マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析のための硬質パーム種子の調製(英語)

要約

このプロトコールは、MALDI-IMS分析用の水分含有量の少ない硬いシードサンプル切片の調製、分析種の元の分布と存在量の維持、高品質のシグナルと空間分解能の提供に関する詳細なガイダンスを説明することを目的としています。

要約

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析(MALDI-IMS)は、天然環境で化合物を同定するために適用されます。現在、MALDI-IMSは臨床解析で頻繁に使用されています。しかし、この手法を応用して、植物組織における化合物の生理学的情報を理解するための優れた展望が存在します。しかし、MALDI-IMSでは、適切なデータ取得と分析を成功させるために薄片(12-20 μm)を必要とするため、植物材料からの特定のサンプルの調製が困難な場合があります。この意味で、私たちは以前、 Euterpe oleracea (アサイーパーム)の硬い種子の薄切片を得るためのサンプル調製プロトコルを開発し、MALDI-IMSによる分子マッピングを可能にしました。

ここでは、開発されたプロトコルが、同じ属の他の種子を調製するのに適していることを示します。簡単に言うと、このプロトコルは、種子を脱イオン水に24時間浸し、サンプルをゼラチンで埋め込み、順応クライオスタットで切片化することに基づいていました。次に、マトリックス堆積のために、1:1(v/v)2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)と0.1%トリフルオロ酢酸(30 mg/mL)のメタノール溶液を使用して、エレクトロスプレーイオン化(ESI)ニードルスプレーにxyモーションプラットフォームを結合しました。 E. precatoria と E. edulis の 種子データは、ソフトウェアを使用して処理され、代謝物パターンがマッピングされました。

ヘキソースオリゴマーは、これらの種子に大量のマンナン(ヘキソースマンノースのポリマー)が含まれていることが知られているため、これらのサンプルのプロトコルの妥当性を証明するために、サンプルスライス内にマッピングされました。その結果、(Δ=162Da)の[M+K]⁺ 付加物で表されるヘキソースオリゴマーのピークが同定された。したがって、 以前に E. oleracea 種子用に開発されたサンプル前処理プロトコルにより、他の 2 つの硬いヤシ種子の MALDI-IMS 分析も可能になりました。要するに、この方法は、植物材料の形態解剖学と生理学、特に耐切創性サンプルの研究のための貴重なツールを構成する可能性があります。

概要

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析(MALDI-IMS)は、2次元の生体分子の割り当てを可能にし、イオン化可能な化合物のノンターゲット調査を提供し、特に生体試料におけるそれらの空間分布を決定する強力な方法です^1,2。20年間にわたり、この技術により、脂質、ペプチド、炭水化物、タンパク質、その他の代謝物、および治療薬などの合成分子の同時検出と同定が可能になりました^3,4。MALDI-IMSは、生体試料の抽出、精製、分離、標識、染色剤を介さずに、組織試料表面の化学分析を容易にします。しかし、分析を成功させるためには、この手法の極めて重要なステップは、特に環境順応のために広範囲にわたる複雑な器官に特殊化され、修飾された植物組織におけるサンプル調製^です5。

植物組織の固有の物理化学的特性のため、MALDI-IMS分析の要件に適合し、切片作成中に組織の元の形状を維持するための適応プロトコルが必要です^6,7。種子などの型破りなサンプルの場合、これらの組織は細胞壁が硬く、....

プロトコル

Euterpe precatoria の種子は、Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia(ブラジル、マナウス)から寄贈され、 Euterpe edulis の種子は、産業パルプ化プロセスの後、Silo - Arte e Latitude Rural(Resende、ブラジル)から寄贈されました。種子は密封されたプラスチックの箱に室温で維持した。

1. マトリックス支援レーザー脱離イオン化イメージング質量分析法(MALDI-IMS)

1. 種子セクショニングプロトコル
   1. 各種から3つの種子を脱イオン水に24時間置きます。
   2. 翌日、クライオスタット( 材料表参照)の電源を入れ、-20°Cにします。
   3. 湿った種を水から取り出します。ミクロトームブレードを使用して種子を半分に切ります( 材料表を参照)。
   4. 新鮮で温かい(10%)ゼラチン溶液を調製します( 材料表を参照)。
   5. 種の半分を型に置き、作りたてのゼラチンを入れます。クライオスタットに移す前に、-80°Cで2時間凍結します。
   6. 最適な切断温度コンパウンド(OCT、 材料表<....

ディスカッション

植物は、特定の生化学的機能のために特殊な組織で構成されています。したがって、MALDI-IMSのサンプル調製プロトコルは、サンプルが高品質のシグナルと^{空間分解能}のために元の分析種の分布と存在量を維持する必要があるため、特定の物理化学的特性を持つさまざまな植物組織に従って設計する必要があります8。

MALDI-IMS分析の前に、サンプルを適切?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer Lock	Hamilton Company	81320
2,5-Dihydroxybenzoic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	149357
APCI needle	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	602193
AxiDraw V3 xy motion platform	Evil Mad Scientist, CA, USA	2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software			creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape	3M, USA	1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UV	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImaging	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		image acquisition
FTMS Processing	Bruker Daltonik, Bremen, Germany		data calibration
Gelatin from bovine skin	Sigma Aldrich Co, MO, USA	G9391
High Profile Microtome Blades Leica 818	Leica  Biosystems, Nussloch, Germany	0358 38926
indium tin oxide coated glass slide	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8237001
Inkscape	Inkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutter	Buehler, Illinois, USA
Methanol	J.T.Baker	9093-03
Mili-Q water			18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature Compound	Fisher HealthCare, Texas, USA	4585
Parafilm "M" Sealing Film	Amcor	HS234526B
Quanta 450 FEG	FEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 V	Oxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7T	Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pump	kdScientific, MA, USA	78-9100K
Trifluoroacetic acid	Sigma Aldrich Co, MO, USA	302031
X-Max spectrometer	Oxford Instruments, Ableton, UK