通过甲状腺激素作用指示剂小鼠体内表征内分泌干扰化学效应

摘要

甲状腺激素作用指示剂小鼠模型的开发是为了利用其内源性调节机制对局部甲状腺激素作用进行组织特异性定量。最近，已经表明该模型适用于通过 体外 和 体内 方法表征与甲状腺激素经济相互作用的内分泌干扰化学物质。

摘要

甲状腺激素（TH）在细胞代谢和组织功能中起着至关重要的作用。TH 经济容易受到内分泌干扰化学物质 （EDC） 的影响，这些化学物质会干扰激素的产生或作用。许多环境污染物是EDC，对人类健康和农业生产都构成新威胁。这导致对适当的测试系统的需求增加，以检查潜在 EDC 的影响。然而，目前的方法面临挑战。大多数测试系统使用由多个通常复杂的调节过程调节的内源性标记物，因此难以区分直接和间接影响。此外， 体外 测试系统缺乏哺乳动物EDC代谢和药代动力学的生理复杂性。此外，暴露于环境EDC通常涉及多种化合物的混合物，包括 体内 产生的代谢物，因此相互作用的可能性不容忽视。这种复杂性使得EDC表征变得困难。甲状腺激素作用指示剂 （THAI） 小鼠是一种转基因模型，携带 TH 反应性荧光素酶报告基因系统，能够评估组织特异性 TH 作用。人们可以通过定量组织样品中荧光素酶报告基因的表达来评估化学物质对局部 TH 作用的组织特异性影响。此外，通过 体内 成像，THAI小鼠模型可以纵向研究潜在EDC对活体动物的影响。这种方法为测试长期暴露、复杂的治疗结构或戒断提供了一个强大的工具，因为它可以评估同一动物的局部 TH 作用随时间的变化。本报告描述了对THAI小鼠进行 体内 成像测量的过程。这里讨论的方案侧重于开发和成像甲状腺功能亢进和甲状腺功能减退小鼠，这些小鼠可以作为对照。研究人员可以调整或扩展所提出的治疗方法以满足他们的特定需求，为进一步研究提供基础方法。

引言

甲状腺激素 （TH） 信号转导是细胞代谢的基本调节因子，对成年期的正常发育和最佳组织功能至关重要¹。在组织内，TH的作用由复杂的分子机制精细控制，允许组织特异性维持局部TH水平。不同组织与循环TH水平的这种自主性非常重要^2,3,4。

许多化学物质有可能破坏内分泌功能，并在环境中作为污染物存在。人们越来越担心这些分子可以通过废水和农业生产进入食物链，从而影响牲畜和人类的健康^5,6,7。

解决这一问题的重大挑战之一是涉及的化合物数量之多，包括已授权和已被禁止但仍持续存在的分子。近年来，在开发用于筛选和识别各种化学品的破坏性潜力^的测试系统方面做出了大量努力8,9,10,11。虽然这些方法在高通量筛选数千种化合物和识别潜在威胁方面表现出色，但详细分析这些分子的特定体内效应对于确定人体暴露的危害至关重要。因此，在研究和表征内分泌干扰化学物质 （EDC） 时，需要采用多方面的方法。

在 TH 调节的背景下，了解 EDC 暴露的组织特异性后果需要量化局部 TH 作用。尽管已经为此目的开发了几种体内模型，但大多数都依赖于内源性标记物作为其输出测量。尽管是生理的，但这些标志物受到许多直接和间接的调节机制的影响，这使得它们的解释更具挑战性。因此，表征 EDC 在组织水平上对 TH 调节的影响仍然是一个重大挑战^12,13。

为了解决测量组织特异性TH信号传导的挑战，最近开发了甲状腺激素行动指示剂（THAI）小鼠模型。该模型允许在内源性条件下对局部 TH 作用的变化进行特异性量化。将荧光素酶转基因引入小鼠基因组，该基因对 TH 作用¹⁴ 的调控高度敏感。该模型已证明可以有效回答需要量化局部组织 TH 信号转导变化的各种研究问题 14,15,16,17,18。

对 THAI 模型的一个潜在用途的认识是表征 EDC 对 TH 信号传导的组织特异性影响。该模型最近已成功用于研究四溴双酚 A 和双唑嘌啶对 TH 信号转导的组织特异性影响¹⁵。在这里，提出了利用 THAI 模型 上的体内 成像技术作为表征破坏 TH 功能的 EDC 的测试系统的基线协议。该方法利用了荧光素-荧光素酶反应的生物发光特性。从本质上讲，转基因表达的荧光素酶催化给药的荧光素的氧化，产生与组织中荧光素酶的量成正比的发光（图1）。因此，测量的生物反应是荧光素酶活性，这已被验证为局部 TH 作用的合适测量¹⁴。虽然 THAI 模型适用于量化几乎所有组织中的 TH 作用，但 体内 成像主要关注小肠（腹侧成像）和肩胛间棕色脂肪组织（BAT，背侧成像）中的 TH 作用¹⁴。

活体成像技术的一个显着优点是它消除了牺牲动物进行测量的需要。这使得研究人员能够将纵向和后续实验设计为自我对照研究，从而减少受试者之间的偏差和使用的动物数量。这方面在EDC表征中尤为重要，该方法在这方面的强度和多功能性之前已经得到证明^14,15。

研究方案

本方案已由实验医学研究所动物福利委员会审查和批准（PE/EA/1490-7/2017、PE/EA/106-2/2021）。所呈现的数据来自FVB / Ant背景^14,3个月大的雄性THAI小鼠（n = 3-6 /组）。FVB/蚂蚁背景 泰国动物的皮肤上往往有高度色素沉着的斑点，这可能会扭曲测量值。因此，在去除毛皮后，在成像区域的皮肤上寻找色素沉着斑点。动物不需要特殊的住房条件，除非实验特别要求（例如，特殊的饮食）。

1.甲状腺功能亢进治疗

注意：此处提供了诱导小鼠甲状腺功能亢进症的一般方案。ATA 指南¹⁹ 详细介绍了这些方法的背景，并提到了替代方案。

1. 将T3（3,5,3'-三碘甲状腺原氨酸，参见 材料表）溶解在40mM NaOH中，以生成浓度在5-10mg / mL之间的储备溶液。
2. 用生理盐水稀释储备溶液至终浓度为0.1μg/μL。
3. 将稀释的T3溶液腹膜内（ip）注射到清醒的动物中，体积为每克体重（bwg）10μL。24小时后，动物将被视为甲状腺功能亢进。
   注意：T3 治疗可以被任何其他类型的治疗代替。该治疗不影响 体内 成像的方案。

2.甲状腺功能减退症治疗

注意：这里仅提供了诱导小鼠甲状腺功能减退症的一般方案。ATA 指南¹⁹ 描述了有关方法背景的详细说明，并提到了替代方案。

1. 将饮食改为无碘食物，并在饮用水中加入KClO₄ 和甲巯咪唑（0.01%甲巯咪唑，0.05%KClO₄）（见 材料表）。
2. 定期（每 2-3 天）用新鲜的饮用溶液替换饮用溶液，因为甲巯咪唑对光敏感且降解迅速。
3. 坚持治疗方案至少 2 周，不超过 4 周。动物会减肥并会表现出不适。如果动物几乎不能四处走动，已经失去了大部分毛发，或者几乎没有意识，请使用人道的终点并通过任何方法（遵循机构批准的协议）终止它们。
4. 当与其他治疗联合使用时，继续甲状腺功能减退治疗，以防止甲状腺功能减退症的潜在恢复。

3. 体内 成像

1. 启动与 体内 成像系统兼容的软件（参见 材料表）。
2. 登录并等待“Imaging Wizard”面板加载。它是窗口左下角的一个较小的面板。
3. 在“成像向导”上，通过单击“图像向导面板”中的 “初始化 ”来启动相机冷却。这使得仪器运行设置协议，等待它完成。“成像向导面板”变为蓝色，当相机温度足够低且仪器准备就绪时，面板中的绿灯将亮起。
4. 将加热垫的温度设置为30-37°C，以保持被测动物的温暖。
   注意：在等待相机温度达到最佳状态的同时继续执行协议。
5. 请勿在仪器附近饲养或治疗动物。避免过量的头发在仪器周围的空气中循环。
6. 用氯胺酮-甲苯噻嗪腹腔注射液麻醉1-3只动物（氯胺酮50mg / kg体重，甲苯噻嗪10mg / kg体重，见 材料表）。或者，如果安装了异氟醚麻醉系统，请遵循机构批准的方案使用异氟醚麻醉，取代氯胺酮-甲苯噻嗪混合物。
   注意：甲状腺功能减退小鼠对氯胺酮-甲苯噻嗪更敏感;使用半剂量。
7. 麻醉期间使用护眼凝胶。
8. 通过捏住脚垫检查踏板反射。没有踏板反射可以确认手术平面麻醉的状态。
9. 麻醉生效后，使用最合适的毛皮去除方法（脱毛器、剃须、乳膏等）从成像的身体部位去除毛发。确保成像的身体部位没有留下毛发，以防止发光散射。
10. 将Na-荧光素（见 材料表）溶解在浓度为15mg / mL的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。荧光素对光敏感;避免阳光直射。将溶液储存在琥珀管中或用铝箔包裹。
11. 用荧光素溶液 10 μL/bwg 腹腔注射处理剃光的动物
12. 将动物放入仪器中，相机的中心点在垫子上标记为“+”。通过检查网格线来确保正确放置，如果不确定，则使用单个“照片”捕获进行确认。
13. 在进行第一次测量之前，在底物给药后等待15分钟。在此期间，将“图像向导”面板中的发光成像时间设置为 3 分钟，并选中 “照片 ”和 “发光”框。“照片”必须与发光相吻合，以识别测量信号的来源。
    注意：需要 15 分钟才能获得最佳底物摄取和组织分布。荧光素给药后15-20分钟发光信号趋于平稳。信号在平台期后开始缓慢减弱。
14. 通过单击“成像向导”面板中的 “测量 ”进行第一次测量。
15. 如果同时进行腹侧和背侧成像，则在完成第一个成像后立即对动物进行第二个身体部位成像。
16. 成像完成后，将动物放回笼子并继续对下一组动物进行实验。
17. 让动物恢复，通常最多需要1-2小时。在动物附近放置一根装满温水的管子以促进恢复，并监测呼吸和灌注等生命体征。
18. 决定被测量动物的命运。在本文提供的数据中，被测动物按照机构批准的 离体 测量方案被安乐死。但是，这不是必需的。考虑安乐死或后续实验是否合乎道德。

4. 数据分析

1. 在软件中打开 “ClickInfo” 文件。一个名为“工具调色板”的面板将在窗口右侧打开，用于图像分析和编辑。
2. 将图像左上角的比例转换为亮度。
3. 点击“图像调整”。
4. 确定图像的最佳像素合并和色阶。使所有图像使用相同的设置。
5. 单击“工具选项板”上的“ROI 工具” 。
6. 通过单击“ROI 工具”中的“放置 ROI”来选择感兴趣的区域。根据实验设计，使用相同大小的 ROI 或不同大小的 ROI 也可能是有意义的。
7. 点击“衡量投资回报率”。将打开一个新窗口，其中包含放置的 ROI 数据。使用 ctr + c-ctrl + v Windows 命令将数据导出到选择的组织或统计软件中。
8. 数据可以导出为总通量或平均辐射度。选择与当前实验设置最相关的变量。
9. 根据实验设计继续进行数据分析。建议将（处理背景）值单独计算为“在一只动物中测量的效果”。

结果

通常，测得的辐射范围为 10⁵ 至 10¹⁰ p/s/cm²/sr。但是，同一图像和不同图像中的动物之间的确切值可能会有所不同。因此，比较原始数据可能会产生误导。在所有实验中建立控制信号和背景信号至关重要，因此强烈建议采用自控设计。

图 2 显示了在涉及甲状腺功能减退、欧和甲状?...

讨论

内分泌干扰化学物质（EDC）对人类健康构成的威胁已得到充分认识;然而，EDCs的研究面临着巨大的挑战。这些挑战在一定程度上是内分泌系统复杂性的结果。已发现许多 EDC 可同时破坏多个内分泌系统²²。此外，在甲状腺激素 （TH） 经济的背景下，由于组织在调节 TH 作用方面的差异，存在额外的复杂性。这种复杂性为通过表征各种组织中的 TH 作用来扩展 TH 信号传导的评估提供了...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,5,3'-triiodothyronine (T3)	Merck	T2877
Animals, mice			THAI mouse
Eye protection gel	Oculotect		1000 IU/g
Falcon tube	Thermo Fisher Scientific		50 mL volume
Iodine-free chow diet	Research Diets	custom
IVIS Lumina II in vivo imaging system	Perkin Elmer	-
Ketamine	Vetcentre	E1857
Living Image software 4.5	Perkin Elmer	-	provided with the instrument
Measuring cylinder			250 mL
methimazole	Merck	M8506
Microfuge tubes	Eppendorf		For diluting treatment materials
NaClO4	Merck	71852
Na-luciferin, substrate	Goldbio	103404-75-7
NaOH	Merck	101052833
Phoshphate buffer saline	Chem Cruz	sc-362302
Pipette	Gilson		For diluting treatment materials
Pipette tips	Axygen		For diluting treatment materials
Shaving cream/epilator/shaver			Personal preference
Syringe	B Braun		1 mL volume
Syringe needle	B Braun		0.3 x 12 mm
Xylazine	Vetcentre	E1852