갑상선 호르몬 작용 지표 마우스를 통한 내분비 교란 화학 효과의 생체 내 특성 분석

요약

갑상선 호르몬 작용 지표 마우스 모델은 내인성 조절 기계를 사용하여 국소 갑상선 호르몬 작용의 조직 특이적 정량화를 가능하게 하기 위해 개발되었습니다. 최근에, 이 모델은 갑상선 호르몬 경제와 상호작용하는 내분비계 교란 화학물질을 생체 외 및 생체 내 방법론 모두에서 특성화하는 데 적합하다는 것이 밝혀졌습니다.

초록

갑상선 호르몬(TH)은 세포 대사와 조직 기능에 중요한 역할을 합니다. TH 경제는 호르몬 생성이나 작용을 방해할 수 있는 내분비 교란 화학 물질(EDC)에 취약합니다. 많은 환경 오염 물질은 인간의 건강과 농업 생산 모두에 대한 새로운 위협이 되는 EDC입니다. 이로 인해 잠재적인 EDC의 영향을 검사하기 위한 적절한 테스트 시스템에 대한 수요가 증가했습니다. 그러나 현재의 방법론은 어려움에 직면해 있습니다. 대부분의 테스트 시스템은 여러 복잡한 조절 프로세스에 의해 조절되는 내인성 마커를 사용하므로 직접 효과와 간접 효과를 구별하기 어렵습니다. 더욱이, 체외 검사 시스템은 포유류의 EDC 대사 및 약동학의 생리학적 복잡성이 부족합니다. 또한 환경 EDC에 대한 노출은 일반적으로 생체 내 생성 대사 산물을 포함한 여러 화합물의 혼합물을 포함하므로 상호 작용 가능성을 무시할 수 없습니다. 이러한 복잡성으로 인해 EDC 특성화가 어렵습니다. 갑상선 호르몬 작용 지표(THAI) 마우스는 TH 반응성 루시페라아제 리포터 시스템을 탑재한 형질전환 모델로, 조직 특이적 TH 작용을 평가할 수 있습니다. 조직 샘플에서 루시페라아제 리포터 발현을 정량화하여 국소 TH 작용에 대한 화학 물질의 조직 특이적 효과를 평가할 수 있습니다. 또한, 생체 내 이미징을 통해 THAI 마우스 모델은 살아있는 동물에서 잠재적인 EDC의 영향에 대한 종단 연구를 가능하게 합니다. 이 접근법은 동일한 동물에서 시간 경과에 따른 국소 TH 작용의 변화를 평가할 수 있으므로 장기 노출, 복잡한 처리 구조 또는 철수를 테스트하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 이 보고서는 타이항공 마우스의 생체 내 이미징 측정 과정을 설명합니다. 여기서 논의된 프로토콜은 대조군 역할을 할 수 있는 갑상선 기능 항진증 및 갑상선 기능 저하증 마우스를 개발하고 이미징하는 데 중점을 둡니다. 연구자들은 특정 요구 사항을 충족하기 위해 제시된 치료법을 조정하거나 확장할 수 있으며, 추가 연구를 위한 기본 접근 방식을 제공할 수 있습니다.

서문

갑상선 호르몬(TH) 신호전달은 세포 대사의 기본 조절자로, 성인기의 정상적인 발달과 최적의 조직 기능에 필수적입니다¹. 조직 내에서 TH 작용은 복잡한 분자 기계에 의해 미세하게 제어되어 국소 TH 수준의 조직 특이적 유지가 가능합니다. 순환하는 TH 수준에서 다른 조직의 자율성은 매우 중요합니다 ^2,3,4.

수많은 화학 물질이 내분비 기능을 방해할 가능성이 있으며 환경에서 오염 물질로 발견됩니다. 이러한 분자가 폐수 및 농업 생산을 통해 먹이 사슬에 들어가 가축과 인간의 건강에 영향을 미칠 수 있다는 우려가 커지고 있습니다 ^5,6,7.

이 문제를 해결하는 데 있어 중요한 과제 중 하나는 승인된 분자와 이미 금지되었지만 여전히 지속적으로 존재하는 분자를 포함하여 관련된 화합물의 순전한 수입니다. 최근 몇 년 동안 다양한 화학 물질의 파괴 가능성을 선별하고 식별하기 위한 테스트 시스템을 개발하기 위해 상당한 노력을 기울였습니다 8,9,10,11. 이러한 방법은 수천 가지 화합물의 고처리량 스크리닝과 잠재적 위협 식별에 탁월하지만, 이러한 분자의 특정 생체 내 효과에 대한 자세한 분석은 인체 노출의 위험을 확립하는 데 필수적입니다. 따라서 내분비계 교란 화학물질(EDC)을 연구하고 특성화할 때 다각적인 접근이 필요합니다.

TH 조절의 맥락에서 EDC 노출의 조직 특이적 결과를 이해하려면 국소 TH 작용을 정량화해야 합니다. 이러한 목적을 위해 여러 생체 내 모델이 개발되었지만, 대부분은 출력 측정으로 내인성 마커에 의존합니다. 생리학적임에도 불구하고 이러한 마커는 직간접적으로 수많은 조절 메커니즘의 영향을 받기 때문에 해석이 더 까다롭습니다. 그러므로, 조직 수준에서 TH 조절에 대한 EDC 효과를 특성화하는 것은 중요한 과제로 남아 있다^12,13.

조직 특이적 TH 신호 측정의 문제를 해결하기 위해 최근 갑상선 호르몬 작용 지표(THAI) 마우스 모델이 개발되었습니다. 이 모델을 사용하면 내인성 조건에서 국소 TH 작용의 변화를 구체적으로 정량화할 수 있습니다. 루시페라아제 전이유전자(lucifererase transgene)가 마우스 게놈(mouse genome)에 도입되었는데, 이는 TH 작용¹⁴에 의한 조절에 매우 민감합니다. 이 모델은 국소 조직 TH 신호 14,15,16,17,18의 변화를 정량화해야 하는 다양한 연구 질문에 답하는 데 효과적임을 입증했습니다.

THAI 모델의 잠재적 용도 중 하나는 TH 신호전달에 대한 EDC의 조직 특이적 효과를 특성화하는 것입니다. 이 모델은 최근 TH 신호전달에 대한 테트라브로모비스페놀 A와 디클라주릴의 조직 특이적 효과를 조사하는 데 성공적으로 사용되었다¹⁵. 여기에서는 TH 기능을 방해하는 EDC를 특성화하기 위한 테스트 시스템으로 THAI 모델의 생체 내 이미징 기술을 활용하기 위한 기본 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 루시페린-루시페라아제 반응의 생물 발광 특성을 활용합니다. 본질적으로, 형질전환으로 발현된 루시페라아제 효소는 투여된 루시페린의 산화를 촉매하여 조직 내 루시페라아제의 양에 비례하는 발광을 생성합니다(그림 1). 결과적으로, 측정된 생물학적 반응은 루시페라아제 활성이며, 이는 국소 TH 작용¹⁴의 적절한 측정으로 검증되었다. THAI 모델은 거의 모든 조직에서 TH 작용을 정량화하는 데 적용할 수 있지만, 생체 내 영상은 주로 소장(복부 영상)과 견갑골 간 갈색 지방 조직(BAT, 등쪽 영상)의 TH 작용에 중점을 둡니다¹⁴.

in vivo 이미징 기술의 중요한 장점은 측정을 위해 동물을 희생시킬 필요가 없다는 것입니다. 이를 통해 연구자는 종단 및 후속 실험을 자기 통제 연구로 설계하여 피험자 간 편향과 사용된 동물의 수를 줄일 수 있습니다. 이 측면은 EDC 특성화에서 특히 중요하며, 이 목적을 위한 분석법의 강도와 다양성은 이전에 입증되었습니다^14,15.

프로토콜

본 프로토콜은 실험 의학 연구소의 동물 복지 위원회에서 검토 및 승인되었습니다(PE/EA/1490-7/2017, PE/EA/106-2/2021). 제시된 데이터는 FVB/Ant 배경¹⁴, 3개월 된 수컷 타이 마우스(n=3-6/그룹)에서 얻은 것입니다. FVB/개미 배경 타이 동물은 피부에 색소가 많이 함유된 반점이 있어 측정이 왜곡될 수 있습니다. 따라서 털 제거 후 이미지 부위의 피부에 색소 반점을 찾으십시오. 동물은 실험에서 특별히 요구하지 않는 한 특별한 주거 조건(예: 특별한 식단)을 필요로 하지 않습니다.

1. 갑상선 기능 항진증 치료

참고: 생쥐의 갑상선 기능 항진증을 유도하기 위한 일반적인 프로토콜이 여기에 제공됩니다. ATA 가이드(¹⁹ )는 대안이 언급된 방법의 배경에 대한 상세한 설명을 제공한다.

1. T3(3,5,3'-트리요오드티로닌, 재료 표 참조)를 40mM NaOH에 용해시켜 5-10mg/mL 농도의 원액을 만듭니다.
2. 원액을 식염수로 희석하여 최종 농도 0.1μg/μL로 합니다.
3. 희석된 T3 용액을 체중(bwg) 그램당 10μL의 부피로 깨어 있는 동물에 복강내(ip)로 주입합니다. 24시간이 지나면 동물은 갑상선 기능 항진증으로 간주됩니다.
   참고: T3 치료는 다른 종류의 치료로 대체할 수 있습니다. 이 치료는 생체 내 이미징 프로토콜에 영향을 미치지 않습니다.

2. 갑상선 기능 저하증 치료

참고: 여기서는 마우스에서 갑상선 기능 저하증을 유도하기 위한 일반적인 프로토콜만 제공됩니다. ATA 가이드¹⁹ 에서는 대안이 언급된 방법의 배경에 대한 자세한 설명을 설명합니다.

1. 식단을 요오드가 없는 차우 식단으로 전환하고 식수(0.01% 메티마졸, 0.05% KClO₄)에 KClO₄와 메티마졸을 첨가하십시오(자료표 참조).
2. 메티마졸은 빛에 민감하고 빠르게 분해되기 때문에 정기적으로(2-3일마다) 음용액을 신선한 용액으로 교체하십시오.
3. 최소 2주, 최대 4주 동안 치료 요법을 유지하십시오. 동물은 체중이 줄어들고 불편함을 보일 것입니다. 동물이 거의 움직이지 않거나, 털이 많이 빠지거나, 의식이 거의 없는 경우, 인도적인 종점을 사용하여 어떤 방법으로든 제거하십시오(제도적으로 승인된 프로토콜에 따라).
4. 갑상선 기능 저하증의 회복 가능성을 방지하기 위해 다른 치료법과 병용할 경우 갑상선 기능 저하증 치료를 계속하십시오.

3. 생체 내 이미징

1. in vivo 이미징 시스템과 호환되는 소프트웨어를 시작합니다(재료 표 참조).
2. 로그인하고 "이미징 마법사" 패널이 로드될 때까지 기다립니다. 창의 왼쪽 하단에 있는 작은 패널입니다.
3. "이미징 마법사"의 "이미지 마법사 패널"에서 초기화 를 클릭하여 카메라 냉각을 시작합니다. 이렇게 하면 계측기가 설정 프로토콜을 실행하고 완료될 때까지 기다립니다. "이미징 마법사 패널"이 파란색으로 바뀌고 카메라 온도가 충분히 낮고 측량기가 준비되면 패널에 녹색 표시등이 켜집니다.
4. 가열 패드의 온도를 30-37°C로 설정하여 측정된 동물을 따뜻하게 유지합니다.
   알림: 카메라 온도가 최적이 될 때까지 기다리는 동안 프로토콜을 계속하십시오.
5. 악기 근처에 동물을 두거나 취급하지 마십시오. 기기 주변의 공기 중에 과도한 양의 머리카락이 순환하지 않도록 하십시오.
6. 케타민-자일라진 i.p. 주사로 1-3마리의 동물을 마취시킵니다(케타민 체중 50mg/kg, 자일라진 체중 10mg/kg, 자료표 참조). 또는 이소플루란 마취 시스템이 설치된 경우 기관에서 승인된 프로토콜에 따라 케타민-자일라진 혼합물을 대체하여 이소플루란 마취를 사용합니다.
   참고: 갑상선 기능 저하증 마우스는 케타민-자일라진에 더 민감합니다. 절반 복용량을 사용하십시오.
7. 마취 중에는 눈 보호 젤을 사용하십시오.
8. 발판을 꼬집어 페달 반사를 확인하십시오. 페달 반사는 수술용 평면 마취 상태를 확인하지 않습니다.
9. 마취 효과가 나면 가장 적합한 털 제거 방법(제모기, 면도, 크림 등)을 사용하여 촬영된 신체 부위의 털을 제거합니다. 발광광의 산란을 방지하기 위해 이미징된 신체 부위에 털이 남지 않도록 하십시오.
10. Na-루시페린( 재료 표 참조)을 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 15mg/mL 농도로 녹입니다. 루시페린은 빛에 민감합니다. 직사광선 노출을 피하십시오. 용액을 호박색 튜브에 보관하거나 알루미늄 호일로 싸십시오.
11. 면도한 동물을 루시페린 용액 10μL/bwg i.p.로 처리하십시오.
12. 패드에 '+'로 표시된 카메라의 중심점을 두고 동물을 악기에 넣습니다. 격자선을 확인하고 확실하지 않은 경우 단일 '사진' 캡처로 확인하여 적절한 배치를 확인하십시오.
13. 첫 번째 측정을 수행하기 전에 기판 투여 후 15분 동안 기다리십시오. 이 시간 동안 "이미지 마법사" 패널의 이미징 시간을 발광에 대해 3분으로 설정하고 사진 및 발광 확인란을 선택합니다. '사진'은 측정된 신호의 소스를 식별하기 위해 발광과 일치해야 합니다.
    참고: 최적의 기질 흡수 및 조직 분포를 위해 15분이 필요합니다. 발광 신호는 루시페린 투여 후 15-20분 후에 정체됩니다. 신호는 정체기 이후 서서히 감소하기 시작합니다.
14. "Imaging Wizard(이미징 마법사)" 패널에서 Measure(측정 )를 클릭하여 첫 번째 측정을 수행합니다.
15. 복부 및 등쪽 영상이 모두 수행되는 경우 첫 번째 촬영을 마친 직후 두 번째 신체 부위를 촬영할 수 있도록 동물을 재배열합니다.
16. 이미징이 완료되면 동물을 우리로 돌려보내고 다음 동물 세트로 실험을 계속합니다.
17. 동물이 회복할 수 있도록 허용하면 일반적으로 최대 1-2시간이 걸립니다. 회복을 촉진하기 위해 따뜻한 물이 담긴 튜브를 동물 근처에 놓고 호흡 및 관류와 같은 활력 징후를 모니터링하십시오.
18. 측정된 동물의 운명을 결정하십시오. 이 논문에 제시된 데이터에서, 측정된 동물은 체외 측정을 위해 제도적으로 승인된 프로토콜에 따라 안락사되었습니다. 그러나 이것은 필요하지 않습니다. 안락사나 후속 실험이 윤리적인지 고려한다.

4. 데이터 분석

1. 소프트웨어에서 "ClickInfo" 파일을 엽니다. 이미지 분석 및 편집을 위한 "도구 팔레트"라는 패널이 창 오른쪽에 열립니다.
2. 이미지의 왼쪽 상단 모서리에 있는 배율을 광도로 변환합니다.
3. "이미지 조정"을 클릭합니다.
4. 이미지의 최적 범주화 및 색상 스케일을 결정합니다. 모든 이미지가 동일한 설정을 사용하도록 합니다.
5. "도구 팔레트"에서 "ROI 도구" 를 클릭합니다.
6. "ROI 도구"에서 "Place ROI"를 클릭하여 관심 영역을 선택합니다. 동일한 크기의 ROI 또는 다른 크기의 ROI를 사용하는 것도 실험 설계에 따라 의미가 있을 수 있습니다.
7. "ROI 측정"을 클릭합니다. 배치된 ROI 데이터가 포함된 새 창이 열립니다. ctr + c-ctrl + v Windows 명령을 사용하여 데이터를 선택한 구성 또는 통계 소프트웨어로 내보냅니다.
8. 데이터는 총 플럭스 또는 평균 광도로 내보낼 수 있습니다. 현재 실험 설정에서 가장 관련성이 높은 변수를 선택합니다.
9. 실험 설계에 따라 데이터 분석을 계속합니다. (처리된 배경) 값을 "한 동물에서 측정된 효과"로 개별적으로 계산하는 것이 좋습니다.

결과

일반적으로 측정된 광도의 범위는 10⁵ 에서 10^{10 p} /s/cm²/sr입니다. 그러나 정확한 값은 동일한 이미지 내의 동물과 다른 이미지마다 다를 수 있습니다. 따라서 원시 데이터를 비교하는 것은 오해의 소지가 있을 수 있습니다. 모든 실험에서 제어 및 배경 신호를 설정하는 것이 중요하므로 자체 제어 설계를 적극 권장합니다.

토론

내분비계 교란 화학 물질(EDC)이 인체 건강에 미치는 위협은 잘 알려져 있습니다. 그러나 EDC에 대한 연구는 만만치 않은 도전에 직면해 있습니다. 이러한 문제는 부분적으로 내분비계의 복잡성의 결과입니다. 많은 EDC가 여러 내분비계를 동시에 교란시키는 것으로 확인되었다²². 또한, 갑상선 호르몬 (TH) 경제의 맥락에서, TH 작용을 조절하는 조직 특이적 차이로 인해 복잡성의 추가...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,5,3'-triiodothyronine (T3)	Merck	T2877
Animals, mice			THAI mouse
Eye protection gel	Oculotect		1000 IU/g
Falcon tube	Thermo Fisher Scientific		50 mL volume
Iodine-free chow diet	Research Diets	custom
IVIS Lumina II in vivo imaging system	Perkin Elmer	-
Ketamine	Vetcentre	E1857
Living Image software 4.5	Perkin Elmer	-	provided with the instrument
Measuring cylinder			250 mL
methimazole	Merck	M8506
Microfuge tubes	Eppendorf		For diluting treatment materials
NaClO4	Merck	71852
Na-luciferin, substrate	Goldbio	103404-75-7
NaOH	Merck	101052833
Phoshphate buffer saline	Chem Cruz	sc-362302
Pipette	Gilson		For diluting treatment materials
Pipette tips	Axygen		For diluting treatment materials
Shaving cream/epilator/shaver			Personal preference
Syringe	B Braun		1 mL volume
Syringe needle	B Braun		0.3 x 12 mm
Xylazine	Vetcentre	E1852