JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мышиная модель индикатора действия гормонов щитовидной железы была разработана для того, чтобы обеспечить тканеспецифическую количественную оценку локального действия гормонов щитовидной железы с использованием их эндогенного регуляторного механизма. Недавно было показано, что модель пригодна для характеристики химических веществ, разрушающих эндокринную систему, взаимодействующих с экономикой гормонов щитовидной железы, как по методам ex vivo , так и in vivo .

Аннотация

Гормоны щитовидной железы (ТГ) играют важнейшую роль в клеточном метаболизме и функции тканей. Экономика ТГ восприимчива к химическим веществам, разрушающим эндокринную систему (EDC), которые могут нарушить выработку или действие гормонов. Многие загрязнители окружающей среды являются EDC, представляя собой новую угрозу как для здоровья человека, так и для сельскохозяйственного производства. Это привело к увеличению спроса на надлежащие тестовые системы для изучения эффектов потенциальных EDC. Однако нынешние методологии сталкиваются с проблемами. В большинстве тест-систем используются эндогенные маркеры, регулируемые множественными, часто сложными регуляторными процессами, что затрудняет различение прямых и косвенных эффектов. Кроме того, тест-системы in vitro не обладают физиологической сложностью метаболизма и фармакокинетики EDC у млекопитающих. Кроме того, воздействие EDC окружающей среды обычно включает в себя смесь нескольких соединений, в том числе метаболитов, генерируемых in vivo , поэтому нельзя игнорировать возможность взаимодействий. Эта сложность затрудняет определение характеристик EDC. Мышь с индикатором действия гормонов щитовидной железы (THAI) представляет собой трансгенную модель, которая несет TH-чувствительную репортерную систему люциферазы, позволяющую оценить тканеспецифическое действие TH. Можно оценить тканеспецифическое влияние химических веществ на локальное действие ТГ путем количественной оценки экспрессии репортерной люциферазы в образцах тканей. Кроме того, с помощью визуализации in vivo модель мышей THAI позволяет проводить лонгитюдные исследования влияния потенциальных EDC на живых животных. Этот подход является мощным инструментом для тестирования длительного воздействия, сложных структур лечения или отмены, поскольку он позволяет оценить изменения местного действия ТГ с течением времени у одного и того же животного. В этом отчете описывается процесс визуализации in vivo на тайских мышах. Протокол, обсуждаемый здесь, фокусируется на разработке и визуализации мышей с гипер- и гипотиреозом, которые могут служить контрольными. Исследователи могут адаптировать или расширить представленные методы лечения в соответствии со своими конкретными потребностями, предлагая основополагающий подход для дальнейших исследований.

Введение

Передача сигналов гормонов щитовидной железы (ТГ) является фундаментальным регулятором клеточного метаболизма, необходимым для нормального развития и оптимального функционирования тканей во взрослом возрасте1. В тканях действие ТГ точно контролируется сложным молекулярным механизмом, позволяющим поддерживать локальные уровни ТГ в тканеспецифичных слоях. Эта автономия различных тканей от циркулирующих уровней ТГ имеет большое значение 2,3,4.

Многочисленные химические вещества могут нарушать эндокринные функции и обнаруживаются в окружающей среде в качестве загрязняющих веществ. Растущее беспокойство вызывает тот факт, что эти молекулы могут попадать в пищевую цепь через сточные воды и сельскохозяйственное производство, тем самым влияя на здоровье домашнего скота и людей 5,6,7.

Одной из существенных проблем в решении этой проблемы является огромное количество задействованных соединений, включая как разрешенные, так и уже запрещенные, но все еще постоянно присутствующие молекулы. В последние годы были предприняты значительные усилия по разработке тест-систем для скрининга и выявления разрушительного потенциала различных химических веществ 8,9,10,11. Несмотря на то, что эти методы превосходно справляются с высокопроизводительным скринингом тысяч соединений и выявлением потенциальных угроз, детальный анализ специфических эффектов in vivo этих молекул имеет важное значение для установления опасностей воздействия на человека. Таким образом, необходим многогранный подход при изучении и характеристике химических веществ, разрушающих эндокринную систему (EDC).

В контексте регуляции ТГ понимание тканеспецифичных последствий воздействия EDC требует количественной оценки локального действия ТГ. Несмотря на то, что для этой цели было разработано несколько моделей in vivo, большинство из них полагаются на эндогенные маркеры в качестве выходного показателя. Несмотря на то, что эти маркеры являются физиологическими, они подвержены многочисленным регуляторным механизмам, как прямым, так и косвенным, что затрудняет их интерпретацию. Таким образом, характеристика влияния EDC на регуляцию ТГ на тканевом уровне остается серьезной проблемой12,13.

Для решения проблем измерения тканеспецифической передачи сигналов ТГ недавно была разработана мышиная модель индикатора действия гормонов щитовидной железы (THAI). Эта модель позволяет провести специфическую количественную оценку изменений локального действия ТГ в эндогенных условиях. В геном мыши был введен трансген люциферазы, который очень чувствителен к регуляции действиемTH 14. Эта модель продемонстрировала эффективность в ответах на различные исследовательские вопросы, требующие количественной оценки изменений в локальной тканевой передаче сигналов ТГ 14,15,16,17,18.

Одним из потенциальных применений модели THAI является характеристика тканеспецифичных эффектов EDC на передачу сигналов TH. Недавно эта модель была успешно использована для исследования тканеспецифического влияния тетрабромбисфенола А и диклазурила на передачу сигналов TH15. Здесь представлены базовые протоколы для использования методов визуализации in vivo на модели THAI в качестве тестовой системы для определения характеристик EDC, нарушающих функцию TH. Этот метод использует биолюминесцентную природу реакции люциферин-люцифераза. По сути, трансгенно экспрессируемый фермент люцифераза катализирует окисление введенного люциферина, генерируя люминесцентный свет, пропорциональный количеству люциферазы в ткани (рис. 1). Следовательно, измеряемым биологическим ответом является активность люциферазы, которая была валидирована в качестве подходящей меры локального действия ТГ14. В то время как модель THAI применима для количественной оценки действия ТГ практически во всех тканях, визуализация in vivo в первую очередь фокусируется на действии ТГ в тонкой кишке (вентральная визуализация) и межлопаточной коричневой жировой ткани (BAT, дорсальная визуализация)14.

Существенным преимуществом метода визуализации in vivo является то, что он избавляет от необходимости жертвовать животными для измерений. Это позволяет исследователям разрабатывать длительные и последующие эксперименты в виде самоконтролируемых исследований, уменьшая систематическую ошибку между испытуемыми и количество используемых животных. Этот аспект особенно важен при определении характеристик EDC, и ранее были продемонстрированы сила и универсальность метода для этой цели14,15.

протокол

Настоящий протокол был рассмотрен и одобрен Комитетом по благополучию животных Института экспериментальной медицины (PE/EA/1490-7/2017, PE/EA/106-2/2021). Представленные данные получены от14-месячных самцов тайских мышей FVB/муравьев (n = 3-6/группа). Тайские животные, как правило, имеют сильно пигментированные пятна на коже, которые могут искажать измерения. Следовательно, ищите пигментные пятна на коже изображенного участка после удаления шерсти. Животные не нуждаются в особых условиях содержания, если этого специально не требует эксперимент (например, особый рацион).

1. Лечение гипертиреоидной железы

ПРИМЕЧАНИЕ: Общий протокол индуцирования гипертиреоза у мышей представлен здесь. В руководствеATA 19 содержатся подробные пояснения о методах с упомянутыми альтернативами.

  1. Растворяют Т3 (3,5,3'-трийодтиронин, см. таблицу материалов) в 40 мМ NaOH для получения исходного раствора с концентрацией 5-10 мг/мл.
  2. Разбавьте исходный раствор физиологическим раствором до конечной концентрации 0,1 мкг/мкл.
  3. Разбавленный раствор Т3 вводят внутрибрюшинно (в/в) бодрствующим животным в объеме 10 мкл на грамм массы тела (мкг). Через 24 ч животные будут считаться гипертиреоидными.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение Т3 может быть заменено любым другим видом лечения. Лечение не влияет на протокол визуализации in vivo .

2. Лечение гипотиреоза

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь представлен только общий протокол индуцирования гипотиреоза у мышей. В руководствеATA 19 приводятся подробные пояснения к методам с упомянутыми альтернативами.

  1. Переведите диету на безйодную диету и добавьте в питьевую воду KClO4 и метимазол (0,01 % метимазол, 0,05 % KClO4) (см. таблицу материалов).
  2. Регулярно (каждые 2-3 дня) заменяйте питьевой раствор свежим питьевым, потому что метимазол чувствителен к свету и быстро разлагается.
  3. Выдерживать режим лечения не менее 2 недель, не более 4 недель. Животные будут худеть и будут проявлять дискомфорт. Если животные с трудом передвигаются, потеряли большую часть шерсти или находятся в полубессознательном состоянии, используйте гуманную конечную точку и уничтожайте их любым способом (в соответствии с утвержденными протоколами).
  4. Продолжайте лечение гипотиреоза в сочетании с другими методами лечения, чтобы предотвратить потенциальное выздоровление от гипотиреоза.

3. Визуализация in vivo

  1. Запустите программное обеспечение, совместимое с системой визуализации in vivo (см. Таблицу материалов).
  2. Войдите в систему и дождитесь загрузки панели "Imaging Wizard". Это панель меньшего размера в левом нижнем углу окна.
  3. В «Мастере создания изображений» запустите охлаждение камеры, нажав « Инициализация » на панели «Мастер изображений». Это заставит прибор запустить протокол настройки, дождаться его завершения. Панель «Мастер обработки изображений» загорится синим цветом, а когда температура камеры станет достаточно низкой и прибор будет готов, на панели загорится зеленый индикатор.
  4. Установите температуру грелки на 30-37 °C, чтобы измеряемые животные оставались в тепле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте работу с протоколом, ожидая, пока температура камеры станет оптимальной.
  5. Не держите и не лечите животных рядом с инструментом. Избегайте чрезмерного количества волос, циркулирующих в воздухе вокруг инструмента.
  6. Обезболивают 1-3 животных инъекцией кетамина-ксилазина в/в (кетамин 50 мг/кг массы тела, ксилазин 10 мг/кг массы тела, см. таблицу материалов). В качестве альтернативы, если установлена анестезирующая система изофлурана, следуйте утвержденным протоколам для использования анестезии изофлураном, заменяя смесь кетамина и ксилазина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши с гипотиреозом более чувствительны к кетамин-ксилазину; Употребляйте половинную дозу.
  7. Используйте защитный гель для глаз во время анестезии.
  8. Проверьте рефлекс педали, зажав подушечки лап. Отсутствие педального рефлекса подтверждает состояние анестезии хирургической плоскости.
  9. После того, как анестезия подействует, удалите шерсть с изображенных частей тела, используя наиболее подходящий метод удаления шерсти (эпилятор, бритье, крем и т.д.). Убедитесь, что на изображенных частях тела не осталось шерсти, чтобы предотвратить рассеивание люминесцентного света.
  10. Растворите Na-люциферин (см. таблицу материалов) в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS) в концентрации 15 мг/мл. Люциферин чувствителен к свету; Избегайте прямого воздействия солнечных лучей. Хранят раствор в янтарных тюбиках или заворачивают в алюминиевую фольгу.
  11. Обработать бритых животных раствором люциферина в дозе 10 мкл/бвг в/в.
  12. Поместите животных в прибор так, чтобы центральная точка камеры была отмечена знаком «+» на подушечке. Убедитесь в правильном размещении, проверив линии сетки и подтвердив это одним снимком «Фото», если вы не уверены.
  13. Подождите 15 минут после введения субстрата, прежде чем делать первое измерение. В течение этого времени установите время изображения на панели «Мастер изображений» на 3 минуты для люминесценции и установите флажки для Фото и Люминесценция. «Фото» необходимо совпадать с люминесценцией для идентификации источника измеряемого сигнала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: для оптимального поглощения субстрата и распределения тканей требуется 15 минут. Люминесцентный сигнал выходит на плато через 15-20 мин после введения люциферина. Сигнал начинает медленно снижаться после плато.
  14. Сделайте первое измерение, нажав на кнопку Measure (Измерить ) на панели "Imaging Wizard" (Мастер визуализации).
  15. Если выполняется как вентральная, так и дорсальная визуализация, переставьте животных так, чтобы вторая часть тела была сфотографирована сразу после завершения первой.
  16. После того, как визуализация будет сделана, верните животных в клетки и продолжите эксперимент со следующей группой животных.
  17. Дайте животным восстановиться, что обычно занимает не более 1-2 часов. Поставьте рядом с животными трубку, наполненную теплой водой, чтобы облегчить выздоровление, и следите за жизненно важными показателями, такими как дыхание и перфузия.
  18. Решайте судьбу измеряемых животных. Согласно данным, представленным в этой статье, измеренные животные были подвергнуты эвтаназии в соответствии с утвержденными институтами протоколами измерений ex vivo . Однако в этом нет необходимости. Подумайте, этична ли эвтаназия или последующие эксперименты.

4. Анализ данных

  1. Откройте файл "ClickInfo" в программном обеспечении. В правой части окна откроется панель под названием «Палитра инструментов» для анализа и редактирования изображений.
  2. Преобразуйте масштаб в сияние в левом верхнем углу изображения.
  3. Нажмите на «Настройка изображения».
  4. Определитесь с оптимальным биннингом и цветовой гаммой изображений. Сделайте так, чтобы все изображения использовали одни и те же настройки.
  5. Нажмите на «Инструменты ROI» на «Палитре инструментов».
  6. Выберите интересующие области, нажав на «Разместить ROI» в разделе «Инструменты ROI». Использование одного и того же или разного размера ROI также может иметь смысл в зависимости от плана эксперимента.
  7. Нажмите «Измерить ROI». Откроется новое окно с данными о размещенных ROI. Экспортируйте данные с помощью команды ctr + c-ctrl + v Windows в любое программное обеспечение для организации или статистики.
  8. Данные могут быть экспортированы в виде общего потока или среднего излучения. Выберите, какая переменная является наиболее актуальной в текущих экспериментальных условиях.
  9. Продолжить анализ данных в соответствии с планом эксперимента. Рекомендуется индивидуальный расчет (обработанных фоновых) значений как «измеренного эффекта у одного животного».

Результаты

Как правило, измеренное излучение колеблется от 105 до 1010 /с/см2/ср. Однако точные значения могут варьироваться у разных животных на одном и том же изображении и на разных изображениях. Таким образом, сравнение необработанных данных может ввести в заблу?...

Обсуждение

Угрозы, представляемые химическими веществами, разрушающими эндокринную систему (EDC) для здоровья человека, хорошо известны; тем не менее, исследования EDC сталкиваются с серьезными проблемами. Эти проблемы частично являются следствием сложности эндокринной системы. Было выявлено, что ?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана проектом No. Проект RRF-2.3.1-21-2022-00011 под названием «Национальная лаборатория трансляционной нейронауки» был реализован при поддержке Фонда восстановления и устойчивости Европейского Союза в рамках Программы Сечени Plan Plus.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
3,5,3'-triiodothyronine (T3)MerckT2877
Animals, miceTHAI mouse
Eye protection gelOculotect1000 IU/g
Falcon tubeThermo Fisher Scientific50 mL volume
Iodine-free chow dietResearch Dietscustom
IVIS Lumina II in vivo imaging systemPerkin Elmer-
KetamineVetcentreE1857
Living Image software 4.5Perkin Elmer-provided with the instrument
Measuring cylinder250 mL
methimazoleMerckM8506
Microfuge tubesEppendorfFor diluting treatment materials
NaClO4Merck71852
Na-luciferin, substrateGoldbio103404-75-7
NaOHMerck101052833
Phoshphate buffer salineChem Cruzsc-362302
PipetteGilsonFor diluting treatment materials
Pipette tipsAxygenFor diluting treatment materials
Shaving cream/epilator/shaverPersonal preference
SyringeB Braun1 mL volume
Syringe needleB Braun0.3 x 12 mm
XylazineVetcentreE1852

Ссылки

  1. Larsen, P. R., Davies, T. F., Hay, I. D., Wilson, J. D., Foster, D. W., Kronenberg, H. M., Larsen, P. R. . Williams Textbook of Endocrinology. , 389-515 (1998).
  2. Gereben, B., et al. Cellular and molecular basis of deiodinase-regulated thyroid hormone signaling. Endocr Rev. 29 (7), 898-938 (2008).
  3. Fekete, C., Lechan, R. M. Central regulation of hypothalamic-pituitary-thyroid axis under physiological and pathophysiological conditions. Endocr Rev. 35 (2), 159-194 (2014).
  4. Bianco, A. C., et al. Paradigms of Dynamic Control of Thyroid Hormone Signaling. Endocr Rev. 40 (4), 1000-1047 (2019).
  5. Zoeller, R. T. Endocrine disrupting chemicals and thyroid hormone action. Adv Pharmacol. 92, 401-417 (2021).
  6. Guarnotta, V., Amodei, R., Frasca, F., Aversa, A., Giordano, C. Impact of chemical endocrine disruptors and hormone modulators on the endocrine system. Int J Mol Sci. 23 (10), 5710 (2022).
  7. La Merrill, M. A., et al. Consensus on the key characteristics of endocrine-disrupting chemicals as a basis for hazard identification. Nat Rev Endocrinol. 16 (1), 45-57 (2020).
  8. Fini, J. B., et al. An in vivo multiwell-based fluorescent screen for monitoring vertebrate thyroid hormone disruption. Environ Sci Technol. 41 (16), 5908-5914 (2007).
  9. Mughal, B. B., Fini, J. B., Demeneix, B. A. Thyroid-disrupting chemicals and brain development: an update. Endocr Connect. 7 (4), 160-186 (2018).
  10. Dong, M., Li, Y., Zhu, M., Li, J., Qin, Z. Tetrabromobisphenol a disturbs brain development in both thyroid hormone-dependent and -independent manners in xenopus laevis. Molecules. 27 (1), 249 (2021).
  11. Beck, K. R., Sommer, T. J., Schuster, D., Odermatt, A. Evaluation of tetrabromobisphenol A effects on human glucocorticoid and androgen receptors: A comparison of results from human- with yeast-based in vitro assays. Toxicology. 370, 70-77 (2016).
  12. Li, J., Li, Y., Zhu, M., Song, S., Qin, Z. A multiwell-based assay for screening thyroid hormone signaling disruptors using thibz expression as a sensitive endpoint in xenopus laevis. Molecules. 27 (3), 798 (2022).
  13. Myosho, T., et al. Preself-feeding medaka fry provides a suitable screening system for in vivo assessment of thyroid hormone-disrupting potential. Environ Sci Technol. 56 (10), 6479-6490 (2022).
  14. Mohacsik, P., et al. A Transgenic mouse model for detection of tissue-specific thyroid hormone action. Endocrinology. 159 (2), 1159-1171 (2018).
  15. Sinko, R., et al. Tetrabromobisphenol A and diclazuril evoke tissue-specific changes of thyroid hormone signaling in male thyroid hormone action indicator Mice. Int J Mol Sci. 23 (23), 14782 (2022).
  16. Sinko, R., et al. Different hypothalamic mechanisms control decreased circulating thyroid hormone levels in infection and fasting-induced non-thyroidal illness syndrome in male thyroid hormone action indicator mice. Thyroid. 33 (1), 109-118 (2023).
  17. Salas-Lucia, F., et al. Axonal T3 uptake and transport can trigger thyroid hormone signaling in the brain. Elife. 12, 82683 (2023).
  18. Liu, S., et al. Triiodothyronine (T3) promotes brown fat hyperplasia via thyroid hormone receptor alpha mediated adipocyte progenitor cell proliferation. Nat Commun. 13 (1), 3394 (2022).
  19. Bianco, A. C., et al. American thyroid association guide to investigating thyroid hormone economy and action in rodent and cell models. Thyroid. 24 (1), 88-168 (2014).
  20. Silva, J. E., Larsen, P. R. Adrenergic activation of triiodothyronine production in brown adipose tissue. Nature. 305 (5936), 712-713 (1983).
  21. Bianco, A. C., Silva, J. E. Intracellular conversion of thyroxine to triiodothyronine is required for the optimal thermogenic function of brown adipose tissue. J Clin Invest. 79 (1), 295-300 (1987).
  22. Caporale, N., et al. From cohorts to molecules: Adverse impacts of endocrine disrupting mixtures. Science. 375 (6582), 8244 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

200THin vitroEDCTHAIin vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены