Caracterização in vivo dos efeitos químicos desreguladores endócrinos via camundongo indicador de ação do hormônio tireoidiano

Resumo

O modelo de camundongo Thyroid Hormone Action Indicator foi desenvolvido para permitir a quantificação tecido-específica da ação local do hormônio tireoidiano usando sua maquinaria regulatória endógena. Recentemente, tem sido demonstrado que o modelo é adequado para caracterizar substâncias químicas desreguladoras do sistema endócrino que interagem com a economia dos hormônios tireoidianos, tanto por metodologias ex vivo quanto in vivo .

Resumo

Os hormônios tireoidianos (HT) desempenham um papel crítico no metabolismo celular e na função tecidual. A economia de HT é suscetível a produtos químicos desreguladores endócrinos (EDCs) que podem perturbar a produção ou ação hormonal. Muitos poluentes ambientais são EDCs, representando uma ameaça emergente tanto para a saúde humana quanto para a produção agrícola. Isso levou a um aumento da demanda por sistemas de teste adequados para examinar os efeitos de potenciais EDCs. No entanto, as metodologias atuais enfrentam desafios. A maioria dos sistemas de teste utiliza marcadores endógenos regulados por múltiplos processos regulatórios, muitas vezes complexos, dificultando a distinção entre efeitos diretos e indiretos. Além disso, os sistemas de teste in vitro carecem da complexidade fisiológica do metabolismo e da farmacocinética do EDC em mamíferos. Além disso, a exposição a EDCs ambientais geralmente envolve uma mistura de múltiplos compostos, incluindo metabólitos gerados in vivo , de modo que a possibilidade de interações não pode ser ignorada. Essa complexidade dificulta a caracterização do EDC. O camundongo Thyroid Hormone Action Indicator (THAI) é um modelo transgênico que carrega um sistema repórter de luciferase responsivo ao HT, permitindo a avaliação da ação tecido-específica do HT. Pode-se avaliar os efeitos tecido-específicos de substâncias químicas sobre a ação local do HT quantificando a expressão da luciferase em amostras de tecido. Além disso, com imagens in vivo , o modelo de camundongo THAI permite estudos longitudinais sobre os efeitos de potenciais EDCs em animais vivos. Essa abordagem fornece uma ferramenta poderosa para testar exposição a longo prazo, estruturas complexas de tratamento ou abstinência, pois permite a avaliação de mudanças na ação local do HT ao longo do tempo no mesmo animal. Este relato descreve o processo de medidas de imagem in vivo em camundongos THAI. O protocolo discutido aqui se concentra no desenvolvimento e na imagem de camundongos hiper e hipotireoideos, que podem servir como controles. Os pesquisadores podem adaptar ou expandir os tratamentos apresentados para atender às suas necessidades específicas, oferecendo uma abordagem fundamental para futuras investigações.

Introdução

A sinalização do hormônio tireoidiano (HT) é um regulador fundamental do metabolismo celular, essencial para o desenvolvimento normal e ótima função tecidual na idade adulta¹. Dentro dos tecidos, a ação dos HT é finamente controlada por uma complexa maquinaria molecular, permitindo a manutenção tecido-específica dos níveis locais de HT. Essa autonomia dos diferentes tecidos em relação aos níveis de HT circulantes é de grande importância ^2,3,4.

Numerosos produtos químicos têm o potencial de interromper as funções endócrinas e são encontrados no ambiente como poluentes. É uma preocupação crescente que essas moléculas possam entrar na cadeia alimentar por meio de águas residuárias e da produção agrícola, impactando a saúde do gado e do ser humano ^5,6,7.

Um dos desafios significativos na abordagem dessa questão é o grande número de compostos envolvidos, incluindo moléculas autorizadas e já proibidas, mas ainda persistentemente presentes. Nos últimos anos, esforços substanciais têm sido feitos para desenvolver sistemas de teste para triagem e identificação do potencial disruptivo de vários produtos químicos 8,9,10,11. Embora esses métodos se destaquem na triagem de alto rendimento de milhares de compostos e na identificação de ameaças potenciais, uma análise detalhada dos efeitos in vivo específicos dessas moléculas é essencial para estabelecer os perigos da exposição humana. Assim, uma abordagem multifacetada é necessária ao estudar e caracterizar produtos químicos desreguladores endócrinos (EDCs).

No contexto da regulação do HT, a compreensão das consequências tecido-específicas da exposição ao EDC requer a quantificação da ação local do HT. Embora vários modelos in vivo tenham sido desenvolvidos para esse fim, a maioria utiliza marcadores endógenos como medida de saída. Apesar de fisiológicos, esses marcadores estão sujeitos a inúmeros mecanismos regulatórios, diretos e indiretos, tornando sua interpretação mais desafiadora. Portanto, caracterizar os efeitos da EDC na regulação dos HT em nível tecidual permanece um desafio significativo^12,13.

Para enfrentar os desafios de medir a sinalização de HT tecido-específica, o modelo de camundongo Thyroid Hormone Action Indicator (THAI) foi recentemente desenvolvido. Este modelo permite quantificar especificamente as mudanças na ação local dos HT em condições endógenas. Um transgene da luciferase foi introduzido no genoma de camundongos, que é altamente sensível à regulação pela ação do HT¹⁴. Esse modelo tem demonstrado efetividade em responder a diversas questões de pesquisa que requerem a quantificação de alterações na sinalização tecidual local dos HT14,15,16,17,18.

O reconhecimento de um uso potencial do modelo THAI é caracterizar os efeitos tecido-específicos dos EDCs na sinalização de HT. Recentemente, o modelo foi empregado com sucesso para investigar os efeitos tecido-específicos do tetrabromobisfenol A e do diclazuril na sinalização de HT¹⁵. Aqui, protocolos basais são apresentados para a utilização de técnicas de imagem in vivo no modelo THAI como um sistema de teste para caracterizar EDCs que interrompem a função do HT. Este método aproveita a natureza bioluminescente da reação luciferina-luciferase. Essencialmente, a enzima luciferase transgenicamente expressa catalisa a oxidação da luciferina administrada, gerando luz luminescente proporcional à quantidade de luciferase no tecido (Figura 1). Consequentemente, a resposta biológica medida é a atividade da luciferase, que foi validada como uma medida adequada da ação local da HT¹⁴. Enquanto o modelo THAI é aplicável para quantificar a ação dos HT em praticamente todos os tecidos, os exames de imagem in vivo concentram-se principalmente na ação dos HT no intestino delgado (imagem ventral) e no tecido adiposo marrom interescapular (BAT, imagem dorsal)¹⁴.

Uma vantagem significativa da técnica de imagem in vivo é que ela elimina a necessidade de sacrificar animais para medições. Isso permite que os pesquisadores projetem experimentos longitudinais e de acompanhamento como estudos autocontrolados, reduzindo o viés entre os sujeitos e o número de animais utilizados. Esse aspecto é particularmente crucial na caracterização do EDC, e a resistência e a versatilidade do método para esse fim já foram demonstradas^{anteriormente 14,15}.

Protocolo

O presente protocolo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Bem-Estar Animal do Instituto de Medicina Experimental (PE/EA/1490-7/2017, PE/EA/106-2/2021). Os dados apresentados são de FVB/Ant background¹⁴, camundongos THAI machos de 3 meses de idade (n = 3-6/grupo). FVB/Formiga fundo THAI animais tendem a ter manchas altamente pigmentadas em sua pele que podem distorcer as medidas. Assim, procure manchas pigmentadas na pele da área da imagem após a remoção dos pelos. Os animais não necessitam de condições especiais de alojamento, a menos que a experiência o exija especificamente (por exemplo, uma dieta especial).

1. Tratamento do hipertireoidismo

NOTA: Um protocolo geral para induzir hipertireoidismo em camundongos é fornecido aqui. O guia ATA¹⁹ oferece explicações detalhadas sobre os antecedentes dos métodos com as alternativas mencionadas.

1. Dissolver T3 (3,5,3'-triiodotironina, ver Tabela de Materiais) em NaOH 40 mM para criar uma solução-mãe com uma concentração entre 5-10 mg/mL.
2. Diluir a solução-mãe com soro fisiológico até uma concentração final de 0,1 μg/μL.
3. Injetar a solução diluída de T3 por via intraperitoneal (i.p.) em animais acordados a um volume de 10 μL por grama de peso corporal (bwg). Após 24 h, os animais serão considerados hipertireoideos.
   NOTA: O tratamento T3 pode ser substituído por qualquer outro tipo de tratamento. O tratamento não afeta o protocolo de imagem in vivo .

2. Tratamento do hipotireoidismo

NOTA: Aqui, apenas um protocolo geral para induzir hipotireoidismo em camundongos é fornecido. O guia ATA¹⁹ descreve explicações detalhadas sobre os antecedentes dos métodos com as alternativas mencionadas.

1. Mude a dieta para uma dieta de ração isenta de iodo e adicione KClO₄ e metimazol à água potável (0,01 % metimazol, 0,05 % KClO₄) (ver Tabela de Materiais).
2. Substitua a solução de beber regularmente (a cada 2-3 dias) por uma solução de beber fresca porque o metimazol é sensível à luz e degrada-se rapidamente.
3. Mantenha o regime de tratamento por pelo menos 2 semanas, não mais do que 4 semanas. Os animais perderão peso e apresentarão desconforto. Se os animais mal se movimentam, perderam grande parte dos pelos ou mal estão conscientes, use um ponto final humano e termine-os por qualquer método (seguindo protocolos aprovados institucionalmente).
4. Continuar o tratamento do hipotireoidismo quando combinado com outros tratamentos para prevenir a recuperação potencial do hipotireoidismo.

3. Imagem in vivo

1. Inicie o software compatível com o sistema de imagem in vivo (consulte a Tabela de Materiais).
2. Faça login e aguarde o carregamento do painel "Assistente de geração de imagens". É um painel menor na parte inferior esquerda da janela.
3. No "Assistente de imagem", inicie o resfriamento da câmera clicando em Inicializar no painel "Assistente de imagem". Isso faz com que o instrumento execute um protocolo de instalação, aguarde até que ele seja concluído. O "painel do Assistente de Imagem" fica azul e uma luz verde se acende no painel quando a temperatura da câmera estiver baixa o suficiente e o instrumento estiver pronto.
4. Ajuste a temperatura da almofada de aquecimento para 30-37 °C para manter os animais medidos aquecidos.
   NOTA: Continue com o protocolo enquanto aguarda que a temperatura da câmera seja ideal.
5. Não mantenha ou trate animais perto do instrumento. Evite quantidades excessivas de pelos circulando no ar ao redor do instrumento.
6. Anestesiar 1-3 animais com injeção i.p. de ketamina-xilazina (cetamina 50 mg/kg de peso corporal, xilazina 10 mg/kg de peso corporal, ver Tabela de Materiais). Alternativamente, se um sistema anestésico com isoflurano estiver instalado, siga protocolos aprovados institucionalmente para usar anestesia com isoflurano, substituindo a mistura de ketamina e xilazina.
   NOTA: Camundongos com hipotireoidismo são mais sensíveis à ketamina-xilazina; usar meia dose.
7. Use gel de proteção ocular durante a anestesia.
8. Verifique o reflexo do pedal apertando as almofadas dos pés. Nenhum reflexo pedioso confirma o estado de anestesia no plano cirúrgico.
9. Depois que a anestesia fizer efeito, remova os pelos das partes do corpo fotografadas usando o método de remoção de pelos mais adequado (depilador, barbear, creme, etc.). Certifique-se de que nenhum pelo seja deixado nas partes do corpo fotografadas para evitar a dispersão da luz luminescente.
10. Dissolver a Na-luciferina (ver Tabela de Materiais) em 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de 15 mg/mL. Luciferina é sensível à luz; Evite a exposição direta à luz. Armazenar a solução em tubos de âmbar ou envolvê-lo em papel alumínio.
11. Tratar animais barbeados com solução de luciferina 10 μL/bwg i.p.
12. Coloque os animais no instrumento com o ponto central da câmera marcado como '+' na almofada. Garanta o posicionamento adequado verificando as linhas de grade e confirmando com uma única captura de 'Foto' se não tiver certeza.
13. Aguarde 15 min após a administração do substrato antes de fazer a primeira medição. Durante esse tempo, defina o tempo de imagem no painel "Assistente de imagem" para 3 min para luminescência e marque as caixas para Foto e Luminescência. A 'foto' é necessária para coincidir com a luminescência para identificar a fonte do sinal medido.
    NOTA: 15 min são necessários para a absorção ideal do substrato e distribuição do tecido. O sinal luminescente platôs 15-20 min após a administração de luciferina. O sinal começa a diminuir lentamente após o platô.
14. Faça a primeira medição clicando em Medir no painel "Assistente de imagem".
15. Se ambas as imagens ventral e dorsal forem realizadas, reorganize os animais para que a segunda parte do corpo seja fotografada imediatamente após a conclusão da primeira.
16. Após a realização das imagens, devolva os animais às suas gaiolas e continue o experimento com o próximo conjunto de animais.
17. Permita que os animais se recuperem, o que normalmente leva 1-2 h no máximo. Coloque um tubo cheio de água morna perto dos animais para facilitar a recuperação e monitore sinais vitais, como respiração e perfusão.
18. Decida o destino dos animais medidos. Nos dados apresentados neste artigo, os animais medidos foram eutanasiados seguindo protocolos aprovados institucionalmente para medições ex vivo . No entanto, isso não é necessário. Considere se a eutanásia ou as experiências de acompanhamento são éticas.

4. Análise dos dados

1. Abra o arquivo "ClickInfo" no software. Um painel chamado "Tool Palette" para análise e edição de imagens será aberto no lado direito da janela.
2. Converter escala em brilho no canto superior esquerdo da imagem.
3. Clique em "Ajuste de imagem".
4. Decida sobre o binning ideal e a escala de cores das imagens. Faça com que todas as imagens utilizem as mesmas configurações.
5. Clique em "Ferramentas de ROI" na "Paleta de ferramentas".
6. Selecione as áreas de interesse clicando em "Colocar ROI" nas "Ferramentas de ROI". Usar ROIs de mesmo tamanho ou ROIs de tamanhos diferentes também pode ser significativo, dependendo do desenho experimental.
7. Clique em "Medir ROIs". Uma nova janela será aberta com os dados dos ROIs colocados. Exporte os dados com o comando ctr + c-ctrl + v Windows para um software organizador ou estatístico de sua escolha.
8. Os dados podem ser exportados como fluxo total ou radiância média. Escolha qual variável é a mais relevante no cenário experimental atual.
9. Continuar a análise dos dados de acordo com o delineamento experimental. Recomenda-se o cálculo individual dos valores (fundo tratado) como "efeito medido em um animal".

Resultados

Geralmente, a radiância medida varia de magnitudes de 10⁵ a^{10 10} p/s/cm²/sr. No entanto, os valores exatos podem variar entre animais dentro da mesma imagem e entre imagens diferentes. Portanto, comparar dados brutos pode ser enganoso. É crucial estabelecer sinais de controle e de fundo em todos os experimentos, tornando os projetos autocontrolados altamente recomendados.

A...

Discussão

As ameaças representadas pelos produtos químicos desreguladores endócrinos (EDCs) para a saúde humana são bem reconhecidas; no entanto, a investigação sobre os EDC enfrenta desafios formidáveis. Esses desafios são, em parte, consequência da complexidade do sistema endócrino. Muitos EDCs foram identificados como perturbadores simultâneos de múltiplos sistemas endócrinos²². Além disso, no contexto da economia do hormônio tireoidiano (HT), existe uma camada adicional de complexidade d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,5,3'-triiodothyronine (T3)	Merck	T2877
Animals, mice			THAI mouse
Eye protection gel	Oculotect		1000 IU/g
Falcon tube	Thermo Fisher Scientific		50 mL volume
Iodine-free chow diet	Research Diets	custom
IVIS Lumina II in vivo imaging system	Perkin Elmer	-
Ketamine	Vetcentre	E1857
Living Image software 4.5	Perkin Elmer	-	provided with the instrument
Measuring cylinder			250 mL
methimazole	Merck	M8506
Microfuge tubes	Eppendorf		For diluting treatment materials
NaClO4	Merck	71852
Na-luciferin, substrate	Goldbio	103404-75-7
NaOH	Merck	101052833
Phoshphate buffer saline	Chem Cruz	sc-362302
Pipette	Gilson		For diluting treatment materials
Pipette tips	Axygen		For diluting treatment materials
Shaving cream/epilator/shaver			Personal preference
Syringe	B Braun		1 mL volume
Syringe needle	B Braun		0.3 x 12 mm
Xylazine	Vetcentre	E1852