Preparação de sementes de palma dura para análise por espectrometria de massa assistida por dessorção/ionização assistida por matriz

Resumo

Este protocolo teve como objetivo descrever orientações detalhadas sobre a preparação de seções de amostras de sementes duras com baixo teor de água para análise de MALDI-IMS, mantendo a distribuição e abundância originais dos analitos e fornecendo sinal de alta qualidade e resolução espacial.

Resumo

A espectrometria de massas com dessorção/ionização-imagem a laser assistida por matriz (MALDI-IMS) é aplicada para identificar compostos em seus ambientes nativos. Atualmente, o MALDI-IMS é frequentemente utilizado em análises clínicas. Ainda assim, existe uma excelente perspectiva para a melhor aplicação desta técnica para o entendimento das informações fisiológicas dos compostos químicos em tecidos vegetais. No entanto, a preparação pode ser desafiadora para amostras específicas de materiais botânicos, pois o MALDI-IMS requer fatias finas (12-20 μm) para aquisição adequada de dados e análise bem-sucedida. Nesse sentido, desenvolvemos previamente um protocolo de preparo de amostras para obtenção de cortes finos de sementes duras de Euterpe oleracea (açaí), possibilitando seu mapeamento molecular pelo MALDI-IMS.

Aqui, mostramos que o protocolo desenvolvido é adequado para o preparo de outras sementes do mesmo gênero. Resumidamente, o protocolo baseou-se na submersão das sementes em água deionizada por 24 h, incorporação das amostras com gelatina e seccionamento em criostático climatizado. Em seguida, para deposição da matriz, uma plataforma de movimento xy foi acoplada a um spray de agulha de ionização por eletrospray (ESI) usando uma solução de ácido 2,5-dihidroxibenzóico (DHB) 1:1 (v/v) e metanol com ácido trifluoroacético a 0,1% a 30 mg/mL. Os dados de sementes de E. precatoria e E. edulis foram processados por meio de software para mapear seus padrões metabólitos.

Oligômeros de hexose foram mapeados dentro de fatias de amostras para comprovar a adequação do protocolo para essas amostras, pois se sabe que essas sementes contêm grandes quantidades de manano, um polímero da hexose manose. Como resultado, foram identificados picos de oligômeros de hexose, representados por adutos [M + K]⁺ de (Δ = 162 Da). Assim, o protocolo de preparo de amostras, previamente desenvolvido sob medida para sementes de E. oleracea , também possibilitou a análise MALDI-IMS de outras duas sementes de palma dura. Em suma, o método pode constituir uma ferramenta valiosa para pesquisas em morfoanatomia e fisiologia de materiais botânicos, especialmente a partir de amostras resistentes a cortes.

Introdução

A espectrometria de massas com dessorção/ionização-imagem a laser assistida por matriz (MALDI-IMS) é um método poderoso que permite a atribuição de biomoléculas bidimensionais, fornece investigação não direcionada de compostos ionizáveis e determina sua distribuição espacial, especialmente em amostras biológicas ^1,2. Há duas décadas, essa técnica tem possibilitado a detecção e identificação simultânea de lipídios, peptídeos, carboidratos, proteínas, outros metabólitos e moléculas sintéticas, como fármacos terapêuticos ^3,4. O MALDI-IMS facilita a anális....

Protocolo

As sementes de Euterpe precatoria foram gentilmente doadas pelo Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Manaus, Brasil), e as sementes de Euterpe edulis foram gentilmente doadas pelo Silo - Arte e Latitude Rural (Resende, Brasil) após o processo de despolpamento industrial. As sementes foram mantidas em caixas plásticas fechadas à temperatura ambiente.

1. Espectroscopia de massa de dessorção/ionização-imagem a laser assistida por matriz (MALDI-IMS)

1. Protocolo de seccionamento de sementes
   1. Deixe três sementes de cada espécie em água deionizada por 24 h.
   2. No dia seguinte, ligue ....

Discussão

As plantas são compostas por tecidos especializados para funções bioquímicas específicas. Portanto, o protocolo de preparação de amostras para MALDI-IMS deve ser desenhado de acordo com vários tecidos vegetais com propriedades físico-químicas específicas, pois as amostras devem manter sua distribuição e abundância originais do analito para sinal de alta qualidade e resolução espacial⁸.

Antes da análise MALDI-IMS, a principal consideração é coletar e .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	149357
APCI needle	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	602193
AxiDraw V3 xy motion platform	Evil Mad Scientist, CA, USA	2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software			creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape	3M, USA	1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		image acquisition
FTMS Processing	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		data calibration
Gelatin from bovine skin	Sigma Aldrich Co, MO, USA	G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany	0358 38926
indium tin oxide coated glass slide	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8237001
Inkscape	Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter	Buehler, Illinois, USA
Methanol	J.T.Baker	9093-03
Mili-Q water			18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher HealthCare, Texas, USA	4585
Parafilm "M" Sealing Film	Amcor	HS234526B
Quanta 450 FEG	FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V	Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump	kdScientific, MA, USA	78-9100K
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	302031
X-Max spectrometer	Oxford Instruments, Ableton, UK