Caractérisation in vivo des effets chimiques perturbateurs endocriniens via une souris indicatrice d’action des hormones thyroïdiennes

Résumé

Le modèle murin Thyroid Hormone Action Indicator a été développé pour permettre la quantification tissulaire spécifique de l’action locale des hormones thyroïdiennes à l’aide de sa machinerie de régulation endogène. Récemment, il a été démontré que le modèle est adapté à la caractérisation des produits chimiques perturbateurs endocriniens interagissant avec l’économie des hormones thyroïdiennes, à la fois par des méthodologies ex vivo et in vivo .

Résumé

Les hormones thyroïdiennes (TH) jouent un rôle essentiel dans le métabolisme cellulaire et la fonction des tissus. L’économie des TH est sensible aux perturbateurs endocriniens (PE) qui peuvent perturber la production ou l’action hormonale. De nombreux polluants environnementaux sont des perturbateurs endocriniens, ce qui représente une menace émergente pour la santé humaine et la production agricole. Cela a entraîné une demande accrue de systèmes d’essai appropriés pour examiner les effets des perturbateurs endocriniens potentiels. Cependant, les méthodologies actuelles se heurtent à des défis. La plupart des systèmes de test utilisent des marqueurs endogènes régulés par de multiples processus de réglementation, souvent complexes, ce qui rend difficile la distinction des effets directs et indirects. De plus, les systèmes d’essai in vitro n’ont pas la complexité physiologique du métabolisme et de la pharmacocinétique des perturbateurs endocriniens chez les mammifères. De plus, l’exposition aux perturbateurs endocriniens environnementaux implique généralement un mélange de plusieurs composés, y compris des métabolites générés in vivo , de sorte que la possibilité d’interactions ne peut être ignorée. Cette complexité rend difficile la caractérisation des perturbateurs endocriniens. La souris THAI (Thyroid Hormone Action Indicator) est un modèle transgénique qui porte un système rapporteur de luciférase sensible à la TH, permettant d’évaluer l’action de la TH spécifique aux tissus. On peut évaluer les effets spécifiques des produits chimiques sur l’action locale de la TH en quantifiant l’expression du rapporteur de la luciférase dans des échantillons de tissus. De plus, grâce à l’imagerie in vivo , le modèle murin THAI permet des études longitudinales sur les effets des PE potentiels chez les animaux vivants. Cette approche fournit un outil puissant pour tester l’exposition à long terme, les structures de traitement complexes ou le retrait, car elle permet d’évaluer les changements dans l’action locale des TH au fil du temps chez le même animal. Ce rapport décrit le processus de mesures d’imagerie in vivo sur des souris THAI. Le protocole discuté ici se concentre sur le développement et l’imagerie de souris hyperthyroïdiennes et hypothyroïdiennes, qui peuvent servir de témoins. Les chercheurs peuvent adapter ou élargir les traitements présentés pour répondre à leurs besoins spécifiques, offrant ainsi une approche fondamentale pour une recherche plus approfondie.

Introduction

La signalisation des hormones thyroïdiennes (TH) est un régulateur fondamental du métabolisme cellulaire, essentiel au développement normal et au fonctionnement optimal des tissus à l’âge adulte¹. Dans les tissus, l’action des TH est finement contrôlée par une machinerie moléculaire complexe, permettant le maintien spécifique des niveaux locaux de TH dans les tissus. Cette autonomie des différents tissus par rapport aux niveaux de TH circulants est d’une grande importance ^2,3,4.

De nombreux produits chimiques ont le potentiel de perturber les fonctions endocriniennes et se trouvent dans l’environnement sous forme de polluants. On craint de plus en plus que ces molécules puissent entrer dans la chaîne alimentaire par le biais des eaux usées et de la production agricole, ce qui aurait un impact sur la santé du bétail et des humains ^5,6,7.

L’un des défis importants pour résoudre ce problème est le grand nombre de composés impliqués, y compris des molécules autorisées et déjà interdites, mais toujours présentes. Ces dernières années, des efforts considérables ont été déployés pour mettre au point des systèmes d’essai permettant de dépister et d’identifier le potentiel perturbateur de divers produits chimiques 8,9,10,11. Bien que ces méthodes excellent dans le criblage à haut débit de milliers de composés et l’identification des menaces potentielles, une analyse détaillée des effets in vivo spécifiques de ces molécules est essentielle pour établir les dangers de l’exposition humaine. Ainsi, une approche multidimensionnelle est nécessaire lors de l’étude et de la caractérisation des perturbateurs endocriniens (PE).

Dans le contexte de la régulation des TH, la compréhension des conséquences tissulaires spécifiques de l’exposition aux PE nécessite de quantifier l’action locale des TH. Bien que plusieurs modèles in vivo aient été développés à cette fin, la plupart reposent sur des marqueurs endogènes comme mesure de sortie. Bien qu’ils soient physiologiques, ces marqueurs sont soumis à de nombreux mécanismes de régulation, directs et indirects, ce qui rend leur interprétation plus difficile. Par conséquent, la caractérisation des effets des PE sur la régulation des TH au niveau tissulaire reste un défi important^12,13.

Pour relever les défis de la mesure de la signalisation TH spécifique aux tissus, le modèle murin de l’indicateur d’action des hormones thyroïdiennes (THAI) a récemment été développé. Ce modèle permet de quantifier spécifiquement les changements dans l’action locale des TH dans des conditions endogènes. Un transgène de la luciférase a été introduit dans le génome de la souris, qui est très sensible à la régulation par l’action¹⁴ de TH. Ce modèle a démontré son efficacité pour répondre à diverses questions de recherche qui nécessitent de quantifier les changements dans la signalisation tissulaire locale des TH 14,15,16,17,18.

La reconnaissance d’une utilisation potentielle du modèle THAI est la caractérisation des effets tissulaires spécifiques des EDC sur la signalisation TH. Le modèle a récemment été utilisé avec succès pour étudier les effets spécifiques aux tissus du tétrabromobisphénol A et du diclazuril sur la signalisation TH¹⁵. Ici, des protocoles de base sont présentés pour l’utilisation de techniques d’imagerie in vivo sur le modèle THAI comme système de test pour caractériser les PE qui perturbent la fonction TH. Cette méthode tire parti de la nature bioluminescente de la réaction luciférine-luciférase. Essentiellement, l’enzyme luciférase exprimée par transgénique catalyse l’oxydation de la luciférine administrée, générant une lumière luminescente proportionnelle à la quantité de luciférase dans le tissu (Figure 1). Par conséquent, la réponse biologique mesurée est l’activité de la luciférase, qui a été validée comme une mesure appropriée de l’action locale de la TH¹⁴. Alors que le modèle THAI est applicable pour quantifier l’action de la TH dans pratiquement tous les tissus, l’imagerie in vivo se concentre principalement sur l’action de la TH dans l’intestin grêle (imagerie ventrale) et le tissu adipeux brun interscapulaire (BAT, imagerie dorsale)¹⁴.

Un avantage significatif de la technique d’imagerie in vivo est qu’elle élimine le besoin de sacrifier des animaux pour les mesures. Cela permet aux chercheurs de concevoir des expériences longitudinales et de suivi sous forme d’études autocontrôlées, réduisant ainsi le biais entre les sujets et le nombre d’animaux utilisés. Cet aspect est particulièrement crucial dans la caractérisation des PE, et la force et la polyvalence de la méthode à cette fin ont déjà été démontrées^14,15.

Protocole

Le présent protocole a été examiné et approuvé par le Comité du bien-être animal de l’Institut de médecine expérimentale (PE/EA/1490-7/2017, PE/EA/106-2/2021). Les données présentées proviennent de¹⁴ souris THAI mâles de 3 mois (n = 3-6/groupe). Les animaux thaïlandais ont tendance à avoir des taches très pigmentées sur leur peau qui peuvent fausser les mesures. Par conséquent, recherchez des taches pigmentées sur la peau de la zone imagée après l’épilation. Les animaux n’ont pas besoin de conditions d’hébergement particulières, sauf si l’expérience l’exige spécifiquement (par exemple, un régime alimentaire spécial).

1. Traitement de l’hyperthyroïdie

REMARQUE : Un protocole général pour induire l’hyperthyroïdie chez la souris est fourni ici. Le guide ATA¹⁹ offre des explications détaillées sur le contexte des méthodes et des alternatives mentionnées.

1. Dissoudre la T3 (3,5,3'-triiodothyronine, voir le tableau des matières) dans 40 mM de NaOH pour créer une solution mère à une concentration comprise entre 5 et 10 mg/mL.
2. Diluer la solution mère avec une solution saline jusqu’à une concentration finale de 0,1 μg/μL.
3. Injecter la solution de T3 diluée par voie intrapéritonéale (i.p.) à des animaux éveillés à un volume de 10 μL par gramme de poids corporel (bwg). Après 24 h, les animaux seront considérés comme hyperthyroïdiens.
   REMARQUE : Le traitement T3 peut être remplacé par tout autre type de traitement. Le traitement n’affecte pas le protocole d’imagerie in vivo .

2. Traitement de l’hypothyroïdie

REMARQUE : Ici, seul un protocole général pour induire l’hypothyroïdie chez la souris est fourni. Le guide^{ATA 19} décrit des explications détaillées sur le contexte des méthodes et des alternatives mentionnées.

1. Passer à un régime alimentaire sans iode et ajouter du KClO₄ et du méthimazole à l’eau de boisson (0,01 % de méthimazole, 0,05 % de KClO₄) (voir tableau des matières).
2. Remplacez la solution à boire régulièrement (tous les 2-3 jours) par une solution fraîche car le méthimazole est sensible à la lumière et se dégrade rapidement.
3. Maintenez le régime de traitement pendant au moins 2 semaines, pas plus de 4 semaines. Les animaux perdront du poids et montreront de l’inconfort. Si les animaux bougent à peine, ont perdu une grande partie de leurs poils ou sont à peine conscients, utilisez un critère d’évaluation sans cruauté et éliminez-les par n’importe quelle méthode (en suivant les protocoles approuvés par l’institution).
4. Poursuivre le traitement de l’hypothyroïdie lorsqu’il est associé à d’autres traitements pour prévenir la guérison potentielle de l’hypothyroïdie.

3. Imagerie in vivo

1. Démarrez le logiciel compatible avec le système d’imagerie in vivo (voir Tableau des matériaux).
2. Connectez-vous et attendez que le panneau « Assistant d’imagerie » se charge. Il s’agit d’un panneau plus petit en bas à gauche de la fenêtre.
3. Sur l’assistant d’imagerie, lancez le refroidissement de l’appareil photo en cliquant sur Initialiser dans le panneau « Assistant d’image ». Cela permet à l’instrument d’exécuter un protocole de configuration, attendez qu’il se termine. Le panneau « Assistant d’imagerie » devient bleu et un voyant vert s’allume dans le panneau lorsque la température de la caméra est suffisamment basse et que l’instrument est prêt.
4. Réglez la température du coussin chauffant à 30-37 °C pour garder les animaux mesurés au chaud.
   REMARQUE : Continuez le protocole en attendant que la température de la caméra soit optimale.
5. Ne gardez pas ou ne traitez pas d’animaux à proximité de l’instrument. Évitez que des quantités excessives de cheveux circulent dans l’air autour de l’instrument.
6. Anesthésier 1 à 3 animaux avec une injection intraveineuse de kétamine-xylazine (kétamine 50 mg/kg de poids corporel, xylazine 10 mg/kg de poids corporel, voir le tableau des matières). Sinon, si un système d’anesthésie à l’isoflurane est installé, suivez les protocoles approuvés par l’établissement pour utiliser l’anesthésie à l’isoflurane, en remplacement du mélange kétamine-xylazine.
   REMARQUE : Les souris hypothyroïdiennes sont plus sensibles à la kétamine-xylazine ; Utilisez une demi-dose.
7. Utilisez un gel de protection oculaire pendant l’anesthésie.
8. Vérifiez le réflexe de la pédale en pinçant les coussinets plantaires. Aucun réflexe de pédale ne confirme l’état de l’anesthésie sur plan chirurgical.
9. Une fois l’anesthésie effectuée, retirez la fourrure des parties du corps imagées en utilisant la méthode d’épilation la plus appropriée (épilateur, rasage, crème, etc.). Assurez-vous qu’aucune fourrure n’est laissée sur les parties du corps imagées pour éviter la diffusion de la lumière luminescente.
10. Dissoudre la Na-luciférine (voir le tableau des matières) dans 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à une concentration de 15 mg/mL. La luciférine est sensible à la lumière ; Évitez l’exposition directe à la lumière. Conservez la solution dans des tubes ambrés ou enveloppez-la dans du papier d’aluminium.
11. Traiter les animaux rasés avec une solution de luciférine 10 μL/bwg i.p.
12. Placez les animaux dans l’instrument avec le point central de la caméra marqué d’un « + » sur le pad. Assurez-vous d’un placement correct en vérifiant le quadrillage et en confirmant avec une seule capture « Photo » en cas de doute.
13. Attendez 15 minutes après l’administration du substrat avant de prendre la première mesure. Pendant ce temps, réglez la durée d’imagerie dans le panneau « Image Wizard » sur 3 min pour la luminescence et cochez les cases Photo et Luminescence. La « photo » doit coïncider avec la luminescence pour identifier la source du signal mesuré.
    REMARQUE : 15 minutes sont nécessaires pour une absorption optimale du substrat et une distribution tissulaire. Le signal luminescent plafonne 15 à 20 minutes après l’administration de luciférine. Le signal commence à diminuer lentement après le plateau.
14. Prenez la première mesure en cliquant sur Mesurer dans le panneau « Assistant d’imagerie ».
15. Si l’imagerie ventrale et dorsale est effectuée, réorganisez les animaux pour que la deuxième partie du corps soit imagée immédiatement après la fin de la première.
16. Une fois l’imagerie terminée, remettez les animaux dans leurs cages et continuez l’expérience avec le prochain groupe d’animaux.
17. Laissez les animaux récupérer, ce qui prend généralement 1 à 2 heures au maximum. Placez un tube rempli d’eau tiède près des animaux pour faciliter la récupération et surveillez les signes vitaux tels que la respiration et la perfusion.
18. Décidez du sort des animaux mesurés. Dans les données présentées dans cet article, les animaux mesurés ont été euthanasiés selon des protocoles approuvés par l’établissement pour les mesures ex vivo . Cependant, ce n’est pas nécessaire. Demandez-vous si l’euthanasie ou les expériences de suivi sont éthiques.

4. Analyse des données

1. Ouvrez le fichier « ClickInfo » dans le logiciel. Un panneau nommé « Palette d’outils » pour l’analyse et l’édition d’images s’ouvrira sur le côté droit de la fenêtre.
2. Convertissez l’échelle en luminance dans le coin supérieur gauche de l’image.
3. Cliquez sur « Ajuster l’image ».
4. Décidez du binning et de l’échelle de couleurs optimaux des images. Faites en sorte que toutes les images utilisent les mêmes paramètres.
5. Cliquez sur « Outils de retour sur investissement » dans la « Palette d’outils ».
6. Sélectionnez les centres d’intérêt en cliquant sur « Placer le ROI » dans les « outils ROI ». L’utilisation de ROI de même taille ou de tailles différentes peut également être utile selon le plan expérimental.
7. Cliquez sur « Mesurer les ROI ». Une nouvelle fenêtre s’ouvrira avec les données des ROI placés. Exportez les données avec la commande Windows ctr + c-ctrl + v dans un logiciel d’organisation ou de statistiques de votre choix.
8. Les données peuvent être exportées sous forme de flux total ou de luminance moyenne. Choisissez la variable la plus pertinente dans le cadre expérimental actuel.
9. Poursuivre l’analyse des données conformément au plan expérimental. Il est recommandé de calculer individuellement les valeurs (de fond traitées) en tant qu'"effet mesuré chez un animal ».

Résultats

En général, la luminance mesurée varie de magnitudes de 10⁵ à 10^{10 p} /s/s^{/ cm 2} / sr. Cependant, les valeurs exactes peuvent varier d’un animal à l’autre dans une même image et d’une image à l’autre. Par conséquent, la comparaison de données brutes peut être trompeuse. Il est crucial d’établir des signaux de contrôle et d’arrière-plan dans toutes les expériences, ce qui rend les conceptions autocontrôlées fortement recommandées...

Discussion

Les menaces que représentent les perturbateurs endocriniens (PE) pour la santé humaine sont bien connues ; cependant, la recherche sur les perturbateurs endocriniens se heurte à des défis considérables. Ces défis sont en partie une conséquence de la complexité du système endocrinien. De nombreux perturbateurs endocriniens perturbent simultanément plusieurs systèmes endocriniens²². De plus, dans le contexte de l’économie des hormones thyroïdiennes (TH), il existe une couche supplém...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,5,3'-triiodothyronine (T3)	Merck	T2877
Animals, mice			THAI mouse
Eye protection gel	Oculotect		1000 IU/g
Falcon tube	Thermo Fisher Scientific		50 mL volume
Iodine-free chow diet	Research Diets	custom
IVIS Lumina II in vivo imaging system	Perkin Elmer	-
Ketamine	Vetcentre	E1857
Living Image software 4.5	Perkin Elmer	-	provided with the instrument
Measuring cylinder			250 mL
methimazole	Merck	M8506
Microfuge tubes	Eppendorf		For diluting treatment materials
NaClO4	Merck	71852
Na-luciferin, substrate	Goldbio	103404-75-7
NaOH	Merck	101052833
Phoshphate buffer saline	Chem Cruz	sc-362302
Pipette	Gilson		For diluting treatment materials
Pipette tips	Axygen		For diluting treatment materials
Shaving cream/epilator/shaver			Personal preference
Syringe	B Braun		1 mL volume
Syringe needle	B Braun		0.3 x 12 mm
Xylazine	Vetcentre	E1852