基质辅助激光解吸/电离成像质谱分析用硬棕榈籽的制备

摘要

该协议旨在描述用于MALDI-IMS分析的低含水量硬种子样品切片的详细指南，保持分析物的原始分布和丰度，并提供高质量的信号和空间分辨率。

摘要

基质辅助激光解吸/电离成像质谱法（MALDI-IMS）用于鉴定天然环境中的化合物。目前，MALDI-IMS在临床分析中经常使用。尽管如此，对于更好地应用这种技术来了解植物组织中化合物的生理信息，仍然存在一个很好的视角。然而，对于植物材料的特定样品，制备可能具有挑战性，因为MALDI-IMS需要薄片（12-20μm）才能进行适当的数据采集和成功分析。从这个意义上说，之前，我们开发了一种样品制备方案来获得 Euterpe oleracea （巴西莓）硬种子的薄片，从而能够通过MALDI-IMS进行分子定位。

在这里，我们表明所开发的方案适用于制备来自同一属的其他种子。简而言之，该方案基于将种子浸没在去离子水中24小时，用明胶嵌入样品，并将它们切片在适应的低温恒温器中。然后，对于基质沉积，使用 1：1 （v/v） 2,5-二羟基苯甲酸 （DHB） 和含 0.1% 三氟乙酸的甲醇溶液以 30 mg/mL 的速度将 xy 运动平台耦合到电喷雾电离 （ESI） 针喷雾。使用软件处理 E. precatoria 和 E. edulis 种子数据以绘制其代谢物模式。

己糖低聚物在样品切片中作图，以证明这些样品的方案的充分性，因为已知这些种子含有大量的甘露聚糖，甘露聚糖是己糖甘露糖的聚合物。结果，鉴定了己糖低聚物的峰，以 （Δ = 162 Da） 的 [M + K]⁺ 加合物为代表。因此，先前为 E. oleracea 种子量身定制的样品制备方案也使另外两种硬棕榈种子的MALDI-IMS分析成为可能。简而言之，该方法可以成为研究植物材料形态解剖学和生理学的宝贵工具，特别是来自抗切割样品的研究。

引言

基质辅助激光解吸/电离成像质谱 （MALDI-IMS） 是一种强大的方法，可实现二维生物分子分配，对可电离化合物进行非靶向研究，并确定其空间分布，尤其是在生物样品^{中 1,2}。二十年来，该技术能够同时检测和鉴定脂质、肽、碳水化合物、蛋白质、其他代谢物和合成分子，例如治疗药物 ^3,4。MALDI-IMS有助于在组织样品表面进行化学分析，无需提取、纯化、分离、标记或染色剂。然而，为了成功分析，该技术的一个关键步骤是样品制备，特别是在植物组织中，由于环境适应，植物组织被特化并修饰为广泛的复杂器官⁵。

由于植物组织固有的物理化学特性，需要一种适应方案来适应MALDI-IMS分析的要求，并在切片制备过程中保持组织的原始形状^6,7。对于非常规样品（如种子），既定方案⁸不适用，因为这些组织具有刚性的细胞壁和低含水量，这很容易导致切片碎裂并导致化合物离域⁹。

我们的研究小组已经发表了关于分子图谱的实验数据和用于 MALDI-IMS 分析的 açaí （Euterpe oleracea Mart.） 种子^10、11、12 的适应方案，这是在可租用的巴西莓果肉¹³ 生产过程中大量产生的副产品。这个想法是开发一种原 位绘制巴西 莓种子中不同代谢物的方案，帮助提出目前尚未进行商业探索的这种农业废物的可能用途。然而，由于巴西莓种子的抗性，有必要定制一个方案，以便从MALDI-IMS分析中获得适当的样品切片。

在这种背景下，具有重要经济意义的巴西莓果肉推动了具有相似感官特征的Euterpe属棕榈树的其他果实的日益商业化。作为巴西莓^14,15 的替代品，在工业规模上生产的两种新兴棕榈树的果实是生长在亚马逊干旱地区的 E. precatoria（称为 açaí-do-amazonas）和 E. edulis（称为 juçara），这是典型的大西洋森林。然而，食用 açaí-do-amazonas 和 juçara 会导致相同的抗性和不可食用种子的积累，这些种子尚未得到利用，并且迄今为止尚未对其详细的化学成分进行研究。

因此，我们在这里证明，先前设计的方案可用于分析 E . precatoria 和 E. edulis 种子，以便通过 MALDI-IMS 进行分子定位，证明是一种强大的工具，可用于分析这些资源的组成，并有助于确定它们潜在的生物技术用途。此外，此处提供的详细说明可以帮助其他有类似困难的人制备用于MALDI-IMS分析的抗性材料。

研究方案

Euterpe precatoria 种子由 Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia（巴西马瑙斯）慷慨捐赠， Euterpe edulis 种子由 Silo - Arte e Latitude Rural（巴西雷森德）在工业脱浆过程后慷慨捐赠。将种子在室温下保存在密封的塑料盒中。

1. 基质辅助激光解吸/电离成像质谱（MALDI-IMS）

1. 种子切片协议
   1. 让每个物种的三个种子在去离子水中静置24小时。
   2. 第二天，打开低温恒温器（见 材料表），使其达到-20°C。
   3. 将湿种子从水中取出。使用切片机刀片将种子切成两半（见 材料表）。
   4. 准备新鲜，温暖的（10%）明胶溶液（见 材料表）。
   5. 将一半的种子放在模具上，并用新鲜制作的明胶填充。在进入低温恒温器之前，在-80°C下冷冻2小时。
   6. 使用最佳切割温度化合物（OCT，参见 材料表）将嵌入的种子连接到低温恒温器支架上，并在低温恒温器内放置 10 分钟进行 OCT 硬化。
   7. 将铜双面胶带（见 材料表）添加到铟锡氧化物涂层载玻片（ITO载玻片;见 材料表）中。
   8. 从每个物种中产生20μm厚的切片，并将它们放在粘附在ITO载玻片上的铜双面胶带上。
      注意：此时，载玻片上收集的切片可以储存在-80°C冰箱中;或者，继续进行基质沉积。载玻片必须放置在支架载玻片盒中，用气态 N₂ 冲洗，并用薄膜密封以防止样品氧化（参见 材料表）。
2. 基质沉积
   1. 将含有切片的载玻片放入真空干燥器中，直至达到室温。
   2. 在每个幻灯片角上使用校正笔做教学标记。使用表格扫描仪扫描幻灯片。设置为 4,800 ppi 的分辨率。
   3. 使用分析天平称取30 mg 2,5-二羟基苯甲酸（DHB;见 材料表），并制备1 mL 1：1甲醇：0.1%三氟乙酸（TFA; 材料表）溶解DHB的解决方案。
   4. 用 DHB 溶液填充 1 mL 玻璃注射器（见 材料表），并将其放入注射泵（见 材料表）中，流速设置为 0.8 mL/h。
   5. 使用PEEK管，将注射器连接到大气压化学电离（APCI）针（参见 材料表）。
   6. 将 N₂ 连接到 APCI 针并将其设置为 12.5 psi 流速。
   7. 将 APCI 针连接到 xy 运动平台（参见 材料表）。确保 APCI 针头的尖端位于载玻片上方 4 厘米 处。
   8. 使用绘图软件（参见 材料表 和 补充图 1），将 xy 运动平台设置为遵循模板。模板由间隔 1 mm 的水平平行线组成。
   9. 要实现基质沉积，请等待 xy 运动平台重复模板 20 次。
      注意：基质沉积必须在化学通风橱中进行。
3. 成像采集
   1. 将载玻片放入质谱仪中（参见 材料表）。
   2. 使用校正笔标记在参考软件上设置示教点（参见 材料表）。
   3. 在软件中设置激光功率 （60%）、激光聚焦（中等）、拍摄次数 （100） 和极性（参见 材料表）。设置 99% 数据缩减系 数并保存 FID 文件以进行后验数据校准。保存方法。
   4. 使用质谱仪软件中的添加多边形测量区域工具分隔要分析的区域。编辑测量区域参数，指示在上一步中保存的方法，并将 栅格宽度设置为 100 μm （补充图 S4A）。
   5. 开始成像采集。
4. 数据分析
   1. 使用基质簇和已知污染物在参考软件（参见材料 表）的 校准选项卡 （补充图S4B）中创建质量列表。
      1. 在参考软件中打开要校准的数据（参见 材料表）。在 校准 选项卡中，打开创建的质量列表，然后右键单击并选择 设置锁定质量 选项（补充图S4C）打开一个对话框。
      2. 选择具有 0.5 高斯展宽和 3.5 线展宽的高斯窗口模式。取消选中在线校准。选择模式（单）、阈值 （1,000） 和质量容差 （5 ppm）。使用过程校准数据并保存 2D 数据工具（补充图 S4C）。
   2. 校准后，将数据导出到 SCiLS 实验室或其他兼容软件，并设置所需的 m/z 值阈值（选择范围：150 至 2,500）。
      注意：根据文件大小或计算机的特性，这可能需要一些时间。
   3. 在总离子计数 （TIC） 或均方根 （RMS） 之间选择归一化方法。
      注：对于此分析，选择了 TIC。
   4. 如果要映射的分析物是已知的，则绘制每个分析物的每个 m/z 值，并保存生成的图像和光谱平均图。
      注意：在这项工作中，通过考虑钾加合物来选择己糖低聚物的 m / z 值。

2. 能量色散光谱（EDS）

1. 种子切片协议
   1. 在切片锯机中获取薄种子切片（见 材料表）。
   2. 使用以下参数切割种子： 500 RPM 切割速度、100 N 负载充注和 15 HC 金刚石晶圆刀片 （见 材料表）。
      注意： 由于连接到测角仪的精密虎钳对固定物的必要附着力，因此处理从种子中手动去除纤维的过程。使用前清洁刀片，切下一部分种子，以防止在分析过程中添加不需要的矿物质。
   3. 用压缩空气清除样品以去除切口中的所有颗粒残留物（参见 材料表）。
   4. 将种子部分固定在支架中的碳双面导电胶带（参见 材料表）。
2. 分析条件
   1. 在与EDS耦合的扫描电子显微镜（SEM）的真空室内用种子部分连接支撑物（参见 材料表）。
   2. 使用二次电子信号（见材料表）、背散射电子（固定在极件上的固态探测器）和这两种信号的混合物（MIX），在加速度为20 kV、光斑尺寸为4.0的模型显微镜上获取电子显微照片，构建人工着色的图像。
   3. 对于EDS光谱的采集，请使用光谱仪（见 材料表）与上述SEM相结合。EDS图像采集的条件配置与SEM相同。
   4. 将 倾斜度、仰角和 方位角 分别设置为 0.0、35.0 和 0.0。
3. 数据采集
   1. 以 91 倍放大倍率设置三个不同的区域种子部分以获取数据。
   2. 在采集终止时或采集期间识别频谱中的峰。使用 “确认元素”（Confirm Elements） 步骤 按钮手动识别峰。
   3. 将每个选定区域的采集时间设置为 60 秒。将处理时间设置为 5;这些参数可用于 1 到 6 的处理时间。
      注意：元素的符号是恒定的并加起来的，而噪音是随机的和有害的。处理时间越长，噪音越低。
   4. 显示显著定量结果的默认设置高于两个西格玛（标准差）。将两个西格玛设置为零以减少不良结果。
   5. 归一化元素的每个强度;这是软件中的标准化参数（参见 材料表）。
   6. 要分析数据，请将其导出到 DOC 文件中。
4. 数据分析
   1. 确保准确测量定量元素分析的峰强度。
   2. 重叠峰需要反卷积才能更好地分离峰;必要时减去嘈杂的背景。
   3. 当没有重叠时，增加增益以放大信号并提高频谱质量。

结果

所设计的方案能够对 E. precatoria 和 E. edulis 种子进行 MALDI-IMS 分析。因此，我们可以确认碳水化合物的分子量和聚合度（DP）作为部分结构解析。MALDI-IMS分析提供的分子信息（图1和图2）显示了代表己糖低聚物（Δ = 162 Da）的[M + K]⁺加合物的峰，而无需向基质中添加盐。在两个种子组织中鉴定出己糖二聚体 （m/z 381?...

讨论

植物由具有特定生化功能的特殊组织组成。因此，MALDI-IMS的样品制备方案必须根据具有特定物理化学性质的各种植物组织进行设计，因为样品必须保持其原始的分析物分布和丰度，以获得高质量的信号和空间分辨率⁸。

在进行MALDI-IMS分析之前，首要考虑因素是正确收集和储存样品。然而，在植物中，样品制备通常因分析的组织而异。例如，植物组织中的细胞?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	149357
APCI needle	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	602193
AxiDraw V3 xy motion platform	Evil Mad Scientist, CA, USA	2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software			creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape	3M, USA	1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		image acquisition
FTMS Processing	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		data calibration
Gelatin from bovine skin	Sigma Aldrich Co, MO, USA	G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany	0358 38926
indium tin oxide coated glass slide	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8237001
Inkscape	Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter	Buehler, Illinois, USA
Methanol	J.T.Baker	9093-03
Mili-Q water			18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher HealthCare, Texas, USA	4585
Parafilm "M" Sealing Film	Amcor	HS234526B
Quanta 450 FEG	FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V	Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump	kdScientific, MA, USA	78-9100K
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	302031
X-Max spectrometer	Oxford Instruments, Ableton, UK