Preparation of Hard Palm Seeds for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Imaging Mass Spectrometry Analysis

요약

이 프로토콜은 MALDI-IMS 분석을 위해 수분 함량이 낮은 경질 종자 샘플 절편 준비에 대한 자세한 지침을 설명하고, 분석물의 원래 분포 및 풍부도를 유지하고, 고품질 신호 및 공간 분해능을 제공하는 것을 목표로 했습니다.

초록

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 이미징 질량분석법(MALDI-IMS)은 기본 환경에서 화합물을 식별하는 데 적용됩니다. 현재 MALDI-IMS는 임상 분석에 자주 사용됩니다. 그럼에도 불구하고 식물 조직에서 화합물의 생리학적 정보를 이해하기 위해 이 기술을 더 잘 적용할 수 있는 훌륭한 관점이 존재합니다. 그러나 MALDI-IMS는 적절한 데이터 수집 및 성공적인 분석을 위해 얇은 슬라이스(12-20μm)가 필요하기 때문에 식물 재료의 특정 샘플에 대한 준비가 어려울 수 있습니다. 이러한 의미에서 이전에는 Euterpe oleracea (açaí palm) 경질 종자의 얇은 부분을 얻기 위한 샘플 준비 프로토콜을 개발하여 MALDI-IMS에 의한 분자 매핑을 가능하게 했습니다.

여기에서 우리는 개발 된 프로토콜이 동일한 속의 다른 종자를 준비하는 데 적합하다는 것을 보여줍니다. 간단히 말해서, 프로토콜은 씨앗을 탈이온수에 24시간 동안 담그고, 샘플을 젤라틴으로 삽입하고, 순응된 저온 유지 장치에서 절단하는 것을 기반으로 했습니다. 그런 다음 매트릭스 증착을 위해 1:1(v/v) 2,5-디하이드록시벤조산(DHB) 및 30mg/mL에서 0.1% 트리플루오로아세트산이 포함된 메탄올 용액을 사용하여 xy 모션 플랫폼을 전기분무 이온화(ESI) 니들 스프레이에 결합했습니다. E. precatoria 및 E. edulis 종자 데이터는 대사 산물 패턴을 매핑하기 위해 소프트웨어를 사용하여 처리되었습니다.

헥소스 올리고머는 샘플 조각 내에서 매핑되어 해당 샘플에 대한 프로토콜의 적절성을 증명했으며, 이러한 씨앗에는 헥소스 만노스의 중합체인 만난이 다량 포함되어 있는 것으로 알려져 있습니다. 그 결과, (Δ = 162 Da)의 [M + K]⁺ 부가물로 표시되는 헥소스 올리고머의 피크가 확인되었습니다. 따라서, 이전에 E. oleracea 씨를 위해 맞춤형으로 개발된 표본 준비 의정서는, 또한 2개의 다른 단단한 야자 씨의 MALDI-IMS 분석을 가능하게 했습니다. 요컨대, 이 방법은 식물 재료의 형태 해부학 및 생리학 연구, 특히 절단 저항성 샘플에 대한 귀중한 도구가 될 수 있습니다.

서문

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 이미징 질량 분석법(MALDI-IMS)은 2차원 생체 분자 할당을 허용하고 이온화 가능한 화합물의 비표적 조사를 제공하며 특히 생물학적 샘플 ^1,2에서 공간 분포를 결정하는 강력한 방법입니다. 20년 동안 이 기술은 지질, 펩타이드, 탄수화물, 단백질, 기타 대사 산물 및 치료 약물과 같은 합성 분자의 동시 검출 및 식별을 가능하게 했습니다 ^3,4. MALDI-IMS는 생물학 표본의 적출, 정화, 별거, 레테르를 붙이고, 또는 얼룩이 지도록 하지 않고 조직 표본 표면에 있는 화학 분석을 촉진합니다. 그러나 성공적인 분석을 위해 이 기법의 중추적인 단계는 시료 전처리이며, 특히 식물 조직에서는 환경 순응으로 인해 광범위하고 복잡한 장기에 특화되고 변형된다⁵.

고유한 식물 조직 물리화학적 특성 때문에, MALDI-IMS 분석의 요구 사항에 적응하고 절편 준비 ^6,7 동안 조직의 원래 모양을 보존하기 위해 적응된 프로토콜이 필요합니다. 종자와 같은 비전통적 샘플의 경우, 확립된 프로토콜⁸은 이러한 조직이 단단한 세포벽과 낮은 수분 함량을 가지고 있기 때문에 적용할 수 없으며, 이는 쉽게 절편 단편화를 유발하고 화합물 비국소화(compound delocalization⁾⁹를 유발할 수 있다.

우리 연구 그룹은 분자 매핑에 대한 실험 데이터와 임대 가능한 açaí 펄프¹³의 생산 중에 다량으로 생성되는 부산물인 açaí(Euterpe oleracea Mart.) 종자^10,11,12의 MALDI-IMS 분석을 위한 적응된 프로토콜을 발표했습니다. 이 아이디어는 아사이 종자에 있는 다양한 대사 산물의 현장 매핑을 위한 프로토콜을 개발하여 현재 상업적으로 연구되지 않고 있는 이 농업 폐기물의 가능한 용도를 제안하는 데 도움이 되는 것이었습니다. 그러나 açaí 종자의 내성으로 인해 MALDI-IMS 분석에서 적절한 샘플 절편을 얻기 위해 프로토콜을 맞춤화해야 했습니다.

이러한 맥락에서 경제적으로 중요한 açaí 펄프는 유사한 감각 특성을 가진 Euterpe 속 야자수에서 다른 과일의 상업화를 증가시키는 동기를 부여했습니다. açaí^14,15의 대안으로 산업 규모로 생산된 두 개의 신흥 야자수 열매는 아마존 건조 지대에서 자라는 E. precatoria(açaí-do-amazonas로 알려짐)와 대서양 숲에서 전형적으로 자라는 E. edulis(juçara로 알려짐)입니다. 그럼에도 불구하고 açaí-do-amazonas와 juçara의 소비는 사용되지 않고 자세한 화학 성분에 대해 지금까지 연구되지 않은 저항성 및 먹을 수없는 종자의 동일한 축적으로 이어집니다.

따라서, 우리는 이전에 고안된 프로토콜이 MALDI-IMS에 의한 분자 매핑을 위한 E. precatoria 및 E. edulis 종자를 분석하기 위해 몇 가지 적응 없이 사용될 수 있음을 여기에서 설명하며, 이러한 자원의 구성 분석에 사용할 수 있고 잠재적인 생명 공학적 용도를 결정하는 데 도움이 될 수 있는 강력한 도구임을 입증합니다. 더욱, 여기에서 제공된 상세한 묘사는 MALDI-IMS 분석을 위한 저항하는 물자 준비에 있는 유사한 어려움을 가진 다른 사람을 도울 수 있습니다.

프로토콜

Euterpe precatoria 씨앗은 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (브라질 마나우스)에서 친절하게 기증했으며, Euterpe edulis 씨앗은 산업 펄프 제거 공정 후 Silo - Arte e Latitude Rural (Resende, Brazil)에서 친절하게 기증했습니다. 씨앗은 밀봉된 플라스틱 상자에 넣어 실온에서 보관했습니다.

1. 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 이미징 질량 분석법(MALDI-IMS)

1. 시드 절편 프로토콜
   1. 각 종의 씨앗 3개를 탈이온수에 24시간 동안 그대로 둡니다.
   2. 다음날 저온 유지 장치( 재료 표 참조)를 켜고 -20°C에 도달하도록 합니다.
   3. 젖은 씨앗을 물에서 꺼냅니다. 마이크로톰 칼날을 사용하여 씨앗을 반으로 자릅니다( 재료 표 참조).
   4. 신선하고 따뜻한(10%) 젤라틴 용액을 준비합니다( 재료 표 참조).
   5. 씨앗의 절반을 틀에 놓고 갓 만든 젤라틴으로 채웁니다. 저온 유지 장치로 가져가기 전에 -80°C에서 2시간 동안 얼립니다.
   6. 최적의 절단 온도 화합물(OCT, 재료 표 참조)을 사용하여 내장된 시드를 저온 유지 장치 지지대에 부착하고 OCT 경화를 위해 저온 유지 장치 내부에서 10분 동안 그대로 둡니다.
   7. 구리 양면 접착 테이프( 재료 표 참조)를 인듐 주석 산화물 코팅 유리 슬라이드(ITO 슬라이드, 재료 표 참조)에 추가합니다.
   8. 각 종에서 20μm 두께의 절편을 생산하여 ITO 유리 슬라이드에 부착된 구리 양면 접착 테이프에 놓습니다.
      알림: 이 시점에서 슬라이드에 수집된 조각은 -80°C 냉동고에 보관할 수 있습니다. 또는 매트릭스 증착으로 진행합니다. 슬라이드는 홀더 슬라이드 박스에 넣고 기체 N₂로 세척하고 샘플 산화를 방지하기 위해 필름으로 밀봉해야 합니다( 재료 표 참조).
2. 매트릭스 증착
   1. 슬라이스가 들어 있는 슬라이드를 실온에 도달할 때까지 진공 데시케이터에 넣습니다.
   2. 각 슬라이드 모서리에 수정 펜을 사용하여 교사 표시를 합니다. 테이블 스캐너를 사용하여 슬라이드를 스캔합니다. 4,800ppi의 해상도로 설정합니다.
   3. 분석 저울을 사용하여 30mg의 2,5-디하이드록시벤조산(DHB, 재료 표 참조)을 칭량하고 1:1 메탄올:0.1% 트리플루오로아세트산(TFA; 재료 목차) DHB를 녹이는 솔루션.
   4. 1mL 유리 주사기( 재료 표 참조)에 DHB 용액을 채우고 유속을 0.8mL/h로 설정한 주사기 펌프( 재료 표 참조)에 넣습니다.
   5. PEEK 튜브를 사용하여 주사기를 대기압 화학 이온화(APCI) 바늘에 연결합니다( 재료 표 참조).
   6. N₂ 를 APCI 바늘에 연결하고 12.5psi 유량으로 설정합니다.
   7. APCI 바늘을 xy 모션 플랫폼에 부착합니다( 재료 표 참조). APCI 바늘 끝이 슬라이드에서 4cm 위에 있는지 확인하십시오.
   8. 드로잉 소프트웨어( 재료 표 및 보충 그림 1 참조)를 사용하여 템플릿을 따르도록 xy 모션 플랫폼을 설정합니다. 템플릿은 1mm 간격의 수평 평행선으로 구성됩니다.
   9. 매트릭스 증착을 달성하려면 xy 모션 플랫폼이 템플릿을 20번 반복할 때까지 기다립니다.
      주의 : 매트릭스 증착은 화학 흄 후드에서 수행해야 합니다.
3. 이미징 획득
   1. 슬라이드를 질량 분석기에 놓습니다( 재료 표 참조).
   2. 수정 펜 표시를 사용하여 참조된 소프트웨어에서 티칭 포인트를 설정합니다( 자료 표 참조).
   3. 소프트웨어에서 레이저 출력(60%), 레이저 초점(중간), 촬영 횟수(100) 및 극성을 설정합니다( 재료 표 참조). 99% 데이터 축소 계수 를 설정하고 사후 데이터 보정을 위해 FID 파일을 저장합니다. 메서드를 저장합니다.
   4. 질량분석기 소프트웨어의 다각형 측정 영역 추가 도구를 사용하여 분석할 영역을 구분합니다. 이전 단계에서 저장한 방법과 래스터 폭을 100μm로 나타내는 측정 영역 매개변수를 편집합니다(보충 그림 S4A).
   5. 이미징 획득을 시작합니다.
4. 데이터 분석
   1. 매트릭스 클러스터와 알려진 오염 물질을 사용하여 교정제 탭(보충 그림 S4B)의 참조된 소프트웨어(재료 표 참조)에서 질량 목록을 생성합니다.
      1. 참조된 소프트웨어에서 보정할 데이터를 엽니다( 재료 표 참조). 캘리브레이션 탭에서 생성된 질량 목록을 열고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 대화 상자를 열고 고정 질량 설정 옵션을 선택합니다(보충 그림 S4C).
      2. 0.5 가우스 확장과 3.5 라인 확장이 있는 가우스 창 모드를 선택합니다. 온라인 보정을 선택하지 않은 상태로 둡니다. 모드(단일), 임계값(1,000) 및 질량 허용 오차(5ppm)를 선택합니다. 프로세스로 데이터를 보정하고 2D 데이터 도구를 저장합니다(보충 그림 S4C).
   2. 보정 후 데이터를 SCiLS 실험실 또는 기타 호환 가능한 소프트웨어로 내보내고 원하는 m/z 값 임계값(선택한 범위: 150 - 2,500)을 설정합니다.
      참고: 파일 크기 또는 컴퓨터 특성에 따라 다소 시간이 걸릴 수 있습니다.
   3. 총 이온 수(TIC) 또는 제곱 평균 제곱근(RMS) 중에서 정규화 방법을 선택합니다.
      참고: 이 분석을 위해 TIC가 선택되었습니다.
   4. 매핑할 분석물을 알고 있는 경우 각 분석물에 대한 각 m/z 값을 플로팅하고 생성된 이미지와 스펙트럼 평균 플롯을 저장합니다.
      참고: 이 연구에서는 육당 올리고머의 m/z 값을 칼륨 부가물을 고려하여 선택했습니다.

2. 에너지 분산 분광법(EDS)

1. 시드 절편 프로토콜
   1. 절단 톱 기계에서 얇은 시드 조각을 얻습니다( 재료 표 참조).
   2. 500RPM 절단 속도, 100N 부하 충전 및 15HC 다이아몬드 웨이퍼링 블레이드(재료 표 참조)의 매개변수로 씨앗을 자릅니다.
      알림: 고니오미터에 부착된 정밀 바이스의 홀드에 필요한 접착력으로 인해 씨앗에서 섬유를 수동으로 제거하십시오. 사용하기 전에 칼날을 청소하고 분석 중에 바람직하지 않은 미네랄이 추가되지 않도록 씨앗의 일부를 자릅니다.
   3. 압축 공기로 샘플을 세척하여 절단에서 모든 입자 잔류물을 제거합니다( 재료 표 참조).
   4. 지지대의 탄소 양면 전도성 테이프( 재료 표 참조)로 시드 섹션을 고정합니다.
2. 분석 조건
   1. EDS와 결합된 주사전자현미경(SEM)의 진공 챔버 내부에 시드 섹션이 있는 지지대를 부착합니다( 재료 표 참조).
   2. 2차 전자 신호(재료 표 참조), 후방 산란 전자(극성 조각에 고정된 고체 상태 검출기) 및 이 두 가지 유형의 신호(MIX)의 혼합물을 사용하여 20kV 가속도 및 4.0의 스폿 크기를 가진 모델 현미경에서 전자 현미경 사진을 획득하여 인위적으로 컬러 이미지를 구축합니다.
   3. EDS 스펙트럼을 획득하려면 앞서 언급한 SEM과 결합된 분광계( 재료 표 참조)를 사용하십시오. EDS에서 이미지 획득의 조건 구성은 SEM과 동일합니다.
   4. 기울기 각도, 고도 및 방위각을 각각 0.0, 35.0 및 0.0으로 설정합니다.
3. 데이터 수집
   1. 시드 부분을 91x 배율로 3 개의 다른 영역을 설정하여 데이터를 수집합니다.
   2. 수집 종료 시 또는 수집 중에 스펙트럼의 피크를 식별합니다. 요소 확인 단계 버튼을 사용하여 피크를 수동으로 식별할 수 있습니다.
   3. 선택한 각 영역에 대해 획득 시간을 60초로 설정합니다. 프로세스 시간을 5로 설정합니다. 매개변수는 1에서 6까지의 프로세스 시간 동안 사용할 수 있습니다.
      알림: 요소의 징후는 일정하고 합산되는 반면 소음은 무작위적이고 유해합니다. 처리 시간이 길수록 노이즈가 줄어듭니다.
   4. 유의한 정량적 결과를 표시하는 기본 설정은 2 시그마(표준 편차) 이상입니다. 바람직하지 않은 결과를 줄이려면 2 시그마를 0으로 설정합니다.
   5. 요소의 각 강도를 정규화합니다. 이것은 소프트웨어의 표준화된 매개변수입니다( 재료 표 참조).
   6. 데이터를 분석하려면 DOC 파일로 내보냅니다.
4. 데이터 분석
   1. 정량적 원소 분석을 위해 피크 강도의 정확한 측정을 보장합니다.
   2. 겹치는 피크는 더 나은 피크 분리를 위해 디콘볼루션이 필요합니다. 필요한 경우 노이즈가 있는 배경을 뺍니다.
   3. 겹침이 없으면 게인을 높여 신호를 증폭하고 스펙트럼 품질을 향상시킵니다.

결과

고안된 프로토콜은 E. precatoria 및 E. edulis 종자에 대한 MALDI-IMS 분석을 가능하게 했습니다. 그 결과, 탄수화물의 분자량과 중합도(DP)를 부분적인 구조적 해명으로 확인할 수 있었습니다. MALDI-IMS 분석(그림 1 및 그림 2)에서 제공하는 분자 정보는 매트릭스에 염을 첨가하지 않고 헥소스 올리고머(Δ = 162Da)의 [M+K]⁺ 부가물을 ...

토론

식물은 특정 생화학적 기능을 위한 특수 조직으로 구성되어 있습니다. 따라서 MALDI-IMS용 시료 전처리 프로토콜은 시료가 고품질 신호 및 공간 분해능⁸을 위해 원래의 분석물 분포와 풍부함을 유지해야 하기 때문에 특정 물리화학적 특성을 가진 다양한 식물 조직에 따라 설계되어야 합니다.

MALDI-IMS 분석 전에 주요 고려 사항은 샘플을 적절하게 수집하고 저장?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	149357
APCI needle	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	602193
AxiDraw V3 xy motion platform	Evil Mad Scientist, CA, USA	2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software			creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape	3M, USA	1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		image acquisition
FTMS Processing	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		data calibration
Gelatin from bovine skin	Sigma Aldrich Co, MO, USA	G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany	0358 38926
indium tin oxide coated glass slide	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8237001
Inkscape	Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter	Buehler, Illinois, USA
Methanol	J.T.Baker	9093-03
Mili-Q water			18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher HealthCare, Texas, USA	4585
Parafilm "M" Sealing Film	Amcor	HS234526B
Quanta 450 FEG	FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V	Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump	kdScientific, MA, USA	78-9100K
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	302031
X-Max spectrometer	Oxford Instruments, Ableton, UK