Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يبحث هذا البروتوكول في استخدام البلازما الغنية بالحويصلة خارج الخلية (EV) كمؤشر على قدرة التخثر ل EV. يتم الحصول على البلازما الغنية ب EV من خلال عملية الطرد المركزي التفاضلي وإعادة التكلس اللاحقة.

Abstract

يكتسب دور الحويصلات خارج الخلية (EV) في الأمراض المختلفة اهتماما متزايدا ، لا سيما بسبب نشاطها القوي في تجلط الدم. ومع ذلك ، هناك حاجة ملحة لإجراء اختبار بجانب السرير لتقييم نشاط تجلط الدم للمركبات الكهربائية في الإعدادات السريرية. تقترح هذه الدراسة استخدام وقت تنشيط الثرومبين للبلازما الغنية ب EV كمقياس لنشاط تجلط الدم في EV. تم استخدام إجراءات موحدة للحصول على الدم الكامل المقتبس من الصوديوم ، يليه الطرد المركزي التفاضلي للحصول على البلازما الغنية بالمركبات الكهربائية. تمت إضافة البلازما الغنية ب EV وكلوريد الكالسيوم إلى كوب الاختبار ، وتم مراقبة التغيرات في مرونة اللزوجة في الوقت الفعلي باستخدام محلل. تم تحديد وقت التخثر الطبيعي للبلازما الغنية ب EV ، المشار إليها باسم EV-ACT. كشفت النتائج عن زيادة كبيرة في EV-ACT عندما تمت إزالة EV من البلازما التي تم الحصول عليها من متطوعين أصحاء ، بينما انخفضت بشكل ملحوظ عندما تم إثراء EV. علاوة على ذلك ، تم تقصير EV-ACT بشكل كبير في العينات البشرية من تسمم الحمل وكسر الورك وسرطان الرئة ، مما يشير إلى ارتفاع مستويات EV البلازما وتعزيز فرط تخثر الدم. من خلال إجراءاته البسيطة والسريعة ، يظهر EV-ACT وعدا كاختبار بجانب السرير لتقييم وظيفة التخثر في المرضى الذين يعانون من ارتفاع مستويات EV في البلازما.

Introduction

يلعب تجلط الدم ، الناجم عن فرط التخثر ، دورا مهما في أمراض مختلفة ، بما في ذلك صدمة الدماغ1 ، مقدمات الارتعاج2 ، الأورام3 ، ومرضى الكسور4. الآلية الكامنة وراء فرط التخثر معقدة ، وقد تم التركيز مؤخرا على دور الحويصلات خارج الخلية (EV) في اضطرابات التخثر. EVs عبارة عن أجسام تشبه الحويصلة ذات بنية ثنائية الطبقة تنفصل عن غشاء الخلية ، ويتراوح قطرها من 10 نانومتر إلى 1000 نانومتر. ترتبط بمجموعة متنوعة من العمليات المرضية ، وخاصة اضطرابات التخثر5. حددت العديد من الدراسات المركبات الكهربائية كمؤشر واعد لخطر تجلط الدم 6,7. يعتمد نشاط التخثر للمركبات الكهربائية على التعبير عن عوامل التخثر ، في المقام الأول عامل الأنسجة (TF) والفوسفاتيديل سيرين (PS). تعمل المركبات الكهربائية ذات نشاط التخثر القوي على تعزيز الكفاءة التحفيزية لمركب التيناز والبروثرومبين بشكل كبير ، وبالتالي تعزيز الفيبرينوجين بوساطة الثرومبين والتخثر الموضعي8. وقد لوحظت مستويات مرتفعة من EVs وعلاقتها السببية مع فرط تجلط الدم في العديد من الأمراض9. وبالتالي ، فإن توحيد الكشف عن المركبات الكهربائية والإبلاغ عن نشاطها في تجلط الدم هو مجال مهم للتحقيق10.

حتى الآن ، لا يتوفر سوى عدد قليل من المجموعات التجارية للكشف عن نشاط تجلط الدم للمركبات الكهربائية. مقايسة MP-Activity ومقايسة MP-TF ، التي تنتجها شركة تجارية ، هي مقايسات وظيفية تستخدم لقياس نشاط تجلط الدم في EV في البلازما11. تستخدم هذه المقايسات مبدأ مشابها لمقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم للكشف عن PS و TF على المركبات الكهربائية. ومع ذلك ، فإن هذه المجموعات باهظة الثمن وتقتصر على عدد قليل من المؤسسات البحثية رفيعة المستوى. العملية معقدة وتستغرق وقتا طويلا ، مما يجعل من الصعب تنفيذها في البيئات السريرية. بالإضافة إلى ذلك ، يمزج اختبار فوسفوليبيد (PPL) للتخثر المطور تجاريا البلازما الخالية من PS مع بلازما الاختبار ، ويقيس وقت التخثر للكشف الكمي عن مستويات EVs الإيجابيةPS 12. ومع ذلك ، تركز هذه المقايسات بشكل أساسي على PS و TF على المركبات الكهربائية ، متجاهلة مسارات التخثر الأخرى التي قد تشارك فيها المركبات الكهربائية المتداولةفي 12.

نظام تخثر البلازما معقد ويتألف من مكونات "غير مرئية" و "مرئية" ، بما في ذلك مواد التخثر ومضادات التخثر وأنظمة تحلل الفيبرين والمركبات الكهربائية المعلقة في البلازما. من الناحية الفسيولوجية ، تحافظ هذه المكونات على توازن ديناميكي. في الحالات المرضية ، تساهم الزيادة الكبيرة في EVs في الدورة الدموية في فرط تجلط الدم ، خاصة في المرضى الذين يعانون من صدمات الدماغ ، وتسمم الحمل ، والكسور ، وأنواع مختلفة من السرطان13. حاليا ، يتضمن تقييم حالة التخثر في المختبرات السريرية في المقام الأول تقييم نظام التخثر ونظام منع التخثر وانحلال الفيبرين14،15،16،17. يشيع استخدام وقت البروثرومبين ، ووقت الثرومبوبلاستين الجزئي المنشط ، ووقت الثرومبين ، والنسبة الطبيعية الدولية لتقييم مستويات عامل التخثر في نظام التخثر18. ومع ذلك ، فقد كشفت الدراسات الحديثة أن هذه الاختبارات لا تعكس تماما فرط تخثر بعض الأمراض19. طرق الفحص الأخرى ، مثل قياس تخثر الدم (TEG) ، TEG الدوراني ، وتحليل Sonoclot ، تقيس التغيرات اللزجة المرنة في الدم الكامل20,21. نظرا لأن عينات الدم الكاملة تحتوي على العديد من خلايا الدم والصفائح الدموية ، فمن المرجح أن تشير هذه الاختبارات إلى حالة تخثر العينة ككل. أبلغ بعض الباحثين عن دور خلايا الدم والصفائح الدموية في نشاط التخثر22,23. اكتشفت دراسة حديثة أيضا أن اختبارات وظيفة التخثر السابقة تواجه صعوبات في اكتشاف التغيرات في نشاط تجلط الدم للجسيمات الدقيقة24. لذلك ، تم اقتراح فرضية مفادها أنه يمكن تقييم وظيفة التخثر للمركبات الكهربائية عن طريق القياسات اللزجة المرنة لوقت التخثر المنشط (ACT) في البلازما الغنية ب EV.

Protocol

تمت الموافقة على جمع العينات البشرية من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في المستشفى العام بجامعة تيانجين الطبية. اتبع جمع الدم الوريدي البشري بدقة المبدأ التوجيهي الصادر عن لجنة الصحة الوطنية في الصين ، وهو WS / T 661-2020 Guideline لجمع عينات الدم الوريدي. باختصار ، تم جمع الدم من الأفراد الأصحاء بموافقة مستنيرة من الوريد الأمامي للمنطقة العضدية ، وتم خلط العينات باستخدام مضادات التخثر سترات الصوديوم بنسبة 3.2٪ بنسبة 1: 9. عندما تم جمع عينات سترات الصوديوم المضادة للتخثر فقط ، تم التخلص من وعاء التجميع الأول. بدأ تدفق المعالجة في غضون 0.5 ساعة من جمع العينات. تم تجنيد الأشخاص الأصحاء البالغين لجمع العينات بعد الحصول على الموافقة المستنيرة. كانت معايير استبعاد المريض: (1) تجلط الدم داخل الأوعية الدموية مؤخرا ، (2) ضعف وظائف الكبد والكلى ، (3) ارتفاع ضغط الدم ، فرط شحميات الدم ، السكري ، وأمراض مزمنة أخرى ، (4) الأسبرين أو العلاج المضاد للتخثر ، (5) الحيض والحمل.

1. عزل البلازما الغنية بالمركبات الكهربائية

  1. أجهزة الطرد المركزي العينات في 120 × غرام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة خلايا الدم. الطافي هو البلازما الغنية بالصفائح الدموية. بعد ذلك ، انقل الجزء العلوي من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي جديد باستخدام ماصة.
  2. أجهزة الطرد المركزي البلازما الغنية بالصفائح الدموية عند 1500 × جم لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة الصفائح الدموية. الطافي هو البلازما الفقيرة بالصفائح الدموية. ثم انقل الجزء العلوي من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي جديد.
  3. أجهزة الطرد المركزي البلازما الفقيرة بالصفائح الدموية عند 13000 × جم لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة بقايا الخلايا. الطافي هو البلازما الغنية ب EV. بعد ذلك ، انقل الجزء العلوي من المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي جديد للاختبار اللاحق.

2. الكشف عن EV-ACT للعينة بواسطة المحلل

  1. قم بتشغيل محلل الجلطة (انظر جدول المواد) وقم بتسخين الجهاز مسبقا إلى 37 درجة مئوية. قم بتثبيت المسبار القابل للتصرف وكوب الاختبار ، ثم ابدأ إجراء مراقبة الجودة للجهاز.
    ملاحظة: عندما يتم عرض قيمة إشارة المقاومة اللزجة على الشاشة كخط مستقيم ، فهذا يعني أن الاكتشاف لا يتداخل معه وأن مراقبة جودة حالة المحلل مؤهلة. يمكن بدء إجراء الاختبار بعد تأهيل الاختبار الذاتي.
  2. أدخل عينة من المعلومات في النظام. بعد ذلك ، انقل 200 ميكرولتر من البلازما الغنية ب EV إلى كوب الاختبار ، متبوعا ب 20 مللي مول 170 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم. انقر فوق زر البدء. سيخلط قضيب التحريك المغناطيسي في كوب الاختبار العينة وكلوريد الكالسيوم بالكامل. أغلق الغطاء ، وسيبدأ المسبار في اكتشاف التغيير في مقاومة العينة.
    ملاحظة: بعد الانتهاء من الاختبار ، سيطلب المحلل تلقائيا "اكتمال الاختبار". يتم عرض وقت EV-ACT وتسجيله بواسطة النظام. يتم التعبير عن النتيجة في وحدة الوقت "الثانية". تخلص من المسبار واختبر الكوب.

3. مراقبة الجودة القائمة على قياس التدفق الخلوي لعينة البلازما الغنية بالمركبات الكهربائية

  1. تم تحديد EVs لأول مرة من خلال حجمها (0.1-1 ميكرومتر). اضبط معلمات مقياس التدفق الخلوي مسبقا واضبط "بوابة" EV باستخدام حبات البوليسترين المتاحة تجاريا (0.5 و 0.9 و 3.0 ميكرومتر) (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: يتكون خليط الخرزة من كرات فلورية بأقطار مختلفة تغطي نطاق حجم الحويصلات الدقيقة (0.5 و 0.9 ميكرومتر) والصفائح الدموية (0.9 ميكرومتر و 3 ميكرومتر).
  2. اضبط جهد التشتت الأمامي والتشتت الجانبي ، وتأكد من سقوط الكريات المجهرية 0.9 ميكرومتر في المنطقة المناسبة. يمكن رسم منطقة EV وفقا لقطر الكرة المجهرية.
  3. نقل 50 ميكرولتر من البلازما الغنية ب EV إلى أنبوب التدفق ، تليها 450 ميكرولتر من محلول ملحي عازل للفوسفات المصفى. خلط السائل جيدا في أنبوب التدفق. أخيرا ، اكتشف العينات باستخدام قياس التدفقالخلوي 25.
  4. استخدم جسيمات الفلورسنت Ultra Rainbow (انظر جدول المواد) لتحديد عدد EVs.In الموجز ، وأضف 10 ميكرولتر من الجسيمات إلى العينة قبل اكتشاف التدفق ، واحسب تركيز EV باستخدام الصيغة التالية بعد اكتمال اكتشاف العينة: 10120 * EV (#) / (ميكروبيدات * حجم) * عامل التخفيف26.

النتائج

تم قياس وقت تنشيط الثرومبين للبلازما الغنية ب EV باستخدام محلل طريقة لزجة مرنة لقياس وقت تخثر البلازما. تتكون الماكينة من أربعة مكونات رئيسية: محول إشارة إلكتروني ، مسبار ، خزان كشف ، وعنصر تسخين (الشكل 1 أ ، ب). يستخدم المسبار تذبذبات عالية التردد ومنخفضة السعة للكش...

Discussion

في هذه الدراسة ، تم وصف تحضير البلازما الغنية ب EV ، وتم التحقق من عقلانية الطريقة باستخدام قياس التدفق الخلوي. بعد ذلك ، تم تحليل عينات البلازما المعاد تكلسها لوقت ACT باستخدام محلل الجلطة بناء على مبادئ المرونة اللزوجة24. كما هو موضح في الشكل 3 أ ، تم العثور على ت?...

Disclosures

أعلن جميع المؤلفين أنه لا يوجد تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين ، المنحة رقم 81930031 ، 81901525. بالإضافة إلى ذلك ، نشكر شركة تيانجين سينشري ييكانغ لتطوير التكنولوجيا الطبية المحدودة لتزويدنا بالآلات والتوجيه الفني.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USAFor quantitative detection of MP
Calcium chlorideWerfen (china)002000680020 mM
Century Clot analyzerTianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., LtdThe principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cupTianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometerBD, USAUsed to detect MP
Megamix polystyrene beadsBiocytex, Marseille, France7801The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.

References

  1. Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury. Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).
  2. Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. Prothrombotic state associated with preeclampsia. Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).
  3. Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Best Practice & Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346 (2022).
  4. You, D., et al. Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis. Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).
  5. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).
  6. Zang, X., et al. Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400 (2023).
  7. Chen, Y., et al. Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty. Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).
  8. Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505 (2021).
  9. Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).
  10. Cointe, S., et al. Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).
  11. Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348 (2014).
  12. Mooberry, M. J., et al. Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).
  13. Zhao, Z., et al. Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury. Protein & Cell. 8 (11), 801-810 (2017).
  14. Bolliger, D., Tanaka, K. A. Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).
  15. Ganter, M. T., Hofer, C. K. Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices. Anesthesia & Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).
  16. Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review. Chest. 151 (1), 127-138 (2017).
  17. Maier, C. L., Sniecinski, R. M. Anticoagulation monitoring for perioperative physicians. Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).
  18. Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics. Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).
  19. Tsantes, A. G., et al. Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry. International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).
  20. Premkumar, M., et al. COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study. BMJ Open. 12 (5), e051971 (2022).
  21. Sakai, T. Comparison between thromboelastography and thromboelastometry. Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).
  22. Yan, M., et al. TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia. Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666 (2022).
  23. Yu, H., et al. Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release. The FASEB Journal. 35 (9), e21808 (2021).
  24. Gao, Y., et al. MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374 (2023).
  25. Wang, J., et al. Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice. Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).
  26. Tan, J., et al. Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282 (2021).
  27. Kubo, H. Extracellular vesicles in lung disease. Chest. 153 (1), 210-216 (2018).
  28. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and Extracellular Vesicles. Current Hypertension Reports. 18 (9), 68 (2016).
  29. Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis. Life Science. 236, 116861 (2019).
  30. Shi, J., Gilbert, G. E. Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites. Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).
  31. Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium. Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).
  32. Frey, B., Gaipl, U. S. The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles. Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).
  33. Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. Platelet removal by single-step centrifugation. Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).
  34. Chen, Y., et al. Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study. BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).
  35. Liu, Y., et al. The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404 (2022).
  36. Piwkham, D., et al. The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis. Heliyon. 9 (1), e12714 (2023).
  37. Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

198 EV EV EV ACT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved