. Impostare il tempo di acquisizione a 60 s per ogni area selezionata. Impostare il tempo di processo su cinque; I parametri sono disponibili per un tempo di processo da uno a sei.
      NOTA: I segni degli elementi sono costanti e si sommano, mentre i rumori sono casuali e deleteri. Più lungo è il tempo di elaborazione, minore è il rumore.
   4. Le impostazioni predefinite per visualizzare risultati quantitativi significativi sono superiori a due sigma (deviazione standard). Impostare due sigma su zero per ridurre i risultati indesiderati.
   5. Normalizza ogni intensità degli elementi; questo è un parametro standardizzato nel software (vedi Tabella dei Materiali).
   6. Per analizzare i dati, esportarli in un file DOC.
4. Analisi dei dati
   1. Garantire la misurazione accurata delle intensità di picco per l'analisi elementare quantitativa.
   2. I picchi sovrapposti richiedono la deconvoluzione per una migliore separazione dei picchi; Sottrarre uno sfondo rumoroso quando necessario.
   3. Quando non c'è sovrapposizione, aumentare il guadagno per amplificare i segnali e migliorare la qualità dello spettro.

Risultati

Il protocollo ideato ha permesso l'analisi MALDI-IMS dei semi di E. precatoria ed E. edulis . Di conseguenza, abbiamo potuto confermare il peso molecolare dei carboidrati e il grado di polimerizzazione (DP) come parziale delucidazione strutturale. Le informazioni molecolari fornite dall'analisi MALDI-IMS (Figura 1 e Figura 2) hanno mostrato picchi che rappresentano addotti [M+K]⁺ di oligomeri esoso (Δ = 162 Da) senz...

Discussione

Le piante sono composte da tessuti specializzati per specifiche funzioni biochimiche. Pertanto, il protocollo di preparazione del campione per MALDI-IMS deve essere progettato in base a vari tessuti vegetali con specifiche proprietà fisico-chimiche, poiché i campioni devono mantenere la distribuzione e l'abbondanza dell'analita originale per un segnale di alta qualità e una risoluzione spaziale⁸.

Prima dell'analisi MALDI-IMS, la considerazione principale è la raccol...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	149357
APCI needle	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	602193
AxiDraw V3 xy motion platform	Evil Mad Scientist, CA, USA	2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software			creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape	3M, USA	1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		image acquisition
FTMS Processing	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		data calibration
Gelatin from bovine skin	Sigma Aldrich Co, MO, USA	G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany	0358 38926
indium tin oxide coated glass slide	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8237001
Inkscape	Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter	Buehler, Illinois, USA
Methanol	J.T.Baker	9093-03
Mili-Q water			18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher HealthCare, Texas, USA	4585
Parafilm "M" Sealing Film	Amcor	HS234526B
Quanta 450 FEG	FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V	Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump	kdScientific, MA, USA	78-9100K
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	302031
X-Max spectrometer	Oxford Instruments, Ableton, UK