Preparação de sementes de palma dura para análise por espectrometria de massa assistida por dessorção/ionização assistida por matriz

Resumo

Este protocolo teve como objetivo descrever orientações detalhadas sobre a preparação de seções de amostras de sementes duras com baixo teor de água para análise de MALDI-IMS, mantendo a distribuição e abundância originais dos analitos e fornecendo sinal de alta qualidade e resolução espacial.

Resumo

A espectrometria de massas com dessorção/ionização-imagem a laser assistida por matriz (MALDI-IMS) é aplicada para identificar compostos em seus ambientes nativos. Atualmente, o MALDI-IMS é frequentemente utilizado em análises clínicas. Ainda assim, existe uma excelente perspectiva para a melhor aplicação desta técnica para o entendimento das informações fisiológicas dos compostos químicos em tecidos vegetais. No entanto, a preparação pode ser desafiadora para amostras específicas de materiais botânicos, pois o MALDI-IMS requer fatias finas (12-20 μm) para aquisição adequada de dados e análise bem-sucedida. Nesse sentido, desenvolvemos previamente um protocolo de preparo de amostras para obtenção de cortes finos de sementes duras de Euterpe oleracea (açaí), possibilitando seu mapeamento molecular pelo MALDI-IMS.

Aqui, mostramos que o protocolo desenvolvido é adequado para o preparo de outras sementes do mesmo gênero. Resumidamente, o protocolo baseou-se na submersão das sementes em água deionizada por 24 h, incorporação das amostras com gelatina e seccionamento em criostático climatizado. Em seguida, para deposição da matriz, uma plataforma de movimento xy foi acoplada a um spray de agulha de ionização por eletrospray (ESI) usando uma solução de ácido 2,5-dihidroxibenzóico (DHB) 1:1 (v/v) e metanol com ácido trifluoroacético a 0,1% a 30 mg/mL. Os dados de sementes de E. precatoria e E. edulis foram processados por meio de software para mapear seus padrões metabólitos.

Oligômeros de hexose foram mapeados dentro de fatias de amostras para comprovar a adequação do protocolo para essas amostras, pois se sabe que essas sementes contêm grandes quantidades de manano, um polímero da hexose manose. Como resultado, foram identificados picos de oligômeros de hexose, representados por adutos [M + K]⁺ de (Δ = 162 Da). Assim, o protocolo de preparo de amostras, previamente desenvolvido sob medida para sementes de E. oleracea , também possibilitou a análise MALDI-IMS de outras duas sementes de palma dura. Em suma, o método pode constituir uma ferramenta valiosa para pesquisas em morfoanatomia e fisiologia de materiais botânicos, especialmente a partir de amostras resistentes a cortes.

Introdução

A espectrometria de massas com dessorção/ionização-imagem a laser assistida por matriz (MALDI-IMS) é um método poderoso que permite a atribuição de biomoléculas bidimensionais, fornece investigação não direcionada de compostos ionizáveis e determina sua distribuição espacial, especialmente em amostras biológicas ^1,2. Há duas décadas, essa técnica tem possibilitado a detecção e identificação simultânea de lipídios, peptídeos, carboidratos, proteínas, outros metabólitos e moléculas sintéticas, como fármacos terapêuticos ^3,4. O MALDI-IMS facilita a análise química em uma superfície de amostra de tecido sem extração, purificação, separação, rotulagem ou agentes corantes de amostras biológicas. No entanto, para o sucesso da análise, uma etapa fundamental nessa técnica é a preparação de amostras, particularmente em tecidos vegetais, que são especializados e modificados para órgãos complexos difundidos devido à aclimatização ambiental⁵.

Devido às propriedades físico-químicas inerentes ao tecido vegetal, há necessidade de um protocolo adaptado para atender às exigências da análise MALDI-IMS e preservar a forma original do tecido durante^{a preparação da secção6,7}. No caso de amostras não convencionais, como sementes, os protocolos^{estabelecidos8} não são aplicáveis, pois esses tecidos apresentam paredes celulares rígidas e baixo teor de água, o que pode facilmente causar fragmentação dos cortes e levar à deslocalização do composto⁹.

Nosso grupo de pesquisa publicou dados experimentais sobre mapeamento molecular e um protocolo adaptado para análise MALDI-IMS de sementes de açaí (Euterpe oleracea Mart.) 10,11,12, que é um subproduto gerado em grandes quantidades durante a produção da polpa de açaí rentável ¹³. A ideia foi desenvolver um protocolo para mapeamento in situ de diferentes metabólitos em sementes de açaí, ajudando a sugerir possíveis usos para esse resíduo agrícola que ainda não estão sendo explorados comercialmente. No entanto, devido à resistência da semente de açaí, foi necessário adequar um protocolo para obter o corte adequado da amostra a partir da análise do MALDI-IMS.

Nesse contexto, a importância econômica da polpa de açaí tem motivado a crescente comercialização de outros frutos de palmeiras do gênero Euterpe com características sensoriais semelhantes. Os dois frutos emergentes de palmeiras que têm sido produzidos em escala industrial como alternativa ao açaí^14,15 são E. precatoria (conhecido como açaí-do-amazonas), que cresce no sequeiro amazônico, e E. edulis (conhecido como juçara), que é típico da Mata Atlântica. No entanto, o consumo de açaí-do-amazonas e juçara leva ao mesmo acúmulo de sementes resistentes e não comestíveis que não são aproveitadas e não foram estudadas até o momento quanto à sua composição química detalhada.

Assim, demonstramos aqui que o protocolo previamente elaborado pode ser utilizado, com poucas adaptações, para analisar sementes de E. precatoria e E. edulis para mapeamento molecular pelo MALDI-IMS, mostrando-se uma poderosa ferramenta que pode ser utilizada para análise da composição desses recursos e pode auxiliar na determinação de seus potenciais usos biotecnológicos. Além disso, a descrição detalhada aqui fornecida pode ajudar outras pessoas com dificuldades semelhantes na preparação de materiais resistentes para a análise MALDI-IMS.

Protocolo

As sementes de Euterpe precatoria foram gentilmente doadas pelo Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Manaus, Brasil), e as sementes de Euterpe edulis foram gentilmente doadas pelo Silo - Arte e Latitude Rural (Resende, Brasil) após o processo de despolpamento industrial. As sementes foram mantidas em caixas plásticas fechadas à temperatura ambiente.

1. Espectroscopia de massa de dessorção/ionização-imagem a laser assistida por matriz (MALDI-IMS)

1. Protocolo de seccionamento de sementes
   1. Deixe três sementes de cada espécie em água deionizada por 24 h.
   2. No dia seguinte, ligue o criostato (ver Tabela de Materiais) e deixe atingir -20 °C.
   3. Retire as sementes molhadas da água. Corte as sementes ao meio usando uma lâmina de micrótomo (ver Tabela de Materiais).
   4. Prepare uma solução de gelatina fresca e quente (10%) (ver Tabela de Materiais).
   5. Coloque metade da semente em um molde e recheie com gelatina fresca. Congelar a -80 °C durante 2 h antes de levar para o criostato.
   6. Fixe a semente embutida ao suporte de criostato usando um composto de temperatura de corte ideal (OCT, consulte Tabela de Materiais) e deixe por 10 minutos dentro do criostato para endurecimento da OCT.
   7. Adicione fita adesiva de cobre dupla face (consulte Tabela de Materiais) a uma lâmina de vidro revestida com óxido de índio (lâmina ITO; consulte Tabela de Materiais).
   8. Produzir seções de 20 μm de espessura de cada espécie e colocá-las sobre a fita adesiva de cobre dupla face aderida à lâmina de vidro ITO.
      OBS: Neste momento, as fatias coletadas nas lâminas podem ser armazenadas em freezer a -80 °C; alternativamente, proceder ao deposição matricial. As lâminas devem ser colocadas numa caixa de corrediças de suporte, lavadas com N₂ gasoso e seladas com película para evitar a oxidação da amostra (ver Tabela de Materiais).
2. Deposição matricial
   1. Coloque a lâmina contendo fatias num exsicador a vácuo até atingir a temperatura ambiente.
   2. Faça marcas de ensino usando uma caneta de correção em cada canto do slide. Digitalize o slide usando um scanner de tabela. Definido para a resolução de 4.800 ppi.
   3. Utilizar uma balança analítica para pesar 30 mg de ácido 2,5-dihidroxibenzóico (DHB; ver Tabela de Materiais) e preparar 1 ml de metanol 1:1:ácido trifluoroacético a 0,1% (TFA; Tabela de Materiais) solução para dissolver a DHB.
   4. Encha uma seringa de vidro de 1 ml (ver Tabela de Materiais) com solução de DHB e coloque-a numa bomba de seringa (ver Tabela de Materiais) ajustada para um caudal de 0,8 ml/h.
   5. Usando a tubulação PEEK, conecte a seringa a uma agulha de ionização química por pressão atmosférica (APCI) (consulte a Tabela de Materiais).
   6. Conecte N₂ à agulha APCI e ajuste-a para uma taxa de fluxo de 12,5 psi .
   7. Conecte a agulha APCI à plataforma de movimento xy (consulte Tabela de Materiais). Certifique-se de que a ponta da agulha APCI esteja 4 cm acima da lâmina.
   8. Usando o software de desenho (consulte Tabela de Materiais e Figura Suplementar 1), defina a plataforma de movimento xy para seguir o modelo. O molde é composto por linhas paralelas horizontais espaçadas por 1 mm.
   9. Para obter a deposição da matriz, aguarde até que a plataforma de movimento xy repita o modelo 20 vezes.
      CUIDADO: A deposição da matriz deve ser realizada em uma capela de fumaça química.
3. Aquisição de imagens
   1. Coloque a lâmina no espectrômetro de massa (consulte Tabela de Materiais).
   2. Use marcas de caneta de correção para definir pontos de ensino no software referenciado (consulte Tabela de Materiais).
   3. Defina a potência do laser (60%), o foco do laser (médio), o número de disparos (100) e a polaridade no software (consulte a Tabela de Materiais). Defina o fator de redução de dados de 99% e salve o arquivo FID para posterior calibração de dados. Salve o método.
   4. Delimitar a área a ser analisada usando a ferramenta adicionar região de medição de polígono do software espectrômetro de massa. Edite os parâmetros da região de medição indicando o método salvo na etapa anterior e a largura do raster para 100 μm (Figura Suplementar S4A).
   5. Iniciar a aquisição de imagens.
4. Análise de dados
   1. Use o cluster de matriz e os contaminantes conhecidos para criar uma lista de massa no software referenciado (consulte Tabela de Materiais) na guia calibrador (Figura Suplementar S4B).
      1. Abra os dados a serem calibrados no software referenciado (consulte Tabela de Materiais). Na guia calibração , abra a lista de massas criada e abra uma caixa de diálogo clicando com o botão direito do mouse e escolha a opção definir massas de bloqueio (Figura Suplementar S4C).
      2. Selecione o modo de janela Gaussiano com ampliação Gaussiana 0,5 e ampliação Linha 3,5. Deixe a calibração on-line desmarcada. Selecione o modo (único), o limite (1.000) e a tolerância de massa (5 ppm). Calibre os dados com o processo e salve a ferramenta de dados 2D (Figura Suplementar S4C).
   2. Após a calibração, exporte os dados para o laboratório SCiLS ou outro software compatível e defina o limite de valor m/z desejado (intervalo escolhido: 150 a 2.500).
      Observação : dependendo do tamanho do arquivo ou características do computador, isso pode levar algum tempo.
   3. Escolha um método de normalização entre a contagem total de íons (TIC) ou o root mean square (RMS).
      OBS: Para esta análise, optou-se pela TIC.
   4. Se os analitos a serem mapeados forem conhecidos, plote cada valor m/z para cada analito e salve as imagens geradas e o gráfico de média espectral.
      NOTA: Neste trabalho, os valores de m/z dos oligômeros da hexose foram escolhidos considerando-se o aduto de potássio.

2. Espectroscopia de energia dispersiva (EDS)

1. Protocolo de seccionamento de sementes
   1. Adquira uma fatia fina de sementes em uma máquina de serra seccionadora (consulte Tabela de Materiais).
   2. Corte as sementes com os seguintes parâmetros: velocidade de corte de 500 RPM, carga de carga de 100 N e lâmina de wafering de diamante HC 15 (consulte a Tabela de Materiais).
      OBS: Manusear a retirada manual de fibras das sementes devido à necessária aderência ao porão nas viseiras de precisão acopladas ao goniômetro. Limpe a lâmina antes de usar, cortando uma seção da semente para evitar a adição de minerais indesejáveis durante a análise.
   3. Limpar as amostras com ar comprimido para remover todos os resíduos de partículas do corte (ver Tabela de Materiais).
   4. Fixe uma seção de semente em fita condutora de dupla face de carbono (consulte Tabela de Materiais) no suporte.
2. Condições de análise
   1. Fixe o suporte com uma seção de sementes dentro da câmara de vácuo de um microscópio eletrônico de varredura (MEV) acoplado ao EDS (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Adquira micrografias eletrônicas em um microscópio modelo com aceleração de 20 kV e um tamanho de ponto de 4,0, usando sinais de elétrons secundários (ver Tabela de Materiais), elétrons retroespalhados (detector de estado sólido fixado na peça polar) e misturas desses dois tipos de sinais (MIX), construindo imagens coloridas artificialmente.
   3. Para a aquisição dos espectros de EDS, use um espectrômetro (ver Tabela de Materiais) acoplado ao MEV acima mencionado. A configuração de condição da aquisição da imagem a partir do EDS é a mesma do MEV.
   4. Defina graus de inclinação, elevação e azimute em 0,0, 35,0 e 0,0, respectivamente.
3. Aquisição de dados
   1. Defina três áreas diferentes com ampliação de 91x da seção de sementes para adquirir dados.
   2. Identificar os picos no espectro no término da aquisição ou durante a aquisição. Use o botão de etapa Confirmar elementos para identificar os picos manualmente.
   3. Defina o tempo de aquisição para 60 s para cada área selecionada. Defina o tempo do processo para cinco; Os parâmetros estão disponíveis para um tempo de processo de um a seis.
      NOTA: Os sinais dos elementos são constantes e se somam, enquanto os ruídos são aleatórios e deletérios. Quanto maior o tempo de processamento, menor o ruído.
   4. As configurações padrão para exibir resultados quantitativos significativos estão acima de dois sigmas (desvio padrão). Defina dois sigmas como zero para reduzir os resultados indesejáveis.
   5. Normalizar cada intensidade dos elementos; este é um parâmetro padronizado no software (consulte Tabela de Materiais).
   6. Para analisar os dados, exporte-os em um arquivo DOC.
4. Análise de dados
   1. Garantir a medição precisa das intensidades de pico para análise elementar quantitativa.
   2. Picos sobrepostos requerem deconvolução para melhor separação dos picos; Subtrair um fundo barulhento quando necessário.
   3. Quando não houver sobreposição, aumente o ganho para amplificar os sinais e melhorar a qualidade do espectro.

Resultados

O protocolo elaborado possibilitou a análise MALDI-IMS de sementes de E. precatoria e E. edulis . Como resultado, foi possível confirmar o peso molecular e o grau de polimerização (PD) dos carboidratos como uma elucidação estrutural parcial. As informações moleculares fornecidas pela análise MALDI-IMS (Figura 1 e Figura 2) exibiram picos representando [M+K]⁺ adutos de oligômeros de hexose (Δ = 162 Da) sem ...

Discussão

As plantas são compostas por tecidos especializados para funções bioquímicas específicas. Portanto, o protocolo de preparação de amostras para MALDI-IMS deve ser desenhado de acordo com vários tecidos vegetais com propriedades físico-químicas específicas, pois as amostras devem manter sua distribuição e abundância originais do analito para sinal de alta qualidade e resolução espacial⁸.

Antes da análise MALDI-IMS, a principal consideração é coletar e ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	149357
APCI needle	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	602193
AxiDraw V3 xy motion platform	Evil Mad Scientist, CA, USA	2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software			creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape	3M, USA	1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		image acquisition
FTMS Processing	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		data calibration
Gelatin from bovine skin	Sigma Aldrich Co, MO, USA	G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany	0358 38926
indium tin oxide coated glass slide	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8237001
Inkscape	Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter	Buehler, Illinois, USA
Methanol	J.T.Baker	9093-03
Mili-Q water			18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher HealthCare, Texas, USA	4585
Parafilm "M" Sealing Film	Amcor	HS234526B
Quanta 450 FEG	FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V	Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump	kdScientific, MA, USA	78-9100K
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	302031
X-Max spectrometer	Oxford Instruments, Ableton, UK