АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол был направлен на описание подробных рекомендаций по подготовке срезов твердых образцов семян с низким содержанием воды для анализа MALDI-IMS, поддержанию исходного распределения и содержания аналитов и обеспечению высококачественного сигнального и пространственного разрешения.

Аннотация

Матричная лазерная десорбционно-ионизационная масс-спектрометрия (MALDI-IMS) применяется для идентификации соединений в их нативных средах. В настоящее время MALDI-IMS часто используется в клиническом анализе. Тем не менее, существует отличная перспектива для лучшего применения этого метода для понимания физиологической информации химических соединений в тканях растений. Тем не менее, подготовка конкретных образцов из растительных материалов может быть сложной задачей, поскольку для MALDI-IMS требуются тонкие срезы (12-20 мкм) для надлежащего сбора данных и успешного анализа. В связи с этим ранее мы разработали протокол пробоподготовки для получения тонких срезов твердых семян Euterpe oleracea (пальмы асаи), что позволило провести их молекулярное картирование с помощью MALDI-IMS.

Здесь мы показываем, что разработанный протокол подходит для подготовки других семян из того же рода. Вкратце, протокол был основан на погружении семян в деионизированную воду на 24 ч, погружении образцов с желатином и разделении их в акклиматизированном криостате. Затем, для матричного осаждения, платформа с движением xy была соединена с игольчатым распылением ионизационного распыления (ESI) с использованием раствора 1:1 (v/v) 2,5-дигидроксибензойной кислоты (DHB) и метанола с 0,1% трифторуксусной кислотой в дозе 30 мг/мл. Данные о семенах E. precatoria и E. edulis обрабатывали с помощью программного обеспечения для картирования их метаболитных паттернов.

Гексозные олигомеры были нанесены на карту в срезах образцов, чтобы доказать адекватность протокола для этих образцов, поскольку известно, что эти семена содержат большое количество маннана, полимера гексозной маннозы. В результате были выявлены пики гексозных олигомеров, представленные [M + K]+ аддуктами (Δ = 162 Da). Таким образом, протокол пробоподготовки, ранее разработанный специально для семян E. oleracea , также позволил провести анализ MALDI-IMS двух других твердых семян пальмы. Короче говоря, этот метод может стать ценным инструментом для исследований морфоанатомии и физиологии растительных материалов, особенно из устойчивых к порезам образцов.

Введение

Матрично-ассистированная лазерная десорбционно-ионизационно-визуализирующая масс-спектрометрия (MALDI-IMS) является мощным методом, позволяющим осуществлять двумерное распределение биомолекул, обеспечивает нецелевое исследование ионизируемых соединений и определяет их пространственное распределение, особенно в биологических образцах 1,2. В течение двух десятилетий этот метод позволял одновременно обнаруживать и идентифицировать липиды, пептиды, углеводы, белки, другие метаболиты и синтетические молекулы, такие как терапевтические препараты 3,4. MALDI-IMS облегчает химический анализ поверхности образца ткани без экстракции, очистки, разделения, маркировки или окрашивания биологических образцов. Однако для успешного анализа ключевым этапом в этом методе является подготовка образцов, особенно в растительных тканях, которые специализированы и модифицированы в широко распространенные сложные органы из-заакклиматизации окружающей среды.

Из-за присущих растительным тканям физико-химических свойств существует необходимость в адаптированном протоколе, который соответствовал бы требованиям анализа MALDI-IMS и сохранял первоначальную форму ткани при подготовке к срезу 6,7. В случае нетрадиционных образцов, таких как семена, установленные протоколы8 неприменимы, поскольку эти ткани имеют жесткие клеточные стенки и низкое содержание воды, что может легко вызвать фрагментацию секции и привести к делокализации соединения9.

Наша исследовательская группа опубликовала экспериментальные данные по молекулярному картированию и адаптированный протокол для анализа MALDI-IMS семян асаи (Euterpe oleracea Mart.) 10,11,12, которые являются побочным продуктом, образующимся в больших количествах при производстве арендуемой целлюлозы асаи 13. Идея заключалась в том, чтобы разработать протокол для картирования in situ различных метаболитов в семенах асаи, что помогло бы предложить возможные варианты использования этих сельскохозяйственных отходов, которые в настоящее время не изучаются в коммерческих целях. Однако из-за резистентности семян асаи необходимо было разработать индивидуальный протокол для получения надлежащего секционирования образцов из анализа MALDI-IMS.

В этом контексте экономически важная мякоть асаи стимулировала растущую коммерциализацию других фруктов пальм рода Эвтерпа с аналогичными органолептическими характеристиками. Два новых плода пальм, которые были произведены в промышленных масштабах в качестве альтернативы асаи14,15, - это E. precatoria (известная как açaí-do-amazonas), которая растет в засушливых районах Амазонки, и E. edulis (известная как juçara), которая типична для Атлантического леса. Тем не менее, потребление асаи-ду-амазонас и хусары приводит к такому же накоплению устойчивых и несъедобных семян, которые не используются и до сих пор не были изучены в отношении их подробного химического состава.

Таким образом, мы демонстрируем, что ранее разработанный протокол может быть использован с небольшими изменениями для анализа семян E. precatoria и E. edulis для молекулярного картирования с помощью MALDI-IMS, что является мощным инструментом, который может быть использован для анализа состава этих ресурсов и может помочь определить их потенциальное биотехнологическое использование. Кроме того, подробное описание, приведенное здесь, может помочь другим людям, испытывающим аналогичные трудности, в подготовке устойчивых материалов для анализа MALDI-IMS.

протокол

Семена Euterpe precatoria были любезно предоставлены Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Манаус, Бразилия), а семена Euterpe edulis были любезно предоставлены Silo - Arte e Latitude Rural (Резенде, Бразилия) после промышленного процесса депульпирования. Семена хранились в герметичных пластиковых ящиках при комнатной температуре.

1. Масс-спектроскопия матричной лазерной десорбции/ионизации (MALDI-IMS)

  1. Протокол секционирования семян
    1. Дайте трем семенам от каждого вида постоять в деионизированной воде в течение 24 часов.
    2. На следующий день включите криостат (см. Таблицу материалов) и дайте ему нагреться до -20 °C.
    3. Достаньте влажные семена из воды. Разрежьте семена пополам с помощью лезвия микротома (см. Таблицу материалов).
    4. Приготовьте свежий теплый (10%) раствор желатина (см. Таблицу материалов).
    5. Выложите половину семян на формочку и залейте ее свежеприготовленным желатином. Заморозьте при -80 °C в течение 2 ч перед отправкой в криостат.
    6. Прикрепите заделанный семя к криостатной опоре с помощью смеси с оптимальной температурой резания (OCT, см. Таблицу материалов) и оставьте на 10 минут внутри криостата для затвердевания OCT.
    7. Добавьте медную двустороннюю клейкую ленту (см. Таблицу материалов) на предметное стекло с покрытием из оксида индия-олова (слайд ITO; см. Таблицу материалов).
    8. Изготовьте срезы толщиной 20 мкм из каждого вида и поместите их на медную двустороннюю клейкую ленту, приклеенную к предметному стеклу ITO.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе ломтики, собранные на предметных стеклах, можно хранить в морозильной камере при температуре -80 °C; В качестве альтернативы можно перейти к матричному осаждению. Предметные стекла должны быть помещены в держатель, промыты газообразным N2 и запечатаны пленкой для предотвращения окисления образца (см. Таблицу материалов).
  2. Матричное осаждение
    1. Поместите предметное стекло с ломтиками в вакуумный эксикатор, пока оно не нагреется до комнатной температуры.
    2. Делайте пометки в обучении с помощью корректирующей ручки в каждом углу слайда. Отсканируйте слайд с помощью сканера таблиц. Установите разрешение 4 800 ppi.
    3. С помощью аналитических весов взвесьте 30 мг 2,5-дигидроксибензойной кислоты (ДГБ; см. таблицу материалов) и приготовьте 1 мл метанола 1:1:1:0,1% трифторуксусной кислоты (ТФК; Содержание материалов) раствор для растворения DHB.
    4. Наполните стеклянный шприц объемом 1 мл (см. Таблицу материалов) раствором DHB и поместите его в шприцевой насос (см. Таблицу материалов) со скоростью потока 0,8 мл/ч.
    5. Используя трубку PEEK, подсоедините шприц к игле химической ионизации атмосферного давления (APCI) (см. Таблицу материалов).
    6. Подсоедините N2 к игле APCI и установите ее на скорость потока 12,5 фунтов на квадратный дюйм .
    7. Прикрепите иглу APCI к подвижной платформе xy (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что кончик иглы APCI находится на 4 см выше предметного стекла.
    8. С помощью программного обеспечения для рисования (см. таблицу материалов и дополнительный рисунок 1) установите платформу движения xy в соответствии с шаблоном. Шаблон состоит из горизонтальных параллельных линий с интервалом 1 мм.
    9. Чтобы получить матричное осаждение, подождите, пока платформа движения xy повторит шаблон 20 раз.
      ВНИМАНИЕ: Осаждение матрицы должно проводиться в химическом вытяжном шкафу.
  3. Получение изображений
    1. Поместите предметное стекло в масс-спектрометр (см. Таблицу материалов).
    2. Используйте корректирующие метки пера, чтобы установить учебные точки в указанном программном обеспечении (см. Таблицу материалов).
    3. Установите мощность лазера (60%), фокусировку лазера (средняя), количество снимков (100) и полярность в программном обеспечении (см. Таблицу материалов). Установите коэффициент уменьшения данных 99% и сохраните файл FID для последующей калибровки данных. Сохраните метод.
    4. Разграничьте область, подлежащую анализу, с помощью инструмента Добавить полигональную область измерения в программном обеспечении масс-спектрометра. Отредактируйте параметры области измерения, указав метод, сохраненный на предыдущем шаге, и ширину растра до 100 мкм (дополнительный рисунок S4A).
    5. Начните получение изображений.
  4. Анализ данных
    1. Используйте матричный кластер и известные загрязняющие вещества для создания списка масс в указанном программном обеспечении (см. Таблицу материалов) на вкладке калибратора (дополнительный рисунок S4B).
      1. Откройте данные для калибровки в указанном программном обеспечении (см. Таблицу материалов). На вкладке калибровки откройте созданный список масс и откройте диалоговое окно, щелкнув правой кнопкой мыши, и выберите параметр установить фиксированные массы (дополнительный рисунок S4C).
      2. Выберите режим окна Гаусса с уширением по Гауссу 0.5 и уширением линии 3.5. Не устанавливайте флажок для онлайн-калибровки. Выберите режим (одиночный), пороговое значение (1 000) и допуск по массе (5 ppm). Откалибруйте данные с помощью process и сохраните инструмент 2D-данных (дополнительный рисунок S4C).
    2. После калибровки экспортируйте данные в лабораторию SCiLS или другое совместимое программное обеспечение и установите желаемый порог значения m/z (выбранный диапазон: от 150 до 2 500).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера файла или характеристик компьютера это может занять некоторое время.
    3. Выберите метод нормализации между общим числом ионов (TIC) или среднеквадратичным значением (RMS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого анализа был выбран ТИЦ.
    4. Если аналиты, подлежащие картированию, известны, постройте график каждого значения m/z для каждого анализируемого вещества и сохраните полученные изображения и график спектрального среднего.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В данной работе значения m/z из гексозных олигомеров были выбраны с учетом аддукта калия.

2. Энергодисперсионная спектроскопия (ЭДС)

  1. Протокол секционирования семян
    1. Получите тонкий срез семян в раскроечно-пильном станке (см. Таблицу материалов).
    2. Нарежьте семена со следующими параметрами: скорость резки 500 об/мин, нагрузка 100 Н и алмазный вафельный диск 15 HC (см. Таблицу материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте ручное удаление волокон из семян из-за необходимого сцепления с трюмом в прецизионных тисках, прикрепленных к гониометру. Очистите лезвие перед использованием, срезав часть семени, чтобы предотвратить добавление нежелательных минералов во время анализа.
    3. Очистите образцы сжатым воздухом, чтобы удалить все остатки частиц из разреза (см. Таблицу материалов).
    4. Закрепите семенной участок углеродной двусторонней токопроводящей лентой (см. Таблицу материалов) в опоре.
  2. Условия анализа
    1. Прикрепите опору с затравочной секцией внутри вакуумной камеры сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) в сочетании с ЭДС (см. Таблицу материалов).
    2. Получение электронных микрофотографий на модельном микроскопе с ускорением 20 кВ и размером пятна 4,0 с использованием вторичных электронных сигналов (см. Таблицу материалов), обратно рассеянных электронов (твердотельный детектор, закрепленный на полярной части) и смесей этих двух типов сигналов (MIX), построение искусственно окрашенных изображений.
    3. Для получения спектров ЭДС используют спектрометр (см. Таблицу материалов) в сочетании с вышеупомянутой РЭМ. Конфигурация условий получения изображения из ЭЦП такая же, как и у РЭМ.
    4. Задайте градусы наклона, высоты и азимута на 0,0, 35,0 и 0,0 соответственно.
  3. Сбор данных
    1. Установите три разные области с 91-кратным увеличением семенной секции для получения данных.
    2. Определите пики в спектре по окончании сбора данных или во время получения. Используйте кнопку шага Confirm Elements (Подтвердить элементы ) для определения пиков вручную.
    3. Установите время съемки равным 60 с для каждой выбранной области. Установите время процесса на пять; Параметры доступны для времени обработки от одного до шести.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Знаки элементов постоянны и суммируются, в то время как шумы случайны и вредны. Чем дольше время обработки, тем ниже уровень шума.
    4. Настройки по умолчанию для отображения значимых количественных результатов выше двух сигм (стандартное отклонение). Установите две сигмы на ноль, чтобы уменьшить нежелательные результаты.
    5. Нормализовать каждую интенсивность элементов; это стандартизированный параметр в программном обеспечении (см. Таблицу материалов).
    6. Чтобы проанализировать данные, экспортируйте их в файл DOC.
  4. Анализ данных
    1. Обеспечьте точное измерение пиковых интенсивностей для количественного элементного анализа.
    2. Перекрывающиеся пики требуют деконволюции для лучшего разделения пиков; При необходимости вычитайте шумный фон.
    3. Если перекрытия нет, увеличьте усиление, чтобы усилить сигналы и улучшить качество спектра.

Результаты

Разработанный протокол позволил провести анализ семян E. precatoria и E. edulis методом MALDI-IMS. В результате мы смогли подтвердить молекулярную массу углеводов и степень полимеризации (ДП) в качестве частичного структурного выяснения. Молекулярная информация, полученная в результате а?...

Обсуждение

Растения состоят из специализированных тканей для выполнения определенных биохимических функций. Таким образом, протокол пробоподготовки для MALDI-IMS должен быть разработан в соответствии с различными растительными тканями со специфическими физико-химическими свойствами, поскольку о?...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была профинансирована Институтом Серрапилейра (Серра-1708-15009) и Фондом поддержки исследований в штате Рио-де-Жанейро имени Карлоса Шагаса Фильо (FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021). Институт Серрапилхейра и Национальный совет по научно-техническому развитию (CNPq) предоставили стипендии д-ру Фелипе Лопесу Бруму и д-ру Габриэлю Р. Мартинсу (Программа наращивания институционального потенциала/INT/MCTI). Координация по совершенствованию кадров высшего образования (CAPES) признана за предоставление стипендии магистра г-ну Дави М.М.К. да Силва. Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ) получил признание за услуги, предоставляемые в области анализа MALDI-IMS, а г-н Алан Менезес ду Насименто и Centro de Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT), финансируемый грантом MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ No 442604/2019, благодарны за анализ элементарного состава.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer LockHamilton Company81320
2,5-Dihydroxybenzoic acidSigma Aldrich Co, MO, USA149357
APCI needleBruker Daltonik, Bremen, Germany602193
AxiDraw V3 xy motion platformEvil Mad Scientist, CA, USA2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape3M, USA1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UVLeica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImagingBruker Daltonik, Bremen, Germanyimage acquisition
FTMS ProcessingBruker Daltonik, Bremen, Germanydata calibration
Gelatin from bovine skinSigma Aldrich Co, MO, USAG9391
High Profile Microtome Blades Leica 818Leica  Biosystems, Nussloch, Germany0358 38926
indium tin oxide coated glass slideBruker Daltonik, Bremen, Germany8237001
InkscapeInkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutterBuehler, Illinois, USA
MethanolJ.T.Baker9093-03
Mili-Q water18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature CompoundFisher HealthCare, Texas, USA4585
Parafilm "M" Sealing FilmAmcorHS234526B
Quanta 450 FEGFEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 VOxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7TBruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pumpkdScientific, MA, USA78-9100K
Trifluoroacetic acidSigma Aldrich Co, MO, USA302031
X-Max spectrometerOxford Instruments, Ableton, UK

Ссылки

  1. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: a review of emerging advancements and future insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  2. Heeren, R. M. A. MALDITechniques in Mass Spectrometry Imaging. Encyclopedia of Spectroscopy and Spectrometry. , (2017).
  3. Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andrén, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
  4. Zaima, N., Hayasaka, T., Goto-Inoue, N., Setou, M. Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 5040-5055 (2010).
  5. Qin, L., et al. Recent advances in matrix-assisted laser desorption/ionisation mass spectrometry imaging (MALDI-MSI) for in Situ analysis of endogenous molecules in plants. Phytochemical Analysis. 29 (4), 351-364 (2018).
  6. Bhandari, D. R., et al. High resolution mass spectrometry imaging of plant tissues: Towards a plant metabolite atlas. Analyst. 140 (22), 7696-7709 (2015).
  7. Boughton, B. A., Thinagaran, D., Sarabia, D., Bacic, A., Roessner, U. Mass spectrometry imaging for plant biology: a review. Phytochemistry Reviews. 15 (3), 445-488 (2016).
  8. Dong, Y., et al. Sample preparation for mass spectrometry imaging of plant tissues: a review. Frontiers in Plant Science. 7, 60 (2016).
  9. Zhang, Y. X., Zhang, Y., Shi, Y. P. A reliable and effective sample preparation protocol of MALDI-TOF-MSI for lipids imaging analysis in hard and dry cereals. Food Chemistry. 398, 133911 (2023).
  10. Brum, F. L., Martins, G. R., Mohana-Borges, R., da Silva, A. S. The acquisition of thin sections of açaí (Euterpe oleracea Mart.) seed with elevated potassium content for molecular mapping by mass spectrometry imaging. Rapid Communications in Mass Spectrometry. , e9474 (2023).
  11. Martins, G. R., et al. Chemical characterization, antioxidant and antimicrobial activities of açaí seed (Euterpe oleracea Mart.) extracts containing A- and B-type procyanidins. LWT. 132, 109830 (2020).
  12. Martins, G. R., et al. Phenolic profile and antioxidant properties in extracts of developing açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 70 (51), 16218-16228 (2022).
  13. Jorge, F. T. A., Silva, A. S. A., Brigagão, G. V. Açaí waste valorization via mannose and polyphenols production: techno-economic and environmental assessment. Biomass Conversion and Biorefinery. , (2022).
  14. Carvalho, L. M. J., Esmerino, A. A., Carvalho, J. L. V. Jussaí (Euterpe edulis): a review. Food Science and Technology. 42, (2022).
  15. Yamaguchi, K. K. d. L., Pereira, L. F. R., Lamarão, C. V., Lima, E. S., Veiga-Junior, V. F. d. Amazon acai: chemistry and biological activities: A Review. Food Chemistry. 179, 137-151 (2015).
  16. Wu, R., et al. Copper adhesive tape attached to the reverse side of a non-conductive glass slide to achieve protein MALDI-imaging in FFPE-tissue sections. Chemical Communications. 57 (82), 10707-10710 (2021).
  17. Dufresne, M., Patterson, N. H., Norris, J. L., Caprioli, R. M. Combining salt doping and matrix sublimation for high spatial resolution MALDI imaging mass spectrometry of neutral lipids. Analytical Chemistry. 91 (20), 12928-12934 (2019).
  18. Aguiar, M. O., de Mendonça, M. S. Morfo-anatomia da semente de Euterpe precatoria Mart (Palmae). Revista Brasileira de Sementes. 25, 37-42 (2003).
  19. Panza, V., Láinez, V., Maldonado, S. Seed structure and histochemistry in the palm Euterpe edulis. Botanical Journal of the Linnean Society. 145 (4), 445-453 (2004).
  20. Alves, V. M., et al. Provenient residues from industrial processing of açaí berries (Euterpe precatoria Mart): nutritional and antinutritional contents, phenolic profile, and pigments. Food Science and Technology. 42, (2022).
  21. Inada, K. O. P., et al. Screening of the chemical composition and occurring antioxidants in jabuticaba (Myrciaria jaboticaba) and jussara (Euterpe edulis) fruits and their fractions. Journal of FunctionalFoods. 17, 422-433 (2015).
  22. Monteiro, A. F., Miguez, I. S., Silva, J. P. R. B., Silva, A. S. High concentration and yield production of mannose from açaí (Euterpe oleracea Mart.) seeds via mannanase-catalyzed hydrolysis. Scientific Reports. 9 (1), 10939 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

196Euterpe oleracea25E precatoriaE edulis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены