אפיון In vivo של השפעות כימיות משבשות אנדוקריניות באמצעות עכבר מחוון פעולה של הורמון בלוטת התריס

Summary

מודל העכבר Thyroid Hormone Action Indicator פותח כדי לאפשר כימות ספציפי לרקמה של פעולת הורמון בלוטת התריס המקומית באמצעות מנגנון הבקרה האנדוגני שלו. לאחרונה הוכח כי המודל מתאים לאפיון כימיקלים משבשי אנדוקרינית המקיימים אינטראקציה עם כלכלת הורמוני בלוטת התריס, הן במתודולוגיות ex vivo והן במתודולוגיות in vivo .

Abstract

הורמוני בלוטת התריס (TH) ממלאים תפקיד קריטי בחילוף החומרים בתאים ובתפקוד הרקמות. כלכלת TH רגישה לכימיקלים משבשים אנדוקריניים (EDC) שיכולים להפריע לייצור הורמונים או לפעולה. מזהמים סביבתיים רבים הם EDC, המייצגים איום מתפתח הן על בריאות האדם והן על הייצור החקלאי. זה הוביל לדרישה מוגברת למערכות בדיקה מתאימות כדי לבחון את ההשפעות של EDCs פוטנציאליים. עם זאת, המתודולוגיות הנוכחיות עומדות בפני אתגרים. רוב מערכות הבדיקה משתמשות בסמנים אנדוגניים המווסתים על ידי תהליכים רגולטוריים מרובים, לעתים קרובות מורכבים, מה שמקשה על הבחנה בין השפעות ישירות ועקיפות. יתר על כן, מערכות בדיקה במבחנה חסרות את המורכבות הפיזיולוגית של מטבוליזם EDC ופרמקוקינטיקה ביונקים. בנוסף, חשיפה ל-EDCs סביבתיים כרוכה בדרך כלל בתערובת של תרכובות מרובות, כולל מטבוליטים הנוצרים in vivo , כך שלא ניתן להתעלם מהאפשרות של אינטראקציות. מורכבות זו מקשה על אפיון EDC. עכבר מחוון הפעולה של הורמון בלוטת התריס (THAI) הוא מודל מהונדס הנושא מערכת מדווחת לוציפראז המגיבה TH, המאפשרת הערכה של פעולת TH ספציפית לרקמות. ניתן להעריך את ההשפעות הספציפיות לרקמות של כימיקלים על פעולת TH מקומית על ידי כימות ביטוי כתב לוציפראז בדגימות רקמה. יתר על כן, עם הדמיה in vivo , מודל העכבר התאילנדי מאפשר מחקרי אורך על ההשפעות של EDCs פוטנציאליים בבעלי חיים חיים. גישה זו מספקת כלי רב עוצמה לבדיקת חשיפה ארוכת טווח, מבני טיפול מורכבים או גמילה, שכן היא מאפשרת להעריך שינויים בפעולת TH מקומית לאורך זמן באותה חיה. דוח זה מתאר את התהליך של מדידות הדמיה in vivo על עכברים תאילנדים. הפרוטוקול הנדון כאן מתמקד בפיתוח והדמיה של עכברי יתר ותת-פעילות של בלוטת התריס, שיכולים לשמש כאמצעי בקרה. חוקרים יכולים להתאים או להרחיב את הטיפולים המוצגים כדי לענות על הצרכים הספציפיים שלהם, ולהציע גישה בסיסית לחקירה נוספת.

Introduction

איתות הורמון בלוטת התריס (TH) הוא מווסת בסיסי של חילוף החומרים בתאים, חיוני להתפתחות תקינה ולתפקוד רקמות אופטימלי בבגרות¹. בתוך רקמות, פעולת TH נשלטת היטב על ידי מנגנון מולקולרי מורכב, המאפשר תחזוקה ספציפית לרקמות של רמות TH מקומיות. אוטונומיה זו של רקמות שונות מרמות TH במחזור היא בעלת חשיבות רבה ^2,3,4.

לכימיקלים רבים יש פוטנציאל לשבש את התפקודים האנדוקריניים והם נמצאים בסביבה כמזהמים. קיים חשש גובר כי מולקולות אלה יכולות להיכנס לשרשרת המזון באמצעות שפכים וייצור חקלאי, ובכך להשפיע על בריאותם של בעלי חיים ובני אדם ^5,6,7.

אחד האתגרים המשמעותיים בהתמודדות עם בעיה זו הוא המספר העצום של תרכובות המעורבות, כולל מולקולות מאושרות וכבר אסורות, אך עדיין קיימות בהתמדה. בשנים האחרונות נעשו מאמצים ניכרים לפתח מערכות בדיקה לסינון וזיהוי הפוטנציאל המשבש של כימיקלים שונים 8,9,10,11. בעוד שיטות אלה מצטיינות בסינון תפוקה גבוהה של אלפי תרכובות וזיהוי איומים פוטנציאליים, ניתוח מפורט של השפעות in vivo ספציפיות של מולקולות אלה חיוני כדי לקבוע את הסיכונים של חשיפה אנושית. לפיכך, גישה רבת פנים נחוצה בעת לימוד ואפיון כימיקלים משבשי אנדוקרינית (EDC).

בהקשר של רגולציית TH, הבנת ההשלכות הספציפיות לרקמות של חשיפה ל-EDC דורשת כימות של פעולת TH מקומית. למרות שמספר מודלים in vivo פותחו למטרה זו, רובם מסתמכים על סמנים אנדוגניים כמדד התפוקה שלהם. למרות היותם פיזיולוגיים, סמנים אלה כפופים למנגנוני ויסות רבים, ישירים ועקיפים, מה שהופך את הפרשנות שלהם למאתגרת יותר. לכן, אפיון השפעות EDC על ויסות TH ברמת הרקמה נותר אתגר משמעותי^12,13.

כדי להתמודד עם האתגרים של מדידת איתות TH ספציפי לרקמות, פותח לאחרונה מודל העכבר Thyroid Hormone Action Indicator (THAI). מודל זה מאפשר כימות ספציפי של שינויים בפעולת TH מקומית בתנאים אנדוגניים. טרנסגן לוציפראז הוכנס לגנום העכבר, הרגיש מאוד לוויסות על ידי פעולת TH¹⁴. מודל זה הוכיח יעילות במענה על שאלות מחקר שונות הדורשות כימות שינויים באיתות TH מקומי ברקמה 14,15,16,17,18.

זיהוי אחד של שימוש פוטנציאלי במודל THAI הוא אפיון השפעות ספציפיות לרקמות של EDCs על איתות TH. המודל שימש לאחרונה בהצלחה כדי לחקור את ההשפעות הספציפיות לרקמות של tetrabromobisphenol A ו diclazuril על איתות TH¹⁵. כאן, פרוטוקולים בסיסיים מוצגים לשימוש בטכניקות הדמיה in vivo במודל THAI כמערכת בדיקה לאפיון EDCs המשבשים את תפקוד TH. שיטה זו ממנפת את האופי הביו-לומינסנטי של תגובת לוציפרין-לוציפראז. בעיקרו של דבר, האנזים לוציפראז המתבטא באופן טרנסגני מזרז את החמצון של לוציפרין המנוהל, ומייצר אור זוהר פרופורציונלי לכמות הלוציפראז ברקמה (איור 1). כתוצאה מכך, התגובה הביולוגית שנמדדה היא פעילות לוציפראז, שאומתה כמדד מתאים לפעולת TH מקומית¹⁴. בעוד שהמודל התאילנדי ישים לכימות פעולת TH כמעט בכל הרקמות, הדמיית in vivo מתמקדת בעיקר בפעולת TH במעי הדק (הדמיה גחון) וברקמת השומן החומה הבין-סקפולרית (BAT, הדמיה גבית)¹⁴.

יתרון משמעותי של טכניקת ההדמיה in vivo הוא שהיא מבטלת את הצורך להקריב בעלי חיים עבור מדידות. זה מאפשר לחוקרים לתכנן ניסויי אורך ומעקב כמחקרים בשליטה עצמית, תוך הפחתת ההטיות בין הנבדקים ומספר בעלי החיים בשימוש. היבט זה חיוני במיוחד באפיון EDC, ועוצמתה ורבגוניותה של השיטה למטרה זו הודגמו בעבר^14,15.

Protocol

הפרוטוקול הנוכחי נבדק ואושר על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים במכון לרפואה ניסויית (PE/EA/1490-7/2017, PE/EA/106-2/2021). הנתונים המוצגים הם מרקע FVB/Ant¹⁴, עכברי THAI זכרים בני 3 חודשים (n = 3-6/קבוצה). FVB/Ant רקע בעלי חיים תאילנדים נוטים להיות בעלי כתמים פיגמנטיים מאוד על עורם שעלולים לעוות את המדידות. לפיכך, חפשו כתמי פיגמנט על העור של האזור המצולם לאחר הסרת פרווה. בעלי חיים אינם זקוקים לתנאי דיור מיוחדים, אלא אם כן הניסוי דורש זאת במפורש (למשל, תזונה מיוחדת).

1. טיפול בלוטת התריס

הערה: פרוטוקול כללי לגרימת פעילות יתר של בלוטת התריס בעכברים מסופק כאן. מדריך אתא¹⁹ מציע הסברים מפורטים על רקע השיטות עם חלופות שהוזכרו.

1. יש להמיס T3 (3,5,3'-triiodothyronine, ראו טבלת חומרים) ב-40 mM NaOH ליצירת תמיסת ציר בריכוז שבין 5-10 מ"ג/מ"ל.
2. יש לדלל את תמיסת הציר במי מלח לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם/מיקרוליטר.
3. הזריקו את תמיסת T3 המדוללת תוך צפקית (כלומר) לבעלי חיים ערים בנפח של 10 מיקרוליטר לגרם משקל גוף (bwg). לאחר 24 שעות, בעלי החיים ייחשבו בלוטת התריס.
   הערה: טיפול T3 יכול להיות מוחלף על ידי כל סוג אחר של טיפול. הטיפול אינו משפיע על פרוטוקול ההדמיה in vivo .

2. טיפול בבלוטת התריס

הערה: כאן, רק פרוטוקול כללי לגרימת תת פעילות של בלוטת התריס בעכברים מסופק. מדריך אתא¹⁹ מתאר הסברים מפורטים על רקע השיטות עם החלופות שהוזכרו.

1. החליפו את התזונה לדיאטת צ'או נטולת יוד והוסיפו למי השתייה KClO₄ ומתימזול (0.01% מתימאזול, 0.05% KClO₄) (ראו טבלת חומרים).
2. החליפו את תמיסת השתייה באופן קבוע (כל 2-3 ימים) בתמיסת שתייה טרייה מכיוון שמתימזול רגיש לאור ומתפרק במהירות.
3. שמור על משטר הטיפול לפחות 2 שבועות, לא יותר מ 4 שבועות. בעלי חיים ירדו במשקל ויראו אי נוחות. אם בעלי חיים בקושי זזים, איבדו חלק ניכר משערם, או שהם בקושי בהכרה, השתמשו בנקודת קצה אנושית והפסיקו אותם בכל שיטה שהיא (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הממסד).
4. המשך טיפול בהיפותירואיד בשילוב עם טיפולים אחרים כדי למנוע התאוששות פוטנציאלית מתת פעילות של בלוטת התריס.

3. הדמיה in vivo

1. הפעל את התוכנה התואמת למערכת ההדמיה in vivo (ראה טבלת חומרים).
2. היכנס והמתן לטעינת החלונית "אשף ההדמיה". זהו פאנל קטן יותר בפינה השמאלית התחתונה של החלון.
3. על "אשף הדמיה" ליזום קירור המצלמה על ידי לחיצה על אתחול בחלונית "אשף תמונה". זה גורם למכשיר להריץ פרוטוקול התקנה, לחכות שהוא יושלם. "לוח אשף ההדמיה" הופך לכחול, ואור ירוק יידלק בלוח כאשר טמפרטורת המצלמה נמוכה מספיק והמכשיר מוכן.
4. הגדר את הטמפרטורה של כרית החימום ל 30-37 מעלות צלזיוס כדי לשמור על בעלי החיים שנמדדו חמים.
   הערה: המשך עם הפרוטוקול בזמן שאתה ממתין שטמפרטורת המצלמה תהיה אופטימלית.
5. אין להחזיק או לטפל בבעלי חיים בקרבת המכשיר. הימנעו מכמויות עודפות של שיער המסתובבות באוויר סביב המכשיר.
6. מרדימים 1-3 בעלי חיים בהזרקת קטמין-קסילזין (קטמין 50 מ"ג/ק"ג משקל גוף, קסילזין 10 מ"ג/ק"ג משקל גוף, ראו טבלת חומרים). לחלופין, אם מותקנת מערכת הרדמה איזופלורנית, פעל לפי פרוטוקולים מאושרים מוסדיים לשימוש בהרדמה איזופלורנית, המחליפה את תערובת קטמין-קסילזין.
   הערה: עכברים עם תת-פעילות של בלוטת התריס רגישים יותר לקטמין-קסילזין; יש להשתמש בחצי מנה.
7. יש להשתמש בג'ל להגנה על העיניים במהלך ההרדמה.
8. בדוק את רפלקס הדוושה על ידי צביטת כריות הרגליים. אין רפלקס דוושה המאשר את מצב ההרדמה במישור הניתוח.
9. לאחר כניסת ההרדמה לתוקף, יש להסיר את הפרווה מחלקי הגוף המצולמים בשיטה המתאימה ביותר להסרת פרווה (אפילטור, גילוח, קרם וכו'). ודא שלא נותרה פרווה על חלקי הגוף המצולמים, כדי למנוע פיזור של אור זוהר.
10. להמיס Na-luciferin (ראה טבלה של חומרים) במי מלח חוצצים פוספט 1x (PBS) בריכוז של 15 מ"ג / מ"ל. לוציפרין רגיש לאור; יש להימנע מחשיפה ישירה לאור. אחסנו את התמיסה בצינורות ענבר או עטפו אותה ברדיד אלומיניום.
11. טפל בבעלי חיים מגולחים עם תמיסת לוציפרין 10 μL / bwg i.p.
12. הכניסו את החיות למכשיר כאשר נקודת המרכז של המצלמה מסומנת כ-'+' על הפד. ודא מיקום תקין על ידי בדיקת קווי הרשת ואישור עם לכידת 'תמונה' אחת אם אינך בטוח.
13. המתן 15 דקות לאחר מתן המצע לפני ביצוע המדידה הראשונה. במהלך זמן זה, הגדר את זמן ההדמיה בחלונית "אשף התמונות" ל -3 דקות עבור הארה וסמן את התיבות עבור Photo ו - Luminescence. ה'תמונה' נחוצה כדי לחפוף עם הארה כדי לזהות את מקור האות הנמדד.
    הערה: נדרשות 15 דקות לספיגת מצע אופטימלית ופיזור רקמות. מישור האות הזוהר 15-20 דקות לאחר מתן לוציפרין. האות מתחיל לרדת לאט אחרי הרמה.
14. בצע את המדידה הראשונה על ידי לחיצה על מדידה בחלונית "אשף ההדמיה".
15. אם מבוצעות הדמיה גחונית וגבית, סדרו מחדש בעלי חיים כך שחלק הגוף השני יודמה מיד לאחר סיום הראשון.
16. לאחר ביצוע ההדמיה, החזירו את החיות לכלובים שלהן והמשיכו את הניסוי עם קבוצת החיות הבאה.
17. אפשרו לבעלי החיים להתאושש, מה שבדרך כלל לוקח 1-2 שעות לכל היותר. הניחו צינור מלא במים חמים ליד בעלי החיים כדי להקל על ההתאוששות, ולעקוב אחר סימנים חיוניים כגון נשימה וזילוח.
18. להחליט על גורלם של בעלי חיים מדודים. בנתונים המוצגים במאמר זה, בעלי החיים שנמדדו הומתו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי מוסדות למדידות ex vivo . עם זאת, זה לא הכרחי. שקול אם המתת חסד או ניסויי מעקב הם אתיים.

4. ניתוח נתונים

1. פתח את הקובץ "ClickInfo" בתוכנה. פאנל בשם "לוח כלים" לניתוח ועריכת תמונות ייפתח בצד ימין של החלון.
2. המירו קנה מידה לזוהר בפינה השמאלית העליונה של התמונה.
3. לחץ על "התאמת תמונה".
4. החליטו על השילוב וסקאלת הצבעים האופטימליים של התמונות. גרום לכל התמונות להשתמש באותן הגדרות.
5. לחץ על "כלי ROI" על "לוח כלים".
6. בחר תחומי עניין על ידי לחיצה על "Place ROI" ב "כלי החזר השקעה". שימוש באותו גודל ROI או ROI בגדלים שונים יכול גם להיות משמעותי בהתאם לתכנון הניסוי.
7. לחץ על "מדידת החזר השקעה". חלון חדש ייפתח עם הנתונים של ROI שהוצבו. יצא את הנתונים באמצעות הפקודה ctr + c-ctrl + v Windows לתוכנה מארגנת או סטטיסטית לפי בחירה.
8. ניתן לייצא נתונים כשטף כולל או זוהר ממוצע. בחר איזה משתנה הוא הרלוונטי ביותר במסגרת הניסוי הנוכחית.
9. המשך ניתוח נתונים בהתאם לתכנון הניסוי. מומלץ לבצע חישוב פרטני של ערכים (המטופלים ברקע) כ"השפעה נמדדת בחיה אחת".

תוצאות

באופן כללי, הקרינה הנמדדת נעה בין סדרי גודל של 10⁵ ל^{10 10} p/s/cm²/sr. עם זאת, ערכים מדויקים יכולים להשתנות בין בעלי חיים באותה תמונה ובין תמונות שונות. לכן, השוואת נתונים גולמיים עלולה להטעות. חיוני לבסס אותות בקרה ורקע בכל הניסויים, מה שהופך עיצובים בשליטה עצמית ?...

Discussion

האיומים שמציבים כימיקלים משבשים אנדוקריניים (EDC) לבריאות האדם מוכרים היטב; עם זאת, המחקר על EDCs עומד בפני אתגרים עצומים. אתגרים אלה הם בחלקם תוצאה של המורכבות של המערכת האנדוקרינית. EDCs רבים זוהו כמשבשים בו זמנית מערכות אנדוקריניות מרובות²². בנוסף, בהקשר של כלכלת הורמון בלוטת התר?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,5,3'-triiodothyronine (T3)	Merck	T2877
Animals, mice			THAI mouse
Eye protection gel	Oculotect		1000 IU/g
Falcon tube	Thermo Fisher Scientific		50 mL volume
Iodine-free chow diet	Research Diets	custom
IVIS Lumina II in vivo imaging system	Perkin Elmer	-
Ketamine	Vetcentre	E1857
Living Image software 4.5	Perkin Elmer	-	provided with the instrument
Measuring cylinder			250 mL
methimazole	Merck	M8506
Microfuge tubes	Eppendorf		For diluting treatment materials
NaClO4	Merck	71852
Na-luciferin, substrate	Goldbio	103404-75-7
NaOH	Merck	101052833
Phoshphate buffer saline	Chem Cruz	sc-362302
Pipette	Gilson		For diluting treatment materials
Pipette tips	Axygen		For diluting treatment materials
Shaving cream/epilator/shaver			Personal preference
Syringe	B Braun		1 mL volume
Syringe needle	B Braun		0.3 x 12 mm
Xylazine	Vetcentre	E1852