Подготовка твердых семян пальмы к матрично-ассистированному лазерной десорбции/ионизации масс-спектрометрическому анализу

Резюме

Этот протокол был направлен на описание подробных рекомендаций по подготовке срезов твердых образцов семян с низким содержанием воды для анализа MALDI-IMS, поддержанию исходного распределения и содержания аналитов и обеспечению высококачественного сигнального и пространственного разрешения.

Аннотация

Матричная лазерная десорбционно-ионизационная масс-спектрометрия (MALDI-IMS) применяется для идентификации соединений в их нативных средах. В настоящее время MALDI-IMS часто используется в клиническом анализе. Тем не менее, существует отличная перспектива для лучшего применения этого метода для понимания физиологической информации химических соединений в тканях растений. Тем не менее, подготовка конкретных образцов из растительных материалов может быть сложной задачей, поскольку для MALDI-IMS требуются тонкие срезы (12-20 мкм) для надлежащего сбора данных и успешного анализа. В связи с этим ранее мы разработали протокол пробоподготовки для получения тонких срезов твердых семян Euterpe oleracea (пальмы асаи), что позволило провести их молекулярное картирование с помощью MALDI-IMS.

Здесь мы показываем, что разработанный протокол подходит для подготовки других семян из того же рода. Вкратце, протокол был основан на погружении семян в деионизированную воду на 24 ч, погружении образцов с желатином и разделении их в акклиматизированном криостате. Затем, для матричного осаждения, платформа с движением xy была соединена с игольчатым распылением ионизационного распыления (ESI) с использованием раствора 1:1 (v/v) 2,5-дигидроксибензойной кислоты (DHB) и метанола с 0,1% трифторуксусной кислотой в дозе 30 мг/мл. Данные о семенах E. precatoria и E. edulis обрабатывали с помощью программного обеспечения для картирования их метаболитных паттернов.

Гексозные олигомеры были нанесены на карту в срезах образцов, чтобы доказать адекватность протокола для этих образцов, поскольку известно, что эти семена содержат большое количество маннана, полимера гексозной маннозы. В результате были выявлены пики гексозных олигомеров, представленные [M + K]⁺ аддуктами (Δ = 162 Da). Таким образом, протокол пробоподготовки, ранее разработанный специально для семян E. oleracea , также позволил провести анализ MALDI-IMS двух других твердых семян пальмы. Короче говоря, этот метод может стать ценным инструментом для исследований морфоанатомии и физиологии растительных материалов, особенно из устойчивых к порезам образцов.

Введение

Матрично-ассистированная лазерная десорбционно-ионизационно-визуализирующая масс-спектрометрия (MALDI-IMS) является мощным методом, позволяющим осуществлять двумерное распределение биомолекул, обеспечивает нецелевое исследование ионизируемых соединений и определяет их пространственное распределение, особенно в биологических образцах ^1,2. В течение двух десятилетий этот метод позволял одновременно обнаруживать и идентифицировать липиды, пептиды, углеводы, белки, другие метаболиты и синтетические молекулы, такие как терапевтические препараты ^3,4. MALDI-I....

протокол

Семена Euterpe precatoria были любезно предоставлены Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Манаус, Бразилия), а семена Euterpe edulis были любезно предоставлены Silo - Arte e Latitude Rural (Резенде, Бразилия) после промышленного процесса депульпирования. Семена хранились в герметичных пластиковых ящиках при комнатной температуре.

1. Масс-спектроскопия матричной лазерной десорбции/ионизации (MALDI-IMS)

1. Протокол секционирования семян
   1. Дайте трем семенам от каждого вида постоять в деионизированной воде в течение 24 часов.
   2. На следующий день включите криостат (см. Табл....

Результаты

Разработанный протокол позволил провести анализ семян E. precatoria и E. edulis методом MALDI-IMS. В результате мы смогли подтвердить молекулярную массу углеводов и степень полимеризации (ДП) в качестве частичного структурного выяснения. Молекулярная информация, полученная в результате а?.......

Обсуждение

Растения состоят из специализированных тканей для выполнения определенных биохимических функций. Таким образом, протокол пробоподготовки для MALDI-IMS должен быть разработан в соответствии с различными растительными тканями со специфическими физико-химическими свойствами, поскольку о?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	149357
APCI needle	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	602193
AxiDraw V3 xy motion platform	Evil Mad Scientist, CA, USA	2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software			creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape	3M, USA	1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		image acquisition
FTMS Processing	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		data calibration
Gelatin from bovine skin	Sigma Aldrich Co, MO, USA	G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany	0358 38926
indium tin oxide coated glass slide	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8237001
Inkscape	Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter	Buehler, Illinois, USA
Methanol	J.T.Baker	9093-03
Mili-Q water			18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher HealthCare, Texas, USA	4585
Parafilm "M" Sealing Film	Amcor	HS234526B
Quanta 450 FEG	FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V	Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump	kdScientific, MA, USA	78-9100K
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	302031
X-Max spectrometer	Oxford Instruments, Ableton, UK