تحديد نشاط تجلط الدم للحويصلة خارج الخلية (EV) باستخدام وقت التخثر المنشط ب EV (EV-ACT)

Summary

يبحث هذا البروتوكول في استخدام البلازما الغنية بالحويصلة خارج الخلية (EV) كمؤشر على قدرة التخثر ل EV. يتم الحصول على البلازما الغنية ب EV من خلال عملية الطرد المركزي التفاضلي وإعادة التكلس اللاحقة.

Abstract

يكتسب دور الحويصلات خارج الخلية (EV) في الأمراض المختلفة اهتماما متزايدا ، لا سيما بسبب نشاطها القوي في تجلط الدم. ومع ذلك ، هناك حاجة ملحة لإجراء اختبار بجانب السرير لتقييم نشاط تجلط الدم للمركبات الكهربائية في الإعدادات السريرية. تقترح هذه الدراسة استخدام وقت تنشيط الثرومبين للبلازما الغنية ب EV كمقياس لنشاط تجلط الدم في EV. تم استخدام إجراءات موحدة للحصول على الدم الكامل المقتبس من الصوديوم ، يليه الطرد المركزي التفاضلي للحصول على البلازما الغنية بالمركبات الكهربائية. تمت إضافة البلازما الغنية ب EV وكلوريد الكالسيوم إلى كوب الاختبار ، وتم مراقبة التغيرات في مرونة اللزوجة في الوقت الفعلي باستخدام محلل. تم تحديد وقت التخثر الطبيعي للبلازما الغنية ب EV ، المشار إليها باسم EV-ACT. كشفت النتائج عن زيادة كبيرة في EV-ACT عندما تمت إزالة EV من البلازما التي تم الحصول عليها من متطوعين أصحاء ، بينما انخفضت بشكل ملحوظ عندما تم إثراء EV. علاوة على ذلك ، تم تقصير EV-ACT بشكل كبير في العينات البشرية من تسمم الحمل وكسر الورك وسرطان الرئة ، مما يشير إلى ارتفاع مستويات EV البلازما وتعزيز فرط تخثر الدم. من خلال إجراءاته البسيطة والسريعة ، يظهر EV-ACT وعدا كاختبار بجانب السرير لتقييم وظيفة التخثر في المرضى الذين يعانون من ارتفاع مستويات EV في البلازما.

Introduction

يلعب تجلط الدم ، الناجم عن فرط التخثر ، دورا مهما في أمراض مختلفة ، بما في ذلك صدمة الدماغ¹ ، مقدمات الارتعاج² ، الأورام³ ، ومرضى الكسور⁴. الآلية الكامنة وراء فرط التخثر معقدة ، وقد تم التركيز مؤخرا على دور الحويصلات خارج الخلية (EV) في اضطرابات التخثر. EVs عبارة عن أجسام تشبه الحويصلة ذات بنية ثنائية الطبقة تنفصل عن غشاء الخلية ، ويتراوح قطرها من 10 نانومتر إلى 1000 نانومتر. ترتبط بمجموعة متنوعة من العمليات المرضية ، وخاصة اضطرابات التخثر⁵. حددت العديد من الدراسات المركبات الكهربائية كمؤشر واعد لخطر تجلط الدم ^6,7

Protocol

تمت الموافقة على جمع العينات البشرية من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في المستشفى العام بجامعة تيانجين الطبية. اتبع جمع الدم الوريدي البشري بدقة المبدأ التوجيهي الصادر عن لجنة الصحة الوطنية في الصين ، وهو WS / T 661-2020 Guideline لجمع عينات الدم الوريدي. باختصار ، تم جمع الدم من الأفراد الأصحاء بموافقة مستنيرة من الوريد الأمامي للمنطقة العضدية ، وتم خلط العينات باستخدام مضادات التخثر سترات الصوديوم بنسبة 3.2٪ بنسبة 1: 9. عندما تم جمع عينات سترات الصوديوم المضادة للتخثر فقط ، تم التخلص من وعاء التجميع الأول. بدأ تدفق المعالجة في غضون 0.5 ساعة من جمع العينات. تم تجنيد الأشخاص الأصحاء البالغين لجمع العينات بعد الحصول على الموافقة المستنيرة. كانت معايير استبعاد المريض: (1) ....

النتائج

تم قياس وقت تنشيط الثرومبين للبلازما الغنية ب EV باستخدام محلل طريقة لزجة مرنة لقياس وقت تخثر البلازما. تتكون الماكينة من أربعة مكونات رئيسية: محول إشارة إلكتروني ، مسبار ، خزان كشف ، وعنصر تسخين (الشكل 1 أ ، ب). يستخدم المسبار تذبذبات عالية التردد ومنخفضة السعة للكش.......

Discussion

في هذه الدراسة ، تم وصف تحضير البلازما الغنية ب EV ، وتم التحقق من عقلانية الطريقة باستخدام قياس التدفق الخلوي. بعد ذلك ، تم تحليل عينات البلازما المعاد تكلسها لوقت ACT باستخدام محلل الجلطة بناء على مبادئ المرونة اللزوجة²⁴. كما هو موضح في الشكل 3 أ ، تم العثور على ت?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.