Préparation de graines de palmier dur pour l’analyse par spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice

Résumé

Ce protocole visait à décrire des directives détaillées sur la préparation de sections d’échantillons de graines dures à faible teneur en eau pour l’analyse MALDI-IMS, en maintenant la distribution et l’abondance d’origine des analytes et en fournissant un signal de haute qualité et une résolution spatiale.

Résumé

La spectrométrie de masse par désorption/ionisation-imagerie laser assistée par matrice (MALDI-IMS) est appliquée pour identifier les composés dans leur environnement d’origine. Actuellement, MALDI-IMS est fréquemment utilisé dans les analyses cliniques. Pourtant, il existe une excellente perspective pour mieux appliquer cette technique afin de comprendre les informations physiologiques des composés chimiques dans les tissus végétaux. Cependant, la préparation peut être difficile pour des échantillons spécifiques de matériaux botaniques, car MALDI-IMS nécessite des tranches minces (12-20 μm) pour une acquisition de données appropriée et une analyse réussie. En ce sens, nous avons précédemment développé un protocole de préparation d’échantillons pour obtenir de fines coupes de graines dures d’Euterpe oleracea (palmier açaí), permettant leur cartographie moléculaire par MALDI-IMS.

Ici, nous montrons que le protocole développé est adapté à la préparation d’autres graines du même genre. En bref, le protocole était basé sur l’immersion des graines dans de l’eau désionisée pendant 24 heures, l’enrobage d’échantillons avec de la gélatine et leur coupe dans un cryostat acclimaté. Ensuite, pour le dépôt de la matrice, une plate-forme de mouvement xy a été couplée à une pulvérisation à aiguille par ionisation par électronébulisation (ESI) utilisant une solution d’acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB) 1:1 (v/v) et de méthanol avec 0,1 % d’acide trifluoroacétique à 30 mg/mL. Les données sur les graines d’E. precatoria et d’E. edulis ont été traitées à l’aide d’un logiciel pour cartographier leurs métabolites.

Les oligomères d’hexose ont été cartographiés dans des coupes d’échantillons pour prouver l’adéquation du protocole pour ces échantillons, car on sait que ces graines contiennent de grandes quantités de mannane, un polymère de l’hexose mannose. En conséquence, des pics d’oligomères d’hexose, représentés par des adduits [M + K]⁺ de (Δ = 162 Da), ont été identifiés. Ainsi, le protocole de préparation des échantillons, précédemment développé sur mesure pour les semences d’E. oleracea , a également permis l’analyse MALDI-IMS de deux autres graines de palmier dur. En bref, la méthode pourrait constituer un outil précieux pour la recherche en morpho-anatomie et physiologie des matériaux botaniques, en particulier à partir d’échantillons résistants aux coupures.

Introduction

La spectrométrie de masse par désorption/ionisation par imagerie laser assistée par matrice (MALDI-IMS) est une méthode puissante qui permet l’affectation bidimensionnelle de biomolécules, fournit une étude non ciblée des composés ionisables et détermine leur distribution spatiale, en particulier dans les échantillons biologiques ^1,2. Depuis deux décennies, cette technique permet de détecter et d’identifier simultanément des lipides, des peptides, des glucides, des protéines, d’autres métabolites et des molécules synthétiques telles que des médicaments thérapeutiques ^3,4. MALDI-IMS facilite l’analyse chimique à la surface d’un échantillon de tissu sans extraire, purifier, séparer, marquer ou colorer des échantillons biologiques. Cependant, pour une analyse réussie, une étape cruciale de cette technique est la préparation des échantillons, en particulier dans les tissus végétaux, qui sont spécialisés et modifiés en organes complexes répandus en raison de l’acclimatation environnementale⁵.

En raison des propriétés physico-chimiques inhérentes aux tissus végétaux, il est nécessaire de mettre en place un protocole adapté pour répondre aux exigences de l’analyse MALDI-IMS et préserver la forme originale du tissu lors de la préparation de la coupe ^6,7. Dans le cas d’échantillons non conventionnels, tels que les graines, les protocoles établis⁸ ne sont pas applicables car ces tissus ont des parois cellulaires rigides et une faible teneur en eau, ce qui peut facilement provoquer une fragmentation de la section et conduire à la délocalisation du composé⁹.

Notre groupe de recherche a publié des données expérimentales sur la cartographie moléculaire et un protocole adapté pour l’analyse MALDI-IMS de la graine d’açaí (Euterpe oleracea Mart.) 10,11,12, qui est un sous-produit généré en grande quantité lors de la production de la pulpe d’açaí ¹³ à louer. L’idée était de développer un protocole de cartographie in situ des différents métabolites dans les graines d’açaí, permettant de suggérer des utilisations possibles de ces déchets agricoles qui ne sont actuellement pas explorées commercialement. Cependant, en raison de la résistance de la graine d’açaí, il a été nécessaire d’élaborer un protocole sur mesure pour obtenir une coupe appropriée de l’échantillon à partir de l’analyse MALDI-IMS.

Dans ce contexte, la pulpe d’açaí, économiquement importante, a motivé la commercialisation croissante d’autres fruits issus de palmiers du genre Euterpe présentant des caractéristiques sensorielles similaires. Les deux fruits émergents des palmiers qui ont été produits à l’échelle industrielle comme alternative à l’açaí^14,15 sont E. precatoria (connu sous le nom d’açaí-do-amazonas), qui pousse dans les zones arides de l’Amazonie, et E. edulis (connu sous le nom de juçara), qui est typique de la forêt atlantique. Néanmoins, la consommation d’açaí-do-amazonas et de juçara conduit à la même accumulation de graines résistantes et non comestibles qui ne sont pas utilisées et qui n’ont pas été étudiées jusqu’à présent en ce qui concerne leur composition chimique détaillée.

Ainsi, nous démontrons ici que le protocole précédemment conçu peut être utilisé, avec peu d’adaptations, pour analyser les graines d’E. precatoria et d’E. edulis pour la cartographie moléculaire par MALDI-IMS, s’avérant être un outil puissant qui peut être utilisé pour analyser la composition de ces ressources et peut aider à déterminer leurs utilisations biotechnologiques potentielles. De plus, la description détaillée fournie ici peut aider d’autres personnes ayant des difficultés similaires à préparer des matériaux résistants pour l’analyse MALDI-IMS.

Protocole

Les graines d’Euterpe precatoria ont été gracieusement offertes par l’Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Manaus, Brésil), et les graines d’Euterpe edulis ont été gracieusement données par le Silo - Arte e Latitude Rural (Resende, Brésil) après le processus de dépulpage industriel. Les graines ont été conservées dans des boîtes en plastique scellées à température ambiante.

1. Spectroscopie de masse à désorption/ionisation-imagerie laser assistée par matrice (MALDI-IMS)

1. Protocole de sectionnement des semences
   1. Laisser reposer trois graines de chaque espèce dans de l’eau déminéralisée pendant 24 h.
   2. Le lendemain, allumez le cryostat (voir tableau des matériaux) et laissez-le atteindre -20 °C.
   3. Sortez les graines humides de l’eau. Coupez les graines en deux à l’aide d’une lame de microtome (voir tableau des matériaux).
   4. Préparez une solution de gélatine fraîche et tiède (10 %) (voir le tableau des matières).
   5. Placez la moitié de la graine sur un moule et remplissez-le de gélatine fraîchement préparée. Congeler à -80 °C pendant 2 h avant de prendre le cryostat.
   6. Fixez la graine noyée au support du cryostat à l’aide d’un composé à température de coupe optimale (OCT, voir tableau des matériaux) et laissez reposer 10 min à l’intérieur du cryostat pour durcir OCT.
   7. Ajouter du ruban adhésif double face en cuivre (voir le tableau des matériaux) à une lame de verre enduite d’oxyde d’indium et d’étain (diapositive ITO ; voir le tableau des matériaux).
   8. Produire des sections de 20 m d’épaisseur à partir de chaque espèce et les placer sur le ruban adhésif double face en cuivre collé à la lame de verre ITO.
      REMARQUE : À ce stade, les tranches recueillies sur les lames peuvent être conservées dans un congélateur à -80 °C ; Vous pouvez également procéder au dépôt de la matrice. Les lames doivent être placées dans une boîte porte-lames, rincées avec du N₂ gazeux et scellées avec un film pour éviter l’oxydation de l’échantillon (voir le tableau des matériaux).
2. Dépôt matriciel
   1. Placez la lame contenant les tranches dans un dessiccateur sous vide jusqu’à ce qu’elle atteigne la température ambiante.
   2. Faites des notes d’enseignement à l’aide d’un stylo correcteur dans chaque coin de diapositive. Numérisez la diapositive à l’aide d’un scanner de table. Réglez sur une résolution de 4 800 ppi.
   3. Peser 30 mg d’acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB ) à l’aide d’une balance d’analyse et préparer 1 mL d’acide trifluoroacétique 1:1 méthanol à 0,1 % (TFA ; Table des matériaux) solution pour dissoudre le DHB.
   4. Remplissez une seringue en verre de 1 mL (voir le tableau des matériaux) avec une solution de DHB et placez-la dans un pousse-seringue (voir le tableau des matériaux) réglé à un débit de 0,8 mL/h.
   5. À l’aide d’un tube PEEK, connectez la seringue à une aiguille d’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI) (voir le tableau des matériaux).
   6. Connectez N₂ à l’aiguille APCI et réglez-la sur un débit de 12,5 psi .
   7. Fixez l’aiguille APCI à la plate-forme de mouvement xy (voir Tableau des matériaux). Assurez-vous que la pointe de l’aiguille APCI est à 4 cm au-dessus de la lame.
   8. À l’aide du logiciel de dessin (voir Tableau des matériaux et Figure supplémentaire 1), configurez la plate-forme de mouvement xy pour qu’elle suive le modèle. Le gabarit est constitué de lignes parallèles horizontales espacées de 1 mm.
   9. Pour obtenir un dépôt matriciel, attendez que la plate-forme de mouvement xy répète le modèle 20 fois.
      ATTENTION : Le dépôt de matrice doit être effectué dans une hotte chimique.
3. Acquisition d’images
   1. Placez la lame dans le spectromètre de masse (voir Tableau des matériaux).
   2. Utilisez des marques de stylo de correction pour définir des points d’enseignement sur le logiciel référencé (voir Tableau des matériaux).
   3. Réglez la puissance laser (60 %), la mise au point laser (moyenne), le nombre de tirs (100) et la polarité dans le logiciel (voir Tableau des matériaux). Définissez un facteur de réduction des données de 99 % et enregistrez le fichier FID pour l’étalonnage des données a posteriori. Enregistrez la méthode.
   4. Délimitez la zone à analyser à l’aide de l’outil Ajouter une région de mesure de polygone du logiciel du spectromètre de masse. Modifier les paramètres de la région de mesure en indiquant la méthode enregistrée à l’étape précédente et la largeur de la trame à 100 μm (figure supplémentaire S4A).
   5. Lancez l’acquisition d’images.
4. Analyse des données
   1. Utilisez le groupe de matrices et les contaminants connus pour créer une liste de masse dans le logiciel référencé (voir Tableau des matériaux) dans l’onglet Étalonnage (figure supplémentaire S4B).
      1. Ouvrez les données à étalonner dans le logiciel référencé (voir Tableau des matériaux). Dans l’onglet étalonnage , ouvrez la liste de masses créée et ouvrez une boîte de dialogue en cliquant avec le bouton droit de la souris et en choisissant l’option de verrouillage des masses (Figure supplémentaire S4C).
      2. Sélectionnez le mode de fenêtre gaussienne avec un élargissement gaussien de 0,5 et un élargissement de ligne de 3,5. Laissez l’étalonnage en ligne non coché. Sélectionnez le mode (simple), le seuil (1 000) et la tolérance de masse (5 ppm). Calibrez les données avec le processus et enregistrez l’outil de données 2D (figure supplémentaire S4C).
   2. Après l’étalonnage, exportez les données vers le laboratoire SCiLS ou un autre logiciel compatible et définissez le seuil de valeur m/z souhaité (plage choisie : 150 à 2 500).
      REMARQUE : Selon la taille du fichier ou les caractéristiques de l’ordinateur, cela peut prendre un certain temps.
   3. Choisissez une méthode de normalisation entre le nombre total d’ions (TIC) ou la moyenne quadratique (RMS).
      NOTE : Pour cette analyse, TIC a été choisi.
   4. Si les analytes à cartographier sont connus, tracez chaque valeur m/z pour chaque analyte et enregistrez les images générées et le tracé spectral moyen.
      NOTE : Dans ce travail, les valeurs m/z des oligomères d’hexose ont été choisies en considérant l’adduit potassique.

2. Spectroscopie à dispersion d’énergie (EDS)

1. Protocole de sectionnement des semences
   1. Acquérir une tranche de semence mince dans une scie à tronçonner (voir Tableau des matériaux).
   2. Coupez les graines avec les paramètres suivants : vitesse de coupe de 500 tr/min, charge de charge de 100 N et lame de plaquette diamantée 15 HC (voir tableau des matériaux).
      REMARQUE : Gérez l’élimination manuelle des fibres des graines en raison de l’adhérence nécessaire à la prise dans les étaux de précision fixés au goniomètre. Nettoyez la lame avant utilisation, en coupant une section de la graine pour éviter d’ajouter des minéraux indésirables pendant l’analyse.
   3. Nettoyer les échantillons à l’air comprimé pour éliminer tous les résidus de particules de la coupe (voir tableau des matériaux).
   4. Fixez une section de semence dans du ruban conducteur double face en carbone (voir tableau des matériaux) dans le support.
2. Conditions d’analyse
   1. Fixez le support avec une section d’amorçage à l’intérieur de la chambre à vide d’un microscope électronique à balayage (MEB) couplé à un EDS (voir tableau des matériaux).
   2. Acquérir des micrographies électroniques sur un modèle de microscope avec une accélération de 20 kV et une taille de spot de 4,0, en utilisant des signaux électroniques secondaires (voir Tableau des matériaux), des électrons rétrodiffusés (détecteur à l’état solide fixé sur la pièce polaire) et des mélanges de ces deux types de signaux (MIX), en construisant des images artificiellement colorées.
   3. Pour l’acquisition des spectres EDS, utilisez un spectromètre (voir Tableau des matériaux) couplé au MEB susmentionné. La configuration des conditions de l’acquisition d’images à partir de l’EDS est la même que celle du MEB.
   4. Définissez les degrés d’inclinaison, l’élévation et l’azimut à 0,0, 35,0 et 0,0, respectivement.
3. Acquisition de données
   1. Définissez trois zones différentes avec un grossissement de 91x de la section d’amorçage pour acquérir des données.
   2. Identifier les pics dans le spectre à la fin de l’acquisition ou pendant l’acquisition. Utilisez le bouton d’étape Confirmer les éléments pour identifier manuellement les pics.
   3. Réglez le temps d’acquisition sur 60 s pour chaque zone sélectionnée. Réglez le temps de traitement sur cinq ; Les paramètres sont disponibles pour un temps de traitement de un à six.
      REMARQUE : Les signes des éléments sont constants et s’additionnent, tandis que les bruits sont aléatoires et délétères. Plus le temps de traitement est long, plus le bruit est faible.
   4. Les paramètres par défaut pour afficher des résultats quantitatifs significatifs sont supérieurs à deux sigmas (écart-type). Réglez deux sigmas à zéro pour réduire les résultats indésirables.
   5. Normaliser chaque intensité des éléments ; il s’agit d’un paramètre standardisé dans le logiciel (voir Tableau des matériaux).
   6. Pour analyser les données, exportez-les dans un fichier DOC.
4. Analyse des données
   1. Assurer la mesure précise des intensités de pic pour l’analyse élémentaire quantitative.
   2. Les pics qui se chevauchent nécessitent une déconvolution pour une meilleure séparation des pics ; Soustrayez un arrière-plan bruyant si nécessaire.
   3. Lorsqu’il n’y a pas de chevauchement, augmentez le gain pour amplifier les signaux et améliorer la qualité du spectre.

Résultats

Le protocole conçu a permis l’analyse MALDI-IMS des graines d’E. precatoria et d’E. edulis . En conséquence, nous avons pu confirmer le poids moléculaire des glucides et le degré de polymérisation (DP) comme une élucidation structurelle partielle. Les informations moléculaires fournies par l’analyse MALDI-IMS (Figure 1 et Figure 2) ont montré des pics représentant des adduits [M+K]⁺ d’oligomères d...

Discussion

Les plantes sont composées de tissus spécialisés pour des fonctions biochimiques spécifiques. Par conséquent, le protocole de préparation des échantillons pour MALDI-IMS doit être conçu en fonction de divers tissus végétaux ayant des propriétés physicochimiques spécifiques, car les échantillons doivent conserver leur distribution et leur abondance d’analyte d’origine pour un signal de haute qualité et une résolution spatiale⁸.

Avant l’analyse MALD...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	149357
APCI needle	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	602193
AxiDraw V3 xy motion platform	Evil Mad Scientist, CA, USA	2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software			creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape	3M, USA	1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		image acquisition
FTMS Processing	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		data calibration
Gelatin from bovine skin	Sigma Aldrich Co, MO, USA	G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany	0358 38926
indium tin oxide coated glass slide	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8237001
Inkscape	Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter	Buehler, Illinois, USA
Methanol	J.T.Baker	9093-03
Mili-Q water			18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher HealthCare, Texas, USA	4585
Parafilm "M" Sealing Film	Amcor	HS234526B
Quanta 450 FEG	FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V	Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump	kdScientific, MA, USA	78-9100K
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	302031
X-Max spectrometer	Oxford Instruments, Ableton, UK