في الجسم الحي توصيف الآثار الكيميائية لتعطيل الغدد الصماء عن طريق هرمون الغدة الدرقية مؤشر عمل الماوس

Summary

تم تطوير نموذج الماوس مؤشر عمل هرمون الغدة الدرقية لتمكين القياس الكمي الخاص بالأنسجة لعمل هرمون الغدة الدرقية المحلي باستخدام آليته التنظيمية الداخلية. في الآونة الأخيرة ، ثبت أن النموذج مناسب لتوصيف المواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء التي تتفاعل مع اقتصاد هرمون الغدة الدرقية ، سواء من خلال منهجيات خارج الجسم الحي أو في الجسم الحي .

Abstract

تلعب هرمونات الغدة الدرقية (TH) دورا مهما في استقلاب الخلايا ووظيفة الأنسجة. اقتصاد TH عرضة للمواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء (EDCs) التي يمكن أن تزعج إنتاج الهرمونات أو عملها. العديد من الملوثات البيئية هي EDCs ، مما يمثل تهديدا ناشئا لكل من صحة الإنسان والإنتاج الزراعي. وقد أدى ذلك إلى زيادة الطلب على أنظمة الاختبار المناسبة لدراسة آثار EDCs المحتملة. ومع ذلك، تواجه المنهجيات الحالية تحديات. تستخدم معظم أنظمة الاختبار علامات داخلية تنظمها عمليات تنظيمية متعددة ومعقدة في كثير من الأحيان ، مما يجعل من الصعب التمييز بين الآثار المباشرة وغير المباشرة. علاوة على ذلك ، تفتقر أنظمة الاختبار في المختبر إلى التعقيد الفسيولوجي لعملية التمثيل الغذائي EDC والحرائك الدوائية في الثدييات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التعرض ل EDCs البيئية عادة ما ينطوي على خليط من مركبات متعددة ، بما في ذلك المستقلبات المتولدة في الجسم الحي ، لذلك لا يمكن تجاهل إمكانية التفاعلات. هذا التعقيد يجعل توصيف EDC صعبا. فأر مؤشر عمل هرمون الغدة الدرقية (THAI) هو نموذج معدل وراثيا يحمل نظام مراسل لوسيفيراز مستجيب ل TH ، مما يتيح تقييم عمل TH الخاص بالأنسجة. يمكن للمرء تقييم التأثيرات الخاصة بالأنسجة للمواد الكيميائية على عمل TH المحلي عن طريق تحديد تعبير مراسل لوسيفيراز في عينات الأنسجة. علاوة على ذلك ، مع التصوير في الجسم الحي ، يسمح نموذج الماوس التايلاندي بإجراء دراسات طولية حول تأثيرات EDCs المحتملة في الحية. يوفر هذا النهج أداة قوية لاختبار التعرض طويل الأجل أو هياكل العلاج المعقدة أو الانسحاب ، لأنه يتيح تقييم التغييرات في عمل TH المحلي بمرور الوقت في نفس. يصف هذا التقرير عملية قياسات التصوير في الجسم الحي على الفئران التايلاندية. يركز البروتوكول الذي تمت مناقشته هنا على تطوير وتصوير الفئران المفرطة والغدة الدرقية ، والتي يمكن أن تكون بمثابة عناصر تحكم. يمكن للباحثين تكييف أو توسيع العلاجات المقدمة لتلبية احتياجاتهم الخاصة ، وتقديم نهج أساسي لمزيد من التحقيق.

Introduction

إشارات هرمون الغدة الدرقية (TH) هي منظم أساسي لعملية التمثيل الغذائي الخلوي ، وهي ضرورية للتطور الطبيعي ووظيفة الأنسجة المثلى في مرحلة البلوغ¹. داخل الأنسجة ، يتم التحكم في عمل TH بدقة بواسطة آلية جزيئية معقدة ، مما يسمح بصيانة الأنسجة الخاصة بمستويات TH المحلية. هذا الاستقلال الذاتي للأنسجة المختلفة من مستويات TH المتداولة له أهمية كبيرة^2،3،4.

العديد من المواد الكيميائية لديها القدرة على تعطيل وظائف الغدد الصماء وتوجد في البيئة كملوثات. إنه قلق متزايد من أن هذه الجزيئات يمكن أن تدخل السلسلة الغذائية من خلال مياه الصرف الصحي والإنتاج الزراعي ، مما يؤثر على صحة الماشية والبشر^5،6،7.

أحد التحديات الكبيرة في معالجة هذه المشكلة هو العدد الهائل من المركبات المعنية ، بما في ذلك الجزيئات المصرح بها والمحظورة بالفعل ، ولكنها لا تزال موجودة باستمرار. في السنوات الأخيرة ، بذلت جهود كبيرة لتطوير أنظمة اختبار لفحص وتحديد الإمكانات التخريبية لمختلف المواد الكيميائية^8،9،10،11. في حين أن هذه الأساليب تتفوق في الفحص عالي الإنتاجية لآلاف المركبات وتحديد التهديدات المحتملة ، فإن التحليل التفصيلي للتأثيرات المحددة في الجسم الحي لهذه الجزيئات ضروري لتحديد مخاطر التعرض البشري. وبالتالي ، من الضروري اتباع نهج متعدد الأوجه عند دراسة وتوصيف المواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء (EDCs).

في سياق تنظيم TH ، يتطلب فهم العواقب الخاصة بالأنسجة للتعرض ل EDC تحديد كمية عمل TH المحلي. على الرغم من تطوير العديد من النماذج في الجسم الحي لهذا الغرض ، إلا أن معظمها يعتمد على العلامات الداخلية كمقياس للإنتاج. على الرغم من كونها فسيولوجية ، إلا أن هذه العلامات تخضع للعديد من الآليات التنظيمية ، المباشرة وغير المباشرة ، مما يجعل تفسيرها أكثر صعوبة. لذلك ، لا يزال توصيف تأثيرات EDC على تنظيم TH على مستوى الأنسجة يمثل تحديا كبيرا^12،13.

لمواجهة تحديات قياس إشارات TH الخاصة بالأنسجة ، تم تطوير نموذج الماوس لمؤشر عمل هرمون الغدة الدرقية (THAI) مؤخرا. يسمح هذا النموذج بتقدير كمي محدد للتغيرات في عمل TH المحلي في ظل الظروف الداخلية. تم إدخال جين تحوير لوسيفيراز في جينوم الفأر ، وهو حساس للغاية للتنظيم من خلال الإجراء^{TH 14}. أثبت هذا النموذج فعاليته في الإجابة على أسئلة البحث المختلفة التي تتطلب تحديد التغيرات في الأنسجة المحلية TH التي تشير^{إلى 14،15،16،17،18}.

إن التعرف على أحد الاستخدامات المحتملة للنموذج التايلاندي هو توصيف التأثيرات الخاصة بالأنسجة ل EDCs على إشارات TH. وقد استخدم النموذج مؤخرا بنجاح لاستقصاء التأثيرات الخاصة بالأنسجة لرباعي البروم ثنائي الفينول ألف وديكلازوريل على إشارات TH¹⁵. هنا ، يتم تقديم بروتوكولات خط الأساس لاستخدام تقنيات التصوير في الجسم الحي على النموذج التايلاندي كنظام اختبار لتوصيف EDCs التي تعطل وظيفة TH. تستفيد هذه الطريقة من الطبيعة الحيوية لتفاعل لوسيفيرين-لوسيفيراز. بشكل أساسي ، يحفز إنزيم اللوسيفيراز المعبر عنه وراثيا أكسدة اللوسيفرين المعطى ، مما يولد ضوءا مضيئا يتناسب مع كمية اللوسيفيراز في الأنسجة (الشكل 1). وبالتالي ، فإن الاستجابة البيولوجية المقاسة هي نشاط لوسيفيراز ، والذي تم التحقق من صحته كمقياس مناسب لعمل TH المحلي¹⁴. في حين أن نموذج THAI قابل للتطبيق لقياس عمل TH في جميع الأنسجة تقريبا ، يركز التصوير في الجسم الحي بشكل أساسي على عمل TH في الأمعاء الدقيقة (التصوير البطني) والأنسجة الدهنية البنية بين الكتفين (BAT ، التصوير الظهري)¹⁴.

من المزايا المهمة لتقنية التصوير في الجسم الحي أنها تلغي الحاجة إلى التضحية بالحيوانات من أجل القياسات. وهذا يسمح للباحثين بتصميم تجارب طولية ومتابعة كدراسات ذاتية التحكم ، مما يقلل من التحيز بين الموضوعات وعدد المستخدمة. هذا الجانب مهم بشكل خاص في توصيف EDC ، وقد تم إثبات قوة الطريقة وتعدد استخداماتها لهذا الغرض سابقا^14,15.

Protocol

تمت مراجعة هذا البروتوكول والموافقة عليه من قبل لجنة رعاية في معهد الطب التجريبي (PE / EA / 1490-7 / 2017 ، PE / EA / 106-2 / 2021). البيانات المقدمة مأخوذة من خلفية FVB / Ant¹⁴ ، ذكور الفئران التايلاندية البالغة من العمر 3 أشهر (ن = 3-6 / مجموعة). خلفية FVB / النمل تميل التايلاندية إلى وجود بقع شديدة التصبغ على جلدها قد تشوه القياسات. ومن ثم ، ابحث عن البقع المصطبغة على جلد المنطقة المصورة بعد إزالة الفراء. لا تتطلب ظروف سكن خاصة ما لم تتطلب التجربة ذلك على وجه التحديد (على سبيل المثال ، نظام غذائي خاص).

1. علاج فرط نشاط الغدة الدرقية

ملاحظة: يتم توفير بروتوكول عام لتحفيز فرط نشاط الغدة الدرقية في الفئران هنا. يقدم دليل ATA¹⁹ تفسيرات مفصلة حول خلفية الطرق مع البدائل المذكورة.

1. قم بإذابة T3 (3،5،3'-ثلاثي يودوثيرونين ، انظر جدول المواد) في 40 mM NaOH لإنشاء محلول مخزون بتركيز يتراوح بين 5-10 مجم / مل.
2. قم بتخفيف محلول المرق بالمحلول الملحي إلى تركيز نهائي قدره 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر.
3. حقن محلول T3 المخفف داخل الصفاق (i.p.) في المستيقظة بحجم 10 ميكرولتر لكل جرام من وزن الجسم (bwg). بعد 24 ساعة ، سيتم اعتبار فرط نشاط الغدة الدرقية.
   ملاحظة: يمكن استبدال علاج T3 بأي نوع آخر من العلاج. لا يؤثر العلاج على بروتوكول التصوير في الجسم الحي .

2. علاج الغدة الدرقية

ملاحظة: هنا ، يتم توفير بروتوكول عام فقط للحث على قصور الغدة الدرقية في الفئران. يصف دليل ATA¹⁹ تفسيرات مفصلة على خلفية الطرق مع البدائل المذكورة.

1. قم بتبديل النظام الغذائي إلى نظام غذائي خال من اليود وأضف KClO₄ و methimazole إلى مياه الشرب (0.01٪ ميثيمازول ، 0.05٪ KClO₄) (انظر جدول المواد).
2. استبدل محلول الشرب بانتظام (كل 2-3 أيام) بمحلول شرب طازج لأن الميثيمازول حساس للضوء ويتحلل بسرعة.
3. الحفاظ على نظام العلاج لمدة 2 أسابيع على الأقل ، لا يزيد عن 4 أسابيع. سوف تفقد الوزن وسوف تظهر عدم الراحة. إذا كانت بالكاد تتحرك ، أو فقدت الكثير من شعرها ، أو بالكاد كانت واعية ، فاستخدم نقطة نهاية إنسانية وقم بإنهائها بأي طريقة (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
4. استمر في علاج قصور الغدة الدرقية عندما يقترن بعلاجات أخرى لمنع الشفاء المحتمل من قصور الغدة الدرقية.

3. التصوير في الجسم الحي

1. ابدأ تشغيل البرنامج المتوافق مع نظام التصوير في الجسم الحي (انظر جدول المواد).
2. قم بتسجيل الدخول وانتظر حتى يتم تحميل لوحة "معالج التصوير". إنها لوحة أصغر في أسفل يسار النافذة.
3. في "معالج التصوير" ، ابدأ تبريد الكاميرا بالنقر فوق تهيئة في "لوحة معالج الصور". هذا يجعل الأداة تعمل على تشغيل بروتوكول إعداد ، انتظر حتى يكتمل. تتحول "لوحة معالج التصوير" إلى اللون الأزرق ، وسيتم تشغيل ضوء أخضر في اللوحة عندما تكون درجة حرارة الكاميرا منخفضة بدرجة كافية والجهاز جاهز.
4. اضبط درجة حرارة وسادة التدفئة على 30-37 درجة مئوية للحفاظ على دفء المقاسة.
   ملاحظة: استمر في البروتوكول أثناء انتظار أن تكون درجة حرارة الكاميرا مثالية.
5. لا تبقي أو تعامل بالقرب من الجهاز. تجنب الكميات الزائدة من الشعر المنتشر في الهواء حول الجهاز.
6. تخدير 1-3 بحقن الكيتامين - زيلازين (الكيتامين 50 ملغم/كغ من وزن الجسم، الزيلازين 10 ملغم/كغم من وزن الجسم، انظر جدول المواد). بدلا من ذلك ، إذا تم تركيب نظام تخدير إيزوفلوران ، فاتبع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا لاستخدام تخدير الأيزوفلوران ، لتحل محل خليط الكيتامين - الزيلازين.
   ملاحظة: الفئران الغدة الدرقية هي أكثر حساسية للكيتامين زيلازين. استخدم نصف جرعة.
7. استخدم جل حماية العين أثناء التخدير.
8. تحقق من منعكس الدواسة عن طريق الضغط على وسادات القدم. لا يوجد منعكس دواسة يؤكد حالة التخدير الجراحي للطائرة.
9. بعد سريان مفعول التخدير ، قم بإزالة الفراء من أجزاء الجسم المصورة باستخدام أنسب طريقة لإزالة الفراء (آلة إزالة الشعر ، الحلاقة ، الكريم ، إلخ). تأكد من عدم ترك الفراء على أجزاء الجسم المصورة لمنع تشتت الضوء المضيء.
10. قم بإذابة Na-luciferin (انظر جدول المواد) في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بتركيز 15 مجم / مل. لوسيفيرين حساس للضوء. تجنب التعرض المباشر للضوء. قم بتخزين المحلول في أنابيب كهرمانية أو لفه بورق الألمنيوم.
11. عالج الحليقة بمحلول لوسيفيرين 10 ميكرولتر / وزن الجسم i.p.
12. ضع في الجهاز مع وضع علامة "+" على نقطة مركز الكاميرا على اللوحة. تأكد من الموضع المناسب عن طريق التحقق من خطوط الشبكة والتأكيد بالتقاط "صورة" واحدة إذا لم تكن متأكدا.
13. انتظر لمدة 15 دقيقة بعد إعطاء الركيزة قبل أخذ القياس الأول. خلال هذا الوقت ، اضبط وقت التصوير في لوحة "معالج الصور" على 3 دقائق للتلألؤ وحدد مربعات الصور والتألق. "الصورة" ضرورية لتتزامن مع التلألؤ لتحديد مصدر الإشارة المقاسة.
    ملاحظة: مطلوب 15 دقيقة لامتصاص الركيزة الأمثل وتوزيع الأنسجة. هضبة إشارة الإنارة 15-20 دقيقة بعد إعطاء لوسيفيرين. تبدأ الإشارة في الانخفاض ببطء بعد الهضبة.
14. خذ القياس الأول بالنقر فوق قياس في لوحة "معالج التصوير".
15. إذا تم إجراء كل من التصوير البطني والظهري ، فأعد ترتيب للجزء الثاني من الجسم ليتم تصويره فور الانتهاء من الجزء الأول.
16. بعد الانتهاء من التصوير ، أعد إلى أقفاصها واستمر في التجربة مع المجموعة التالية من.
17. اسمح للحيوانات بالتعافي ، والتي تستغرق عادة 1-2 ساعة على الأكثر. ضع أنبوبا مملوءا بالماء الدافئ بالقرب من لتسهيل الشفاء ، ومراقبة العلامات الحيوية مثل التنفس والتروية.
18. تقرر مصير المقاسة. في البيانات المقدمة في هذه المقالة ، تم القتل الرحيم للحيوانات المقاسة وفقا للبروتوكولات المعتمدة مؤسسيا للقياسات خارج الجسم الحي . ومع ذلك ، هذا ليس ضروريا. فكر فيما إذا كان القتل الرحيم أو تجارب المتابعة أخلاقية.

4. تحليل البيانات

1. افتح ملف "ClickInfo" في البرنامج. سيتم فتح لوحة باسم "لوحة الأدوات" لتحليل الصور وتحريرها على الجانب الأيمن من النافذة.
2. تحويل المقياس إلى إشعاع في الزاوية العلوية اليسرى من الصورة.
3. انقر فوق "ضبط الصورة".
4. حدد التجميع الأمثل ومقياس الألوان للصور. اجعل جميع الصور تستخدم نفس الإعدادات.
5. انقر فوق "أدوات عائد الاستثمار" في "لوحة الأدوات".
6. حدد مجالات الاهتمام بالنقر فوق "وضع عائد الاستثمار" في "أدوات عائد الاستثمار". يمكن أن يكون استخدام نفس حجم عائد الاستثمار أو عائد استثمار مختلف الحجم مفيدا أيضا اعتمادا على التصميم التجريبي.
7. انقر فوق "قياس عائد الاستثمار". سيتم فتح نافذة جديدة تحتوي على بيانات عائد الاستثمار الموضوع. قم بتصدير البيانات باستخدام الأمر ctr + c-ctrl + v Windows إلى برنامج تنظيمي أو إحصائي من اختيارك.
8. يمكن تصدير البيانات كتدفق كلي أو إشعاع متوسط. اختر المتغير الأكثر صلة في الإعداد التجريبي الحالي.
9. مواصلة تحليل البيانات وفقا للتصميم التجريبي. يوصى بالحساب الفردي لقيم (الخلفية المعالجة) على أنها "تأثير مقاس في واحد".

النتائج

بشكل عام ، يتراوح الإشعاع المقاس من مقادير 10⁵ إلى 10¹⁰ p / s^{/ cm 2} / sr. ومع ذلك ، يمكن أن تختلف القيم الدقيقة بين داخل نفس الصورة وعبر الصور المختلفة. لذلك ، قد تكون مقارنة البيانات الأولية مضللة. من الضروري إنشاء إشارات تحكم وخلفية في جميع التجارب ، مما يجعل التص?...

Discussion

إن التهديدات التي تشكلها المواد الكيميائية المسببة لاضطرابات الغدد الصماء (EDCs) على صحة الإنسان معترف بها جيدا. ومع ذلك ، فإن البحث في EDCs يواجه تحديات هائلة. هذه التحديات هي جزئيا نتيجة لتعقيد نظام الغدد الصماء. تم تحديد العديد من EDCs لتعطيل أنظمة الغدد الصماء المتعددة في وقت^{واحد 22<...}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,5,3'-triiodothyronine (T3)	Merck	T2877
Animals, mice			THAI mouse
Eye protection gel	Oculotect		1000 IU/g
Falcon tube	Thermo Fisher Scientific		50 mL volume
Iodine-free chow diet	Research Diets	custom
IVIS Lumina II in vivo imaging system	Perkin Elmer	-
Ketamine	Vetcentre	E1857
Living Image software 4.5	Perkin Elmer	-	provided with the instrument
Measuring cylinder			250 mL
methimazole	Merck	M8506
Microfuge tubes	Eppendorf		For diluting treatment materials
NaClO4	Merck	71852
Na-luciferin, substrate	Goldbio	103404-75-7
NaOH	Merck	101052833
Phoshphate buffer saline	Chem Cruz	sc-362302
Pipette	Gilson		For diluting treatment materials
Pipette tips	Axygen		For diluting treatment materials
Shaving cream/epilator/shaver			Personal preference
Syringe	B Braun		1 mL volume
Syringe needle	B Braun		0.3 x 12 mm
Xylazine	Vetcentre	E1852