Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon-Görüntüleme Kütle Spektrometrisi Analizi için Sert Palmiye Tohumlarının Hazırlanması

Özet

Bu protokol, MALDI-IMS analizi için düşük su içeriğine sahip sert tohum numune kesitlerinin hazırlanması, analitlerin orijinal dağılımının ve bolluğunun korunması ve yüksek kaliteli sinyal ve uzamsal çözünürlük sağlanması hakkında ayrıntılı rehberliği tanımlamayı amaçlamıştır.

Özet

Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon görüntüleme kütle spektrometrisi (MALDI-IMS), bileşikleri doğal ortamlarında tanımlamak için uygulanır. Şu anda, MALDI-IMS klinik analizlerde sıklıkla kullanılmaktadır. Yine de, bitki dokularındaki kimyasal bileşiklerin fizyolojik bilgilerini anlamak için bu tekniği daha iyi uygulamak için mükemmel bir bakış açısı mevcuttur. Bununla birlikte, MALDI-IMS, uygun veri toplama ve başarılı analiz için ince dilimler (12-20 μm) gerektirdiğinden, botanik materyallerden belirli numuneler için hazırlık zor olabilir. Bu anlamda, daha önce, Euterpe oleracea (açaí palmiyesi) sert tohumlarının ince kesitlerini elde etmek için bir numune hazırlama protokolü geliştirdik ve bunların MALDI-IMS ile moleküler haritalanmasını sağladık.

Burada, geliştirilen protokolün aynı cinsten diğer tohumların hazırlanması için uygun olduğunu gösteriyoruz. Kısaca protokol, tohumların 24 saat boyunca deiyonize suya batırılmasına, numunelerin jelatin ile gömülmesine ve iklimlendirilmiş bir kriyostatta bölümlere ayrılmasına dayanıyordu. Daha sonra, matris biriktirme için, bir xy hareket platformu, 1:1 (h/h) 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB) ve 30 mg/mL'de %0.1 trifloroasetik asit içeren metanol çözeltisi kullanılarak bir elektrosprey iyonizasyon (ESI) iğne spreyine bağlandı. E. precatoria ve E. edulis tohum verileri, metabolit modellerini haritalamak için yazılım kullanılarak işlendi.

Heksoz oligomerleri, bu numuneler için protokolün yeterliliğini kanıtlamak için numune dilimleri içinde haritalandı, çünkü bu tohumların büyük miktarlarda mannan içerdiği bilinmektedir. Sonuç olarak, [M + K]⁺ (Δ = 162 Da) eklentileri ile temsil edilen heksoz oligomerlerinin zirveleri tanımlandı. Böylece, daha önce E. oleracea tohumları için özel olarak geliştirilen numune hazırlama protokolü, diğer iki sert palmiye tohumunun MALDI-IMS analizini de mümkün kıldı. Kısacası, yöntem, özellikle kesilmeye dayanıklı numunelerden botanik materyallerin morfo-anatomisi ve fizyolojisi üzerine araştırmalar için değerli bir araç oluşturabilir.

Giriş

Matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon-görüntüleme kütle spektrometrisi (MALDI-IMS), iki boyutlu biyomolekül atamasına izin veren, iyonlaşabilir bileşiklerin hedefsiz araştırılmasını sağlayan ve özellikle biyolojik örneklerde uzamsal dağılımlarını belirleyen güçlü bir yöntemdir ^1,2. Yirmi yıldır bu teknik, lipitlerin, peptitlerin, karbonhidratların, proteinlerin, diğer metabolitlerin ve terapötik ilaçlar gibi sentetik moleküllerin eşzamanlı olarak saptanmasını ve tanımlanmasını sağlamıştır ^3,4. MALDI-IMS, biyolojik numunelerin ekstraksiyonu, saflaştırılması, ayrılması, etiketlenmesi veya boyanması olmadan bir doku numunesi yüzeyinde kimyasal analizi kolaylaştırır. Bununla birlikte, başarılı bir analiz için, bu teknikte çok önemli bir adım, özellikle çevresel iklimlendirme nedeniyle yaygın karmaşık organlara özelleşmiş ve modifiye edilmiş bitki dokularında numune hazırlamadır⁵.

Doğal bitki dokusu fizikokimyasal özellikleri nedeniyle, MALDI-IMS analizinin gerekliliklerine uyacak ve kesit hazırlığı sırasında dokunun orijinal şeklini koruyacak uyarlanmış bir protokole ihtiyaç vardır ^6,7. Tohumlar gibi geleneksel olmayan numuneler söz konusu olduğunda, bu dokular sert hücre duvarlarına ve düşük su içeriğine sahip olduğundan, oluşturulan protokoller⁸ uygulanamaz, bu da kolayca kesit parçalanmasına neden olabilir ve bileşik delokalizasyona^{yol açabilir 9}.

Araştırma grubumuz, kiralanabilir açai posasının üretimi sırasında yüksek miktarlarda üretilen bir yan ürün olan açai (Euterpe oleracea Mart.)^{tohumu 10,11,12'nin} moleküler haritalama ve MALDI-IMS analizi için uyarlanmış bir protokol hakkında deneysel veriler yayınlamıştır¹³. Buradaki fikir, açai tohumlarındaki farklı metabolitlerin yerinde haritalanması için bir protokol geliştirmek ve şu anda ticari olarak araştırılmayan bu tarımsal atıklar için olası kullanımları önermeye yardımcı olmaktı. Bununla birlikte, açai tohumunun direnci nedeniyle, MALDI-IMS analizinden uygun numune kesiti elde etmek için özel bir protokol yapılması gerekiyordu.

Bu bağlamda, ekonomik açıdan önemli olan açai posası, benzer duyusal özelliklere sahip Euterpe cinsi palmiye ağaçlarından elde edilen diğer meyvelerin artan ticarileşmesini motive etmiştir. Açaí ^14,15'e alternatif olarak endüstriyel ölçekte üretilen iki palmiye ağacının meyvesi, Amazon kurak alanında yetişen E. precatoria (açaí-do-amazonas olarak bilinir) ve Atlantik Ormanı'ndan tipik olan E. edulis (juçara olarak bilinir). Bununla birlikte, açaí-do-amazonas ve juçara tüketimi, mevcut olmayan ve ayrıntılı kimyasal bileşimleri ile ilgili olarak şimdiye kadar çalışılmamış olan aynı dirençli ve yenmeyen tohum birikimine yol açmaktadır.

Bu nedenle, daha önce tasarlanan protokolün, MALDI-IMS tarafından moleküler haritalama için E. precatoria ve E. edulis tohumlarını analiz etmek için birkaç uyarlama ile kullanılabileceğini ve bu kaynakların bileşiminin analizi için kullanılabilecek güçlü bir araç olduğunu kanıtladığını ve potansiyel biyoteknolojik kullanımlarını belirlemeye yardımcı olabileceğini gösteriyoruz. Ayrıca, burada verilen ayrıntılı açıklama, MALDI-IMS analizi için dirençli malzemelerin hazırlanmasında benzer zorluklar yaşayan diğer kişilere yardımcı olabilir.

Protokol

Euterpe precatoria tohumları Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (Manaus, Brezilya) tarafından nazikçe bağışlandı ve Euterpe edulis tohumları, endüstriyel hamur giderme işleminden sonra Silo - Arte e Latitude Rural (Resende, Brezilya) tarafından nazikçe bağışlandı. Tohumlar oda sıcaklığında kapalı plastik kutularda tutuldu.

1. Matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon görüntüleme kütle spektroskopisi (MALDI-IMS)

1. Tohum bölümleme protokolü
   1. Her türden üç tohumun 24 saat boyunca deiyonize suda oturmasına izin verin.
   2. Ertesi gün, kriyostatı açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve -20 °C'ye ulaşmasını bekleyin.
   3. Islak tohumları sudan çıkarın. Bir mikrotom bıçağı kullanarak tohumları ikiye bölün ( Malzeme Tablosuna bakın).
   4. Taze, ılık (% 10) bir jelatin çözeltisi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
   5. Tohumun yarısını bir kalıba koyun ve taze yapılmış jelatin ile doldurun. Kriyostata almadan önce -80 °C'de 2 saat dondurun.
   6. Gömülü tohumu, optimum bir kesme sıcaklığı bileşiği (OCT, Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak kriyostat desteğine takın ve OCT sertleşmesi için kriyostatın içinde 10 dakika bekletin.
   7. İndiyum kalay oksit kaplı bir cam slayta (ITO slaytı; Malzeme Tablosuna bakın) bakır çift yüzlü yapışkan bant ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
   8. Her türden 20 μm kalınlığında kesitler üretin ve bunları ITO cam kızağa yapıştırılmış bakır çift yüzlü yapışkan bant üzerine yerleştirin.
      NOT: Bu noktada slaytlar üzerinde toplanan dilimler -80 °C'lik bir dondurucuda saklanabilir; Alternatif olarak, matris biriktirmeye devam edin. Slaytlar bir tutucu slayt kutusuna yerleştirilmeli, gaz halinde_N2 ile yıkanmalı ve numune oksidasyonunu önlemek için filmle kapatılmalıdır (bkz. Malzeme Tablosu).
2. Matris biriktirme
   1. Dilimler içeren slaytı oda sıcaklığına gelene kadar vakumlu bir desikatöre yerleştirin.
   2. Her slayt köşesinde bir düzeltme kalemi kullanarak öğretim işaretleri yapın. Slaydı bir tablo tarayıcı kullanarak tarayın. 4.800 ppi çözünürlüğe ayarlayın.
   3. 30 mg 2,5-dihidroksibenzoik asidi (DHB; Malzeme Tablosuna bakınız) tartmak için bir analitik terazi kullanın ve 1 mL 1:1 metanol:% 0.1 trifloroasetik asit (TFA; Malzeme Tablosu) DHB'yi çözmek için çözelti.
   4. 1 mL'lik bir cam şırıngayı (Malzeme Tablosuna bakınız) DHB çözeltisi ile doldurun ve 0,8 mL / s akış hızına ayarlanmış bir şırınga pompasına (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
   5. PEEK borusunu kullanarak, şırıngayı atmosferik basınçlı kimyasal iyonizasyon (APCI) iğnesine bağlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
   6. _N2'yi APCI iğnesine bağlayın ve 12.5 psi akış hızına ayarlayın.
   7. APCI iğnesini xy hareket platformuna takın (Malzeme Tablosuna bakın). APCI iğnesinin ucunun slayttan 4 cm yukarıda olduğundan emin olun.
   8. Çizim yazılımını kullanarak (bkz . Malzeme Tablosu ve Ek Şekil 1), xy hareket platformunu şablonu takip edecek şekilde ayarlayın. Şablon, 1 mm aralıklı yatay paralel çizgilerden oluşur.
   9. Matris biriktirme elde etmek için, xy hareket platformunun şablonu 20 kez tekrarlamasını bekleyin.
      DİKKAT: Matris biriktirme kimyasal çeker ocakta yapılmalıdır.
3. Görüntüleme edinimi
   1. Slaytı kütle spektrometresine yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın).
   2. Başvurulan yazılımda öğretme noktalarını ayarlamak için düzeltme kalem işaretlerini kullanın (bkz.
   3. Yazılımda lazer gücünü (%60), lazer odağını (orta), çekim sayısını (100) ve polariteyi ayarlayın (bkz. %99 veri azaltma faktörünü ayarlayın ve FID dosyasını posterior veri kalibrasyonu için kaydedin. Yöntemi kaydedin.
   4. Kütle spektrometresi yazılımından poligon ölçüm bölgesi ekle aracını kullanarak analiz edilecek alanı sınırlayın. Önceki adımda kaydedilen yöntemi ve raster genişliğini 100 μm olarak gösteren ölçüm bölgesi parametrelerini düzenleyin (Ek Şekil S4A).
   5. Görüntüleme alımını başlatın.
4. Veri analizi
   1. Kalibant sekmesinde (Ek Şekil S4B) referans verilen yazılımda (Malzeme Tablosuna bakın) bir kütle listesi oluşturmak için matris kümesini ve bilinen kirleticileri kullanın.
      1. Referans verilen yazılımda kalibre edilecek verileri açın (bkz. Kalibrasyon sekmesinde, oluşturulan kütle listesini açın ve sağ tıklayarak bir iletişim kutusu açın ve kilit kütlelerini ayarla seçeneğini seçin (Ek Şekil S4C).
      2. 0,5 Gauss genişletme ve 3,5 Satır genişletme ile Gauss pencere modunu seçin. Çevrimiçi kalibrasyonu işaretlemeden bırakın. Mod (tek), eşik (1.000) ve kütle toleransı (5 ppm) seçin. Verileri işlemle kalibre edin ve 2D veri aracını kaydedin (Ek Şekil S4C).
   2. Kalibrasyondan sonra, verileri SCiLS laboratuvarına veya diğer uyumlu yazılımlara aktarın ve istenen m/z değeri eşiğini ayarlayın (seçilen aralık: 150 ila 2.500).
      NOT: Dosya boyutuna veya bilgisayarın özelliklerine bağlı olarak bu işlem biraz zaman alabilir.
   3. Toplam iyon sayısı (TIC) veya ortalama karekök (RMS) arasında bir normalleştirme yöntemi seçin.
      NOT: Bu analiz için TIC seçilmiştir.
   4. Eşlenecek analitler biliniyorsa, her analit için her m/z değerini çizin ve oluşturulan görüntüleri ve spektral ortalama grafiğini kaydedin.
      NOT: Bu çalışmada heksoz oligomerlerinden m/z değerleri potasyum eklentisi dikkate alınarak seçilmiştir.

2. Enerji dağılımlı spektroskopi (EDS)

1. Tohum bölümleme protokolü
   1. Bir kesit testere makinesinde ince bir tohum dilimi elde edin (Malzeme Tablosuna bakın).
   2. Tohumları aşağıdaki parametrelerle kesin: 500 RPM kesme hızı, 100 N yük yükü ve 15 HC Elmas Gofret Bıçağı (Malzeme Tablosuna bakın).
      NOT: Gonyometreye bağlı hassas mengenelerdeki tutuşa gerekli yapışma nedeniyle liflerin tohumlardan manuel olarak çıkarılmasını sağlayın. Analiz sırasında istenmeyen minerallerin eklenmesini önlemek için tohumun bir bölümünü keserek kullanmadan önce bıçağı temizleyin.
   3. Kesimdeki tüm partikül kalıntılarını gidermek için numuneleri basınçlı hava ile temizleyin (bkz. Malzeme Tablosu).
   4. Destekte bir tohum bölümünü karbon çift taraflı iletken bantla ( Malzeme Tablosuna bakın) sabitleyin.
2. Analiz koşulları
   1. Desteği, EDS ile birleştirilmiş bir taramalı elektron mikroskobunun (SEM) vakum odasının içindeki bir tohum bölümü ile takın (bkz. Malzeme Tablosu).
   2. İkincil elektron sinyallerini (Malzeme Tablosuna bakınız), geri saçılan elektronları (polar parçaya sabitlenmiş katı hal dedektörü) ve bu iki tür sinyalin karışımlarını (MIX) kullanarak 20 kV ivmeli ve 4.0 spot boyutlu bir model mikroskopta elektron mikrografları elde edin, yapay olarak renklendirilmiş görüntüler oluşturun.
   3. EDS spektrumlarının elde edilmesi için, yukarıda belirtilen SEM ile birleştirilmiş bir spektrometre (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. EDS'den görüntü alımının koşul yapılandırması SEM ile aynıdır.
   4. Eğim derecelerini, yüksekliği ve azimutu sırasıyla 0,0, 35,0 ve 0,0 olarak ayarlayın.
3. Veri toplama
   1. Veri elde etmek için tohum bölümünün 91x büyütmesi ile üç farklı alan ayarlayın.
   2. Satın almanın sona ermesi üzerine veya satın alma sırasında spektrumdaki tepe noktalarını belirleyin. Tepe noktalarını manuel olarak tanımlamak için Öğeleri Onayla adım düğmesini kullanın.
   3. Seçilen her alan için çekim süresini 60 sn olarak ayarlayın. İşlem süresini beşe ayarlayın; Parametreler bir ila altı işlem süresi için kullanılabilir.
      NOT: Öğelerin işaretleri sabittir ve toplanırken, sesler rastgele ve zararlıdır. İşlem süresi ne kadar uzun olursa, gürültü o kadar düşük olur.
   4. Önemli nicel sonuçları görüntülemek için varsayılan ayarlar iki sigmanın (standart sapma) üzerindedir. İstenmeyen sonuçları azaltmak için iki sigmayı sıfıra ayarlayın.
   5. Elemanların her yoğunluğunu normalleştirin; bu, yazılımda standartlaştırılmış bir parametredir (bkz.
   6. Verileri analiz etmek için bir DOC dosyasına aktarın.
4. Veri analizi
   1. Kantitatif element analizi için tepe yoğunluklarının doğru bir şekilde ölçülmesini sağlayın.
   2. Üst üste binen tepeler, daha iyi tepe ayrımı için evrişim gerektirir; Gerektiğinde gürültülü bir arka planı çıkarın.
   3. Örtüşme olmadığında, sinyalleri yükseltmek ve spektrum kalitesini iyileştirmek için kazancı artırın.

Sonuçlar

Tasarlanan protokol, E. precatoria ve E. edulis tohumlarının MALDI-IMS analizini mümkün kıldı. Sonuç olarak, karbonhidratların moleküler ağırlığını ve polimerizasyon derecesini (DP) kısmi bir yapısal açıklama olarak doğrulayabiliriz. MALDI-IMS analizi (Şekil 1 ve Şekil 2) tarafından sağlanan moleküler bilgiler, matrise tuz eklemeden heksoz oligomerlerinin (Δ = 162 Da) [M+K]⁺ eklentilerini te...

Tartışmalar

Bitkiler, belirli biyokimyasal işlevler için özel dokulardan oluşur. Bu nedenle, numunelerin yüksek kaliteli sinyal ve uzamsal çözünürlük için orijinal analit dağılımını ve bolluğunu koruması gerektiğinden, MALDI-IMS için numune hazırlama protokolü, spesifik fizikokimyasal özelliklere sahip çeşitli bitki dokularına göre tasarlanmalıdır⁸.

MALDI-IMS analizinden önce, numunelerin uygun şekilde toplanması ve saklanması öncelikli olarak dü?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	149357
APCI needle	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	602193
AxiDraw V3 xy motion platform	Evil Mad Scientist, CA, USA	2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software			creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape	3M, USA	1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		image acquisition
FTMS Processing	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		data calibration
Gelatin from bovine skin	Sigma Aldrich Co, MO, USA	G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany	0358 38926
indium tin oxide coated glass slide	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8237001
Inkscape	Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter	Buehler, Illinois, USA
Methanol	J.T.Baker	9093-03
Mili-Q water			18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher HealthCare, Texas, USA	4585
Parafilm "M" Sealing Film	Amcor	HS234526B
Quanta 450 FEG	FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V	Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump	kdScientific, MA, USA	78-9100K
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	302031
X-Max spectrometer	Oxford Instruments, Ableton, UK