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要約

このプロトコールは、MALDI-IMS分析用の水分含有量の少ない硬いシードサンプル切片の調製、分析種の元の分布と存在量の維持、高品質のシグナルと空間分解能の提供に関する詳細なガイダンスを説明することを目的としています。

要約

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析(MALDI-IMS)は、天然環境で化合物を同定するために適用されます。現在、MALDI-IMSは臨床解析で頻繁に使用されています。しかし、この手法を応用して、植物組織における化合物の生理学的情報を理解するための優れた展望が存在します。しかし、MALDI-IMSでは、適切なデータ取得と分析を成功させるために薄片(12-20 μm)を必要とするため、植物材料からの特定のサンプルの調製が困難な場合があります。この意味で、私たちは以前、 Euterpe oleracea (アサイーパーム)の硬い種子の薄切片を得るためのサンプル調製プロトコルを開発し、MALDI-IMSによる分子マッピングを可能にしました。

ここでは、開発されたプロトコルが、同じ属の他の種子を調製するのに適していることを示します。簡単に言うと、このプロトコルは、種子を脱イオン水に24時間浸し、サンプルをゼラチンで埋め込み、順応クライオスタットで切片化することに基づいていました。次に、マトリックス堆積のために、1:1(v/v)2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB)と0.1%トリフルオロ酢酸(30 mg/mL)のメタノール溶液を使用して、エレクトロスプレーイオン化(ESI)ニードルスプレーにxyモーションプラットフォームを結合しました。 E. precatoria と E. edulis の 種子データは、ソフトウェアを使用して処理され、代謝物パターンがマッピングされました。

ヘキソースオリゴマーは、これらの種子に大量のマンナン(ヘキソースマンノースのポリマー)が含まれていることが知られているため、これらのサンプルのプロトコルの妥当性を証明するために、サンプルスライス内にマッピングされました。その結果、(Δ=162Da)の[M+K]+ 付加物で表されるヘキソースオリゴマーのピークが同定された。したがって、 以前に E. oleracea 種子用に開発されたサンプル前処理プロトコルにより、他の 2 つの硬いヤシ種子の MALDI-IMS 分析も可能になりました。要するに、この方法は、植物材料の形態解剖学と生理学、特に耐切創性サンプルの研究のための貴重なツールを構成する可能性があります。

概要

マトリックス支援レーザー脱離/イオン化イメージング質量分析(MALDI-IMS)は、2次元の生体分子の割り当てを可能にし、イオン化可能な化合物のノンターゲット調査を提供し、特に生体試料におけるそれらの空間分布を決定する強力な方法です1,2。20年間にわたり、この技術により、脂質、ペプチド、炭水化物、タンパク質、その他の代謝物、および治療薬などの合成分子の同時検出と同定が可能になりました3,4。MALDI-IMSは、生体試料の抽出、精製、分離、標識、染色剤を介さずに、組織試料表面の化学分析を容易にします。しかし、分析を成功させるためには、この手法の極めて重要なステップは、特に環境順応のために広範囲にわたる複雑な器官に特殊化され、修飾された植物組織におけるサンプル調製です5。

植物組織の固有の物理化学的特性のため、MALDI-IMS分析の要件に適合し、切片作成中に組織の元の形状を維持するための適応プロトコルが必要です6,7。種子などの型破りなサンプルの場合、これらの組織は細胞壁が硬く、水分含有量が少ないため、切片の断片化を引き起こしやすく、化合物の非局在化を引き起こす可能性があるため、確立されたプロトコル8は適用できません9。

私たちの研究グループは、レンタル可能なアサイーパルプ13 の生産中に大量に生成される副産物であるアサイー (Euterpe oleracea Mart.) 種子 10,11,12 の分子マッピングと MALDI-IMS 分析に適合したプロトコルに関する実験データを公開しました。アイデアは、アサイー種子のさまざまな代謝産物の in situ マッピングのプロトコルを開発し、現在商業的に調査されていないこの農業廃棄物の可能な用途を提案することでした。しかし、アサイーシードの抵抗性により、MALDI-IMS 分析から適切なサンプル切片を得るためのプロトコルをオーダーメイドする必要がありました。

これに関連して、経済的に重要なアサイーパルプは、同様の感覚特性を持つエウテルペ属のヤシの木からの他の果物の商業化の増加を動機付けました。アサイー14,15 の代替として工業規模で生産されている 2 つの新興ヤシの木の果実は、アマゾンの乾燥地で育つ E. precatoria (アサイー ド アマゾナスとして知られている) と、大西洋岸森林から典型的な E. edulis (ジュサラとして知られている) です。それにもかかわらず、アサイー・ド・アマゾナスとジュサラの消費は、役に立たず、それらの詳細な化学組成に関してこれまで研究されていなかった耐性のある食べられない種子の同じ蓄積につながります。

したがって、MALDI-IMSによる分子マッピングのために E.precatoria および E.edulis 種子を分析するために、以前に考案されたプロトコルをほとんど適応せずに使用できることをここで実証し、これらのリソースの組成の分析に使用できる強力なツールであり、それらの潜在的なバイオテクノロジーの使用を決定するのに役立つことを証明します。さらに、ここでの詳細な説明は、MALDI-IMS分析用の耐性材料を調製する際に同様の困難を抱えている他の人に役立ちます。

プロトコル

Euterpe precatoria の種子は、Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia(ブラジル、マナウス)から寄贈され、 Euterpe edulis の種子は、産業パルプ化プロセスの後、Silo - Arte e Latitude Rural(Resende、ブラジル)から寄贈されました。種子は密封されたプラスチックの箱に室温で維持した。

1. マトリックス支援レーザー脱離イオン化イメージング質量分析法(MALDI-IMS)

  1. 種子セクショニングプロトコル
    1. 各種から3つの種子を脱イオン水に24時間置きます。
    2. 翌日、クライオスタット( 材料表参照)の電源を入れ、-20°Cにします。
    3. 湿った種を水から取り出します。ミクロトームブレードを使用して種子を半分に切ります( 材料表を参照)。
    4. 新鮮で温かい(10%)ゼラチン溶液を調製します( 材料表を参照)。
    5. 種の半分を型に置き、作りたてのゼラチンを入れます。クライオスタットに移す前に、-80°Cで2時間凍結します。
    6. 最適な切断温度コンパウンド(OCT、 材料表を参照)を使用して、埋め込まれたシードをクライオスタット支持体に付着させ、OCT硬化のためにクライオスタット内に10分間放置します。
    7. 酸化インジウムスズでコーティングされたスライドガラス(ITOスライド、材料表参照)に銅両面粘着テープ(材料表参照)を追加します。
    8. 各種から20μm厚の切片を作製し、ITOスライドガラスに貼付した銅製両面粘着テープ上に貼付する。
      注:この時点で、スライドに集められたスライスは-80°Cの冷凍庫に保存できます。または、マトリックス堆積に進みます。スライドはホルダースライドボックスに入れ、ガス状のN2で洗い流し、サンプルの酸化を防ぐためにフィルムで密封する必要があります( 材料表を参照)。
  2. マトリックス堆積
    1. スライスを含むスライドを真空デシケーターに入れ、室温に達するまで置きます。
    2. 各スライドの隅に修正ペンを使用してティーチングマークを作成します。テーブルスキャナーを使用してスライドをスキャンします。解像度を 4,800 ppi に設定します。
    3. 分析天びんを使用して、30 mgの2,5-ジヒドロキシ安息香酸(DHB、 材料表を参照)を秤量し、1:1メタノール:0.1%トリフルオロ酢酸(TFA; 資料表)DHBを溶解する溶液。
    4. 1 mLのガラスシリンジ( 材料表を参照)にDHB溶液を充填し、流速0.8 mL/hに設定したシリンジポンプ( 材料表を参照)に入れます。
    5. PEEKチューブを使用して、シリンジを大気圧化学イオン化(APCI)針に接続します( 材料表を参照)。
    6. N2 を APCI ニードルに接続し、 12.5 psi の流量に設定します。
    7. APCIニードルをxyモーションプラットフォームに取り付けます( 材料表を参照)。APCI針の先端がスライドから 4cm 上にあることを確認します。
    8. 描画ソフトウェア( 材料表 と 補足図1を参照)を使用して、xyモーションプラットフォームをテンプレートに従うように設定します。テンプレートは、1mm間隔の水平平行線で構成されています。
    9. マトリクス堆積を実現するには、xyモーションプラットフォームがテンプレートを20回繰り返すのを待ちます。
      注意: マトリックス堆積は、化学ドラフトで実行する必要があります。
  3. 画像取得
    1. スライドを質量分析計に置きます( 材料表を参照)。
    2. 修正ペンマークを使用して、参照先のソフトウェアにティーチングポイントを設定します( 材料表を参照)。
    3. レーザー出力(60%)、レーザーフォーカス(中)、ショット数(100)、極性をソフトウェアで設定します( 材料表を参照)。 99%のデータ削減係数 を設定し、事後データキャリブレーション用にFIDファイルを保存します。メソッドを保存します。
    4. 質量分析計ソフトウェアの add polygon measurement region ツールを使用して、分析する領域を区切ります。前のステップで保存した方法を示す測定領域パラメータを編集し、 ラスター幅を100μmにします (補足図S4A)。
    5. 画像取得を開始します。
  4. データ解析
    1. マトリックスクラスターと既知の汚染物質を使用して、参照ソフトウェア( 材料表を参照)の キャリブラント タブ(補足図S4B)で質量リストを作成します。
      1. 参照されているソフトウェアでキャリブレーションするデータを開きます( 材料表を参照)。 キャリブレーション タブで、作成した質量リストを開き、右クリックしてダイアログボックスを開き、 ロック質量の設定 オプションを選択します(補足図S4C)。
      2. 0.5 ガウス幅拡大と 3.5 線幅拡大のガウス ウィンドウ モードを選択します。オンラインキャリブレーションはオフのままにします。モード(単一)、しきい値(1,000)、質量許容差(5 ppm)を選択します。プロセスでデータをキャリブレーションし、2Dデータツールを保存します(補足図S4C)。
    2. キャリブレーション後、データをSCiLS labまたはその他の互換性のあるソフトウェアにエクスポートし、目的の m/z 値のしきい値を設定します(選択範囲:150〜2,500)。
      メモ: ファイルサイズやコンピュータの特性によっては、この処理に時間がかかる場合があります。
    3. 総イオン数(TIC)または二乗平均平方根(RMS)から正規化方法を選択します。
      注:この分析では、TICを選択しました。
    4. マッピングする分析対象物がわかっている場合は、各分析対象物の各 m/z 値をプロットし、生成された画像とスペクトル平均プロットを保存します。
      注:この研究では、ヘキソースオリゴマーの m/z 値は、カリウム付加物を考慮して選択されました。

2. エネルギー分散型分光法(EDS)

  1. 種子セクショニングプロトコル
    1. セクショニングソーマシンで薄いシードスライスを取得します( 材料表を参照)。
    2. 500 RPMの切断速度、100 Nの負荷チャージ、および15 HCダイヤモンドウェーハブレード(材料表を参照)でシードを切断します。
      注意: ゴニオメーターに取り付けられた精密バイスのホールドに必要な接着のために、シードからの繊維の手動除去を処理します。使用前にブレードを清掃し、種子の一部を切断して、分析中に望ましくない鉱物が添加されないようにします。
    3. 圧縮空気でサンプルを除去し、切断からすべての粒子の残留物を取り除きます( 材料表を参照)。
    4. 支持体のカーボン両面導電性テープ( 材料表を参照)でシードセクションを固定します。
  2. 解析条件
    1. EDSと組み合わせた走査型電子顕微鏡(SEM)の真空チャンバー内にシードセクションを備えたサポートを取り付けます( 材料表を参照)。
    2. 加速度20kV、スポットサイズ4.0の模型顕微鏡で、二次電子信号(材料表参照)、反射電子(極片に固定された固体検出器)、およびこれら2種類の信号の混合(MIX)を使用して電子顕微鏡写真を取得し、人工的に着色された画像を構築します。
    3. EDSスペクトルの取得には、前述のSEMと組み合わせた分光計( 材料表を参照)を使用します。EDSからの画像取得の条件構成はSEMと同じです。
    4. 傾斜角度、仰角、方位角をそれぞれ 0.0、35.0、0.0 に設定します。
  3. データ・アクイジション
    1. シード部を91倍の倍率で3つの異なる領域に設定してデータを取得します。
    2. アクイジション終了時またはアクイジション中のスペクトラムのピークを特定します。 Confirm Elementsステップ ボタンを使用して、ピークを手動で同定します。
    3. 選択した領域ごとに取得時間を60秒に設定します。処理時間を 5 に設定します。パラメータは、1 から 6 の処理時間で使用できます。
      注:要素の兆候は一定で加算されますが、ノイズはランダムで有害です。処理時間が長いほど、ノイズは低くなります。
    4. 有意な定量的結果を表示するためのデフォルト設定は、2シグマ(標準偏差)を超えています。2 つのシグマを 0 に設定して、望ましくない結果を減らします。
    5. 要素の各強度を正規化します。これは、ソフトウェアで標準化されたパラメータです( 材料表を参照)。
    6. データを分析するには、DOCファイルにエクスポートします。
  4. データ解析
    1. 定量的な元素分析のためにピーク強度を正確に測定します。
    2. ピークが重なり合っている場合は、ピーク分離を改善するためにデコンボリューションが必要です。必要に応じて、ノイズの多い背景を減算します。
    3. オーバーラップがない場合は、ゲインを上げて信号を増幅し、スペクトル品質を向上させます。

結果

考案されたプロトコルにより、E. precatoria および E. edulis 種子の MALDI-IMS 解析が可能になりました。その結果、部分的な構造解明として、糖質の分子量と重合度(DP)を確認することができました。MALDI-IMS分析(図1および図2)で得られた分子情報では、マトリックスに塩を添加することなく、ヘキソースオリゴマー(Δ = 162 Da)の[M...

ディスカッション

植物は、特定の生化学的機能のために特殊な組織で構成されています。したがって、MALDI-IMSのサンプル調製プロトコルは、サンプルが高品質のシグナルと空間分解能のために元の分析種の分布と存在量を維持する必要があるため、特定の物理化学的特性を持つさまざまな植物組織に従って設計する必要があります8。

MALDI-IMS分析の前に、サンプルを適切?...

開示事項

著者は利益相反がないことを宣言します。

謝辞

この研究は、セラピリェイラ研究所(Serra-1708-15009)とリオデジャネイロ州におけるカルロス・シャーガス・フィーリョ研究支援財団(FAPERJ-JCNE-SEI-260003/004754/2021)から資金提供を受けました。セラピリヘイラ研究所と国家科学技術開発評議会(CNPq)は、フェリペ・ロペス・ブルム博士とガブリエル・R・マーティンス博士(制度的能力開発プログラム/ INT/MCTI)に奨学金を授与しました。高等教育要員の改善のための調整(CAPES)は、Davi M.M.C.da Silva氏に修士奨学金を授与したことが認められています。Centro de Espectrometria de Massas de Biomoléculas (CEMBIO-UFRJ) は、MALDI-IMS 分析で提供されたサービスで認められており、MCTI/SISNANO/INT-CENANO-CNPQ grant Nº 442604/2019 の資金提供を受けた Alan Menezes do Nascimento 氏と Centro de Caracterização em Nanotecnologia para Materiais e Catálise (CENANO-INT) は、元素組成分析に感謝しています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL Gastight Syringe Model 1001 TLL, PTFE Luer LockHamilton Company81320
2,5-Dihydroxybenzoic acidSigma Aldrich Co, MO, USA149357
APCI needleBruker Daltonik, Bremen, Germany602193
AxiDraw V3 xy motion platformEvil Mad Scientist, CA, USA2510
Carbon double-sided conductive tape
Compass Data Analysis software creation of mass list
Compressed air
copper double-faced adhesive tape3M, USA1182-3/4"X18YD
Cryostat CM 1860 UVLeica  Biosystems, Nussloch, Germany
Diamond Wafering Blade 15 HC
Everhart-Thornley detector
FlexImagingBruker Daltonik, Bremen, Germanyimage acquisition
FTMS ProcessingBruker Daltonik, Bremen, Germanydata calibration
Gelatin from bovine skinSigma Aldrich Co, MO, USAG9391
High Profile Microtome Blades Leica 818Leica  Biosystems, Nussloch, Germany0358 38926
indium tin oxide coated glass slideBruker Daltonik, Bremen, Germany8237001
InkscapeInkscape Project c/o Software Freedom Conservancy, NY, USA
IsoMet 1000 precision cutterBuehler, Illinois, USA
MethanolJ.T.Baker9093-03
Mili-Q water18.2 MΩ.cm
Oil vacuum pump
Optimal Cutting Temperature CompoundFisher HealthCare, Texas, USA4585
Parafilm "M" Sealing FilmAmcorHS234526B
Quanta 450 FEGFEI Co, Hillsboro, OR, USA
SCiLS Lab (Multi-vendor support) MS Software Bruker Daltonik, Bremen, Germany
Software INCA Suite 4.14 VOxford Instruments, Ableton, UK
Solarix 7TBruker Daltonik, Bremen, Germany
Syringe pumpkdScientific, MA, USA78-9100K
Trifluoroacetic acidSigma Aldrich Co, MO, USA302031
X-Max spectrometerOxford Instruments, Ableton, UK

参考文献

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196 Euterpe oleracea 25 E Precatoria E edulis

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