Preparation of Hard Palm Seeds for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Imaging Mass Spectrometry Analysis

요약

이 프로토콜은 MALDI-IMS 분석을 위해 수분 함량이 낮은 경질 종자 샘플 절편 준비에 대한 자세한 지침을 설명하고, 분석물의 원래 분포 및 풍부도를 유지하고, 고품질 신호 및 공간 분해능을 제공하는 것을 목표로 했습니다.

초록

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 이미징 질량분석법(MALDI-IMS)은 기본 환경에서 화합물을 식별하는 데 적용됩니다. 현재 MALDI-IMS는 임상 분석에 자주 사용됩니다. 그럼에도 불구하고 식물 조직에서 화합물의 생리학적 정보를 이해하기 위해 이 기술을 더 잘 적용할 수 있는 훌륭한 관점이 존재합니다. 그러나 MALDI-IMS는 적절한 데이터 수집 및 성공적인 분석을 위해 얇은 슬라이스(12-20μm)가 필요하기 때문에 식물 재료의 특정 샘플에 대한 준비가 어려울 수 있습니다. 이러한 의미에서 이전에는 Euterpe oleracea (açaí palm) 경질 종자의 얇은 부분을 얻기 위한 샘플 준비 프로토콜을 개발하여 MALDI-IMS에 의한 분자 매핑을 가능하게 했습니다.

여기에서 우리는 개발 된 프로토콜이 동일한 속의 다른 종자를 준비하는 데 적합하다는 것을 보여줍니다. 간단히 말해서, 프로토콜은 씨앗을 탈이온수에 24시간 동안 담그고, 샘플을 젤라틴으로 삽입하고, 순응된 저온 유지 장치에서 절단하는 것을 기반으로 했습니다. 그런 다음 매트릭스 증착을 위해 1:1(v/v) 2,5-디하이드록시벤조산(DHB) 및 30mg/mL에서 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 메탄올 용액을 사용하여 xy 모션 플랫폼을 전기분무 이온화(ESI) 니들 스프레이에 결합했습니다. E. precatoria 및 E. edulis 종자 데이터는 대사 산물 패턴을 매핑하기 위해 소프트웨어를 사용하여 처리되었습니다.

헥소스 올리고머는 샘플 조각 내에서 매핑되어 해당 샘플에 대한 프로토콜의 적절성을 증명했으며, 이러한 씨앗에는 헥소스 만노스의 중합체인 만난이 다량 포함되어 있는 것으로 알려져 있습니다. 그 결과, (Δ = 162 Da)의 [M + K]⁺ 부가물로 표시되는 헥소스 올리고머의 피크가 확인되었습니다. 따라서, 이전에 E. oleracea 씨를 위해 맞춤형으로 개발된 표본 준비 의정서는, 또한 2개의 다른 단단한 야자 씨의 MALDI-IMS 분석을 가능하게 했습니다. 요컨대, 이 방법은 식물 재료의 형태 해부학 및 생리학 연구, 특히 절단 저항성 샘플에 대한 귀중한 도구가 될 수 있습니다.

서문

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 이미징 질량 분석법(MALDI-IMS)은 2차원 생체 분자 할당을 허용하고 이온화 가능한 화합물의 비표적 조사를 제공하며 특히 생물학적 샘플 ^1,2에서 공간 분포를 결정하는 강력한 방법입니다. 20년 동안 이 기술은 지질, 펩타이드, 탄수화물, 단백질, 기타 대사 산물 및 치료 약물과 같은 합성 분자의 동시 검출 및 식별을 가능하게 했습니다 ^3,4. MALDI-IMS는 생물학 표본의 적출, 정화, 별거, 레테르를 붙이고, 또는 얼룩이 지도록 하지 않고 조직 표본 표면에 있는 화학 분석을 촉진합니다. 그러나 성공적인 분석을 위해 이 기법의 중추적인 단계는 시료 전처리이며, 특히 식물 조직에서는 환경 순응으로 인해 광범위하고 복잡한 장기에 특화되고 변형된다⁵.

고유한 식물 조직 물리화학적 특성 때문에, MALDI-IMS 분석의 요구 사항에 적응하고 절편 준비 ^6,7

프로토콜

Euterpe precatoria 씨앗은 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (브라질 마나우스)에서 친절하게 기증했으며, Euterpe edulis 씨앗은 산업 펄프 제거 공정 후 Silo - Arte e Latitude Rural (Resende, Brazil)에서 친절하게 기증했습니다. 씨앗은 밀봉된 플라스틱 상자에 넣어 실온에서 보관했습니다.

1. 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 이미징 질량 분석법(MALDI-IMS)

1. 시드 절편 프로토콜
   1. 각 종의 씨앗 3개를 탈이온수에 24시간 동안 그대로 둡니다.
   2. 다음날 저온 유지 장치( 재료 표 참조)를 켜고 -20°C에 도달하도록 합니다.
   3. 젖은 씨앗을 물에서 꺼냅니다. 마이크로톰 칼날을 사용하여 씨앗을 반으로 자릅니다( 재료 표 참조).
   4. 신선하고 따뜻한(10%) 젤라틴 용액을 준비합니다( 재료 표 참조).
   5. 씨앗의 절반을 틀에 놓고 갓 만든 젤라틴으로 채웁니다. 저온 유지 장치로 가져가기 전에 -8....

토론

식물은 특정 생화학적 기능을 위한 특수 조직으로 구성되어 있습니다. 따라서 MALDI-IMS용 시료 전처리 프로토콜은 시료가 고품질 신호 및 공간 분해능⁸을 위해 원래의 분석물 분포와 풍부함을 유지해야 하기 때문에 특정 물리화학적 특성을 가진 다양한 식물 조직에 따라 설계되어야 합니다.

MALDI-IMS 분석 전에 주요 고려 사항은 샘플을 적절하게 수집하고 저장?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	149357
APCI needle	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	602193
AxiDraw V3 xy motion platform	Evil Mad Scientist, CA, USA	2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software			creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape	3M, USA	1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		image acquisition
FTMS Processing	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		data calibration
Gelatin from bovine skin	Sigma Aldrich Co, MO, USA	G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany	0358 38926
indium tin oxide coated glass slide	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8237001
Inkscape	Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter	Buehler, Illinois, USA
Methanol	J.T.Baker	9093-03
Mili-Q water			18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher HealthCare, Texas, USA	4585
Parafilm "M" Sealing Film	Amcor	HS234526B
Quanta 450 FEG	FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V	Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump	kdScientific, MA, USA	78-9100K
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	302031
X-Max spectrometer	Oxford Instruments, Ableton, UK