甲状腺ホルモン作用指標マウスによる内分泌かく乱化学効果のin vivo特性評価

要約

甲状腺ホルモン作用指標マウスモデルは、内因性調節機構を用いて局所的な甲状腺ホルモン作用の組織特異的な定量化を可能にするために開発されました。最近、このモデルは、甲状腺ホルモン経済と相互作用する内分泌かく乱化学物質を、 ex vivo および in vivo の両方の方法論によって特徴付けるのに適していることが示されています。

要約

甲状腺ホルモン(TH)は、細胞の代謝と組織機能に重要な役割を果たします。TH経済は、ホルモンの産生や作用を妨害する可能性のある内分泌かく乱化学物質(EDC)の影響を受けやすい。多くの環境汚染物質はEDCであり、人間の健康と農業生産の両方に対する新たな脅威となっています。このため、潜在的なEDCの影響を調べるための適切なテストシステムに対する需要が高まっています。しかし、現在の方法論は課題に直面しています。ほとんどの検査システムは、複数の複雑な調節プロセスによって制御される内因性マーカーを使用しているため、直接的影響と間接的影響を区別することは困難です。さらに、 in vitro 試験システムは、哺乳類のEDC代謝および薬物動態の生理学的複雑さを欠いています。さらに、環境EDCへの曝露には、通常、 in vivo で生成された代謝物を含む複数の化合物の混合物が含まれるため、相互作用の可能性を無視することはできません。この複雑さがEDCの特性評価を困難にしています。甲状腺ホルモン作用指標(THAI)マウスは、TH応答性ルシフェラーゼレポーターシステムを搭載したトランスジェニックモデルであり、組織特異的なTH作用の評価を可能にします。組織サンプル中のルシフェラーゼレポーターの発現を定量化することにより、局所的なTH作用に対する化学物質の組織特異的な影響を評価できます。さらに、 in vivo イメージングにより、タイ国際マウスモデルは、生きた動物における潜在的なEDCの影響に関する縦断的研究を可能にします。このアプローチは、同じ動物における局所的なTH作用の経時的な変化を評価できるため、長期曝露、複雑な治療構造、または離脱をテストするための強力なツールを提供します。本報告では、タイ国際航空マウスの in vivo イメージング測定の過程について報告する。ここで説明するプロトコルは、対照として役立つ甲状腺機能亢進症および甲状腺機能低下症マウスの開発とイメージングに焦点を当てています。研究者は、提示された治療法を特定のニーズに合わせて適応または拡張し、さらなる研究のための基本的なアプローチを提供することができます。

概要

甲状腺ホルモン(TH)シグナル伝達は、細胞代謝の基本的な調節因子であり、成人期の正常な発達と最適な組織機能に不可欠です¹。組織内では、TH作用は複雑な分子機構によって細かく制御されており、局所的なTHレベルの組織特異的な維持を可能にします。循環THレベルからの異なる組織のこの自律性は非常に重要です^2,3,4。

多くの化学物質は内分泌機能を破壊する可能性があり、汚染物質として環境中に見られます。これらの分子が廃水や農業生産を通じて食物連鎖に入り、それによって家畜や人間の健康に影響を与える可能性があるという懸念が高まっています^5,6,7。

この問題に取り組む上での大きな課題の1つは、認可された分子とすでに禁止されているが依然として存在し続けている分子の両方を含む、関与する化合物の数が非常に多いことです。近年、さまざまな化学物質の破壊的可能性をスクリーニングおよび特定するための試験システムを開発するために多大な努力が払われています^8,9,10,11。これらの分析法は、数千の化合物のハイスループットスクリーニングと潜在的な脅威の特定に優れていますが、ヒトへの曝露の危険性を確立するには、これらの分子の特定の in vivo 効果の詳細な分析が不可欠です。したがって、内分泌かく乱化学物質(EDC)の研究と特性評価には、多面的なアプローチが必要です。

TH調節の文脈では、EDC曝露の組織特異的な影響を理解するには、局所的なTH作用を定量化する必要があります。この目的のためにいくつかのin vivoモデルが開発されていますが、そのほとんどは出力尺度として内因性マーカーに依存しています。生理学的であるにもかかわらず、これらのマーカーは直接的および間接的な多くの調節メカニズムの影響を受けるため、その解釈はより困難になります。したがって、組織レベルでのTH調節に対するEDCの影響を特徴付けることは、依然として重要な課題です^12,13。

組織特異的なTHシグナル伝達を測定するという課題に対処するために、甲状腺ホルモン作用指標(THAI)マウスモデルが最近開発されました。このモデルにより、内因性条件下での局所的なTH作用の変化を具体的に定量化することができます。ルシフェラーゼ導入遺伝子をマウスゲノムに導入したが、マウスゲノムはTH作用¹⁴による調節に非常に敏感である。このモデルは、局所組織THシグナル伝達の変化を定量化する必要があるさまざまな研究課題への回答に有効性を実証しています^{14、15、16、17、18}。

THAIモデルの潜在的な用途の1つとして、THシグナル伝達に対するEDCの組織特異的効果の特性評価が認められています。このモデルは最近、THシグナル伝達に対するテトラブロモビスフェノールAとジクラズリルの組織特異的効果を調査するために採用され、成功を収めている¹⁵。ここでは、TH機能を破壊するEDCを特徴付けるためのテストシステムとして、THAIモデルで in vivo イメージング技術を利用するためのベースラインプロトコルを示します。この方法は、ルシフェリン-ルシフェラーゼ反応の生物発光性を利用します。基本的に、トランスジェニック発現したルシフェラーゼ酵素は、投与されたルシフェリンの酸化を触媒し、組織内のルシフェラーゼの量に比例した発光を生成します(図1)。その結果、測定された生物学的応答はルシフェラーゼ活性であり、これは局所的なTH作用の適切な尺度として検証されている¹⁴。THAIモデルは、事実上すべての組織におけるTH作用の定量化に適用可能であるが、 in vivo イメージングは、主に小腸におけるTH作用(腹側イメージング)と肩甲骨間褐色脂肪組織(BAT、背側イメージング)に焦点を当てている¹⁴。

in vivoイメージング技術の大きな利点は、測定のために動物を犠牲にする必要がないことです。これにより、研究者は縦断的および追跡実験を自己対照研究として設計することができ、被験者間のバイアスと使用される動物の数を減らすことができます。この側面はEDCの特性評価において特に重要であり、この目的のための分析法の強度と汎用性は以前に実証されています^14,15。

プロトコル

本プロトコルは、実験医学研究所の動物福祉委員会(PE/EA/1490-7/2017、PE/EA/106-2/2021)によってレビューされ、承認されました。提示されたデータは、FVB/Antバックグラウンド¹⁴、3ヶ月齢の雄タイマウス(n = 3-6/グループ)からのものです。FVB/アリの背景 タイ国際航空の動物は、皮膚に色素沈着の強い斑点がある傾向があり、測定値を歪める可能性があります。したがって、毛皮除去後の画像領域の皮膚の色素斑を検索します。動物は、実験で特に必要でない限り、特別な飼育条件を必要としません(例えば、特別な食事)。

1.甲状腺機能亢進症治療

注:マウスに甲状腺機能亢進症を誘発するための一般的なプロトコルは、ここに記載されています。ATAガイド¹⁹ は、代替案が言及された方法の背景に関する詳細な説明を提供します。

1. T3(3,5,3'-トリヨードチロニン、 材料表を参照)を40 mM NaOHに溶解し、濃度5〜10 mg/mLのストック溶液を作成します。
2. 原液を生理食塩水で最終濃度0.1 μg/μLに希釈します。
3. 希釈したT3溶液を、体重(bwg)あたり10 μLの容量で覚醒した動物に腹腔内(i.p.)に注射します。.24時間後、動物は甲状腺機能亢進症と見なされます。
   注:T3治療は、他の種類の治療に置き換えることができます。この治療は、 in vivo イメージングのプロトコルに影響を与えません。

2.甲状腺機能低下症治療

注:ここでは、マウスに甲状腺機能低下症を誘発するための一般的なプロトコルのみが提供される。ATA ガイド¹⁹ では、方法の背景について詳細な説明が説明されており、代替案が言及されています。

1. 食事をヨウ素を含まないチャウ食に切り替え、KClO₄ とメチマゾールを飲料水(0.01%メチマゾール、0.05%KClO₄)に加えます( 材料表を参照)。
2. メチマゾールは光に敏感ですぐに分解するため、定期的に(2〜3日ごとに)飲用溶液を新しい飲用溶液と交換してください。.
3. 治療計画を少なくとも2週間、4週間以内に維持します。動物は体重が減り、不快感を示します。動物がほとんど動き回っていない場合、毛の大部分を失っている場合、またはほとんど意識がない場合は、人道的なエンドポイントを使用し、何らかの方法で(施設で承認されたプロトコルに従って)動物を終了させます。
4. 甲状腺機能低下症からの回復の可能性を防ぐために、他の治療と組み合わせた場合、甲状腺機能低下症治療を継続します。.

3. 生体内 イメージング

1. in vivoイメージングシステム(材料表参照)に対応したソフトウェアを起動します。
2. ログインして、「イメージングウィザード」パネルがロードされるのを待ちます。ウィンドウの左下にある小さなパネルです。
3. 「イメージングウィザード」で、「イメージウィザードパネル」の 「初期化 」をクリックして、カメラの冷却を開始します。これにより、機器はセットアッププロトコルを実行し、完了するまで待機します。「イメージングウィザードパネル」が青色に変わり、カメラの温度が十分に低く、機器の準備が整うと、パネル内の緑色のライトが点灯します。
4. 測定された動物を暖かく保つために、加熱パッドの温度を30〜37°Cに設定します。
   注意: カメラの温度が最適になるのを待っている間、プロトコルを続行します。
5. 器具の近くで動物を飼ったり、扱ったりしないでください。楽器の周りの空気中を循環する過剰な量の髪の毛を避けてください。
6. ケタミン-キシラジンi.p.注射で1〜3匹の動物に麻酔をかけます(ケタミン50 mg / kg体重、キシラジン10 mg / kg体重、 材料表を参照)。または、イソフルラン麻酔システムが設置されている場合は、施設で承認されたプロトコルに従ってイソフルラン麻酔を使用し、ケタミンとキシラジンの混合物を交換します。.
   注:甲状腺機能低下症マウスは、ケタミンキシラジンに対してより感受性があります。半分の用量を使用してください。
7. 麻酔中は目の保護具を使用してください。
8. フットパッドをつまんでペダル反射を確認します。ペダル反射は、手術平面麻酔の状態を確認しません。
9. 麻酔が効いたら、最適な脱毛方法(脱毛器、シェービング、クリームなど)を使用して、画像化した体の部分から毛を取り除きます。発光の散乱を防ぐために、画像化された体の部分に毛皮が残っていないことを確認してください。
10. Na-ルシフェリン( 材料表を参照)を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に15 mg/mLの濃度で溶解します。ルシフェリンは光に敏感です。直射日光を避けてください。溶液を琥珀色のチューブに保管するか、アルミホイルで包みます。
11. 剃毛した動物をルシフェリン溶液 10 μL/bwg i.p. で処理します。
12. 動物を機器に入れ、カメラの中心点をパッドに「+」でマークします。グリッド線を確認し、不明な場合は1つの「写真」キャプチャで確認して、適切な配置を確認します。
13. 基質投与後15分待ってから、最初の測定を行います。この間、「画像ウィザード」パネルのイメージング時間を発光の3分に設定し、 写真 と 発光のチェックボックスをオンにします。「写真」は、測定された信号のソースを特定するために発光と一致する必要があります。
    注:最適な基質の取り込みと組織分布には15分が必要です。発光シグナルは、ルシフェリン投与の15〜20分後にプラトーします。.プラトーを過ぎると、信号はゆっくりと減少し始めます。
14. 「イメージングウィザード」パネルの 「測定 」をクリックして、最初の測定を行います。
15. 腹側と背側の両方の画像診断を行う場合は、最初の画像診断を終了した直後に、2番目の身体部位を画像化するために動物を再配置します。
16. イメージングが終わったら、動物をケージに戻し、次の動物で実験を続けます。
17. 動物が回復するのを待ちますが、通常は最大で1〜2時間かかります。動物の近くに温水で満たされたチューブを置き、回復を促進し、呼吸や灌流などのバイタルサインを監視します。
18. 測定された動物の運命を決定します。この記事で紹介するデータでは、測定された動物は、 ex vivo 測定のために施設で承認されたプロトコルに従って安楽死させられました。ただし、これは必須ではありません。安楽死や追跡実験が倫理的かどうかを検討する。

4. データ分析

1. ソフトウェアで 「ClickInfo」 ファイルを開きます。ウィンドウの右側に、画像解析と編集用の「ツールパレット」という名前のパネルが開きます。
2. 画像の左上隅でスケールを放射輝度に変換します。
3. 「画像調整」をクリックします。
4. 画像の最適なビニングとカラースケールを決定します。すべての画像で同じ設定を使用するようにします。
5. 「ツールパレット」の「ROIツール」 をクリックします。
6. 「ROIツール」の「ROIの配置」をクリックして、関心のある領域を選択します。同じサイズのROIまたは異なるサイズのROIを使用することも、実験計画によっては意味があります。
7. 「ROIの測定」をクリックします。新しいウィンドウが開き、配置されたROIのデータが表示されます。 ctr + c-ctrl + v Windowsコマンドを使用して、選択した整理ソフトウェアまたは統計ソフトウェアにデータをエクスポートします。
8. データは、全フラックスまたは平均放射輝度としてエクスポートできます。現在の実験設定に最も関連性の高い変数を選択します。
9. 実験計画に従ってデータ解析を続行する。「1匹の動物で測定された効果」として、(処理された背景)値を個別に計算することをお勧めします。

結果

一般に、測定された放射輝度は10⁵ から10^{10 p} /s/cm²/srの大きさの範囲です。ただし、正確な値は、同じ画像内の動物間および異なる画像間で異なる場合があります。したがって、生データを比較すると誤解を招く可能性があります。すべての実験において、制御信号とバックグラウンド信号を確立することが重要であるため、自己制御設計を強?...

ディスカッション

内分泌かく乱化学物質(EDC)が人間の健康にもたらす脅威はよく認識されています。しかし、EDCの研究は手ごわい課題に直面しています。これらの課題は、内分泌系の複雑さに部分的に起因しています。多くのEDCは、複数の内分泌系を同時に破壊することが確認されている²²。さらに、甲状腺ホルモン(TH)経済の文脈では、TH作用の調節における組織特異的な違いにより、複雑さ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,5,3'-triiodothyronine (T3)	Merck	T2877
Animals, mice			THAI mouse
Eye protection gel	Oculotect		1000 IU/g
Falcon tube	Thermo Fisher Scientific		50 mL volume
Iodine-free chow diet	Research Diets	custom
IVIS Lumina II in vivo imaging system	Perkin Elmer	-
Ketamine	Vetcentre	E1857
Living Image software 4.5	Perkin Elmer	-	provided with the instrument
Measuring cylinder			250 mL
methimazole	Merck	M8506
Microfuge tubes	Eppendorf		For diluting treatment materials
NaClO4	Merck	71852
Na-luciferin, substrate	Goldbio	103404-75-7
NaOH	Merck	101052833
Phoshphate buffer saline	Chem Cruz	sc-362302
Pipette	Gilson		For diluting treatment materials
Pipette tips	Axygen		For diluting treatment materials
Shaving cream/epilator/shaver			Personal preference
Syringe	B Braun		1 mL volume
Syringe needle	B Braun		0.3 x 12 mm
Xylazine	Vetcentre	E1852