Préparation de graines de palmier dur pour l’analyse par spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice

Résumé

Ce protocole visait à décrire des directives détaillées sur la préparation de sections d’échantillons de graines dures à faible teneur en eau pour l’analyse MALDI-IMS, en maintenant la distribution et l’abondance d’origine des analytes et en fournissant un signal de haute qualité et une résolution spatiale.

Résumé

La spectrométrie de masse par désorption/ionisation-imagerie laser assistée par matrice (MALDI-IMS) est appliquée pour identifier les composés dans leur environnement d’origine. Actuellement, MALDI-IMS est fréquemment utilisé dans les analyses cliniques. Pourtant, il existe une excellente perspective pour mieux appliquer cette technique afin de comprendre les informations physiologiques des composés chimiques dans les tissus végétaux. Cependant, la préparation peut être difficile pour des échantillons spécifiques de matériaux botaniques, car MALDI-IMS nécessite des tranches minces (12-20 μm) pour une acquisition de données appropriée et une analyse réussie. En ce sens, nous avons précédemment développé un protocole de préparation d’échantillons pour obtenir de fines coupes de graines dures d’Euterpe oleracea (palmier açaí), permettant leur cartographie moléculaire par MALDI-IMS.

Ici, nous montrons que le protocole développé est adapté à la préparation d’autres graines du même genre. En bref, le protocole était basé sur l’immersion des graines dans de l’eau désionisée pendant 24 heures, l’enrobage d’échantillons avec de la gélatine et leur coupe dans un cryostat acclimaté. Ensuite, pour le dépôt de la matrice, une plate-forme de mouvement xy a été couplée à une pulvérisation à aiguille par ionisation par électronébulisation (ESI) utilisant une solution d’acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB) 1:1 (v/v) et de méthanol avec 0,1 % d’acide trifluoroacétique à 30 mg/mL. Les données sur les graines d’E. precatoria et d’E. edulis ont été traitées à l’aide d’un logiciel pour cartographier leurs métabolites.

Les oligomères d’hexose ont été cartographiés dans des coupes d’échantillons pour prouver l’adéquation du protocole pour ces échantillons, car on sait que ces graines contiennent de grandes quantités de mannane, un polymère de l’hexose mannose. En conséquence, des pics d’oligomères d’hexose, représentés par des adduits [M + K]⁺ de (Δ = 162 Da), ont été identifiés. Ainsi, le protocole de préparation des échantillons, précédemment développé sur mesure pour les semences d’E. oleracea , a également permis l’analyse MALDI-IMS de deux autres graines de palmier dur. En bref, la méthode pourrait constituer un outil précieux pour la recherche en morpho-anatomie et physiologie des matériaux botaniques, en particulier à partir d’échantillons résistants aux coupures.

Introduction

La spectrométrie de masse par désorption/ionisation par imagerie laser assistée par matrice (MALDI-IMS) est une méthode puissante qui permet l’affectation bidimensionnelle de biomolécules, fournit une étude non ciblée des composés ionisables et détermine leur distribution spatiale, en particulier dans les échantillons biologiques ^1,2. Depuis deux décennies, cette technique permet de détecter et d’identifier simultanément des lipides, des peptides, des glucides, des protéines, d’autres métabolites et des molécules synthétiques telles que des médicaments thérapeutiques ^3,4

Protocole

Les graines d’Euterpe precatoria ont été gracieusement offertes par l’Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Manaus, Brésil), et les graines d’Euterpe edulis ont été gracieusement données par le Silo - Arte e Latitude Rural (Resende, Brésil) après le processus de dépulpage industriel. Les graines ont été conservées dans des boîtes en plastique scellées à température ambiante.

1. Spectroscopie de masse à désorption/ionisation-imagerie laser assistée par matrice (MALDI-IMS)

1. Protocole de sectionnement des semences
   1. Laisser reposer trois graines de chaque espèce dans de l’eau déminéralisé....

Discussion

Les plantes sont composées de tissus spécialisés pour des fonctions biochimiques spécifiques. Par conséquent, le protocole de préparation des échantillons pour MALDI-IMS doit être conçu en fonction de divers tissus végétaux ayant des propriétés physicochimiques spécifiques, car les échantillons doivent conserver leur distribution et leur abondance d’analyte d’origine pour un signal de haute qualité et une résolution spatiale⁸.

Avant l’analyse MALD.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	149357
APCI needle	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	602193
AxiDraw V3 xy motion platform	Evil Mad Scientist, CA, USA	2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software			creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape	3M, USA	1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		image acquisition
FTMS Processing	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		data calibration
Gelatin from bovine skin	Sigma Aldrich Co, MO, USA	G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany	0358 38926
indium tin oxide coated glass slide	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8237001
Inkscape	Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter	Buehler, Illinois, USA
Methanol	J.T.Baker	9093-03
Mili-Q water			18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher HealthCare, Texas, USA	4585
Parafilm "M" Sealing Film	Amcor	HS234526B
Quanta 450 FEG	FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V	Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump	kdScientific, MA, USA	78-9100K
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	302031
X-Max spectrometer	Oxford Instruments, Ableton, UK