使用 EV 激活凝血时间 （EV-ACT） 测定细胞外囊泡 （EV） 的促凝血活性

摘要

该方案研究了使用富含细胞囊泡（EV）的血浆作为EV凝血能力的指标。通过差速离心和随后的再钙化过程获得富含EV的血浆。

摘要

细胞外囊泡 （EV） 在各种疾病中的作用越来越受到关注，特别是由于其强大的促凝血活性。然而，迫切需要床边测试来评估 EV 在临床环境中的促凝血活性。本研究建议使用富含 EV 的血浆的凝血酶激活时间作为 EV 促凝血活性的量度。采用标准化程序获得枸橼酸钠全血，然后进行差速离心以获得富含 EV 的血浆。将富含EV的血浆和氯化钙加入测试杯中，并使用分析仪实时监测粘弹性的变化。测定富含 EV 的血浆（称为 EV-ACT）的自然凝固时间。结果显示，当从健康志愿者获得的血浆中去除EV时，EV-ACT显着增加，而当EV富集时，EV-ACT显着降低。此外，子痫前期、髋部骨折和肺癌的人类样本中的 EV-ACT 显着缩短，表明血浆 EV 水平升高并促进血液高凝。凭借其简单快速的程序，EV-ACT有望作为评估高血浆EV水平患者凝血功能的床边测试。

引言

血栓形成是由高凝状态引起的，在脑外伤¹、先兆子痫²、肿瘤³和骨折患者⁴等多种疾病中起着重要作用。高凝状态的潜在机制很复杂，最近重点放在细胞外囊泡 （EV） 在凝血障碍中的作用。EV 是具有双层结构的囊泡状体，与细胞膜分离，直径范围为 10 nm 至 1000 nm。它们与多种疾病过程有关，尤其是凝血障碍⁵。几项研究已将 EV 确定为血栓形成风险的有希望的预测因子 ^6,7。EV的促凝血活性取决于凝血因子的表达，主要是组织因子（TF）和磷脂酰丝氨酸（PS）。具有强大促凝血活性的EV显著增强了腱蛋白酶和凝血酶原复合物的催化效率，从而促进凝血酶介导的纤维蛋白原和局部血栓形成⁸。在许多疾病中已观察到 EV 水平升高及其与高凝状态的因果关系⁹。因此，标准化 EV 的检测并报告其促凝血活性是研究的一个重要领域¹⁰。

迄今为止，只有少数商业试剂盒可用于检测电动汽车的促凝血活性。MP-Activity....

研究方案

人体样本采集经天津医科大学总医院医学伦理委员会批准。人静脉血采集严格按照中国国家卫生健康委员会发布的指南，即WS/T 661-2020《静脉血标本采集指南》。简而言之，从肱前静脉知情同意的健康个体中采集血液，并使用 3.2% 柠檬酸钠抗凝剂以 1：9 的比例混合样本。当仅收集柠檬酸钠抗凝剂标本时，丢弃第一个收集容器。在样品采集后 0.5 小时内启动处理流程。在获得知情同意后招募成年健康受试者进行样本采集。患者排除标准为：（1）近期血管内血栓形成，（2）肝肾功能损害，（3）高血压，高脂血症，糖尿病和其他慢性疾病，（4）阿司匹林或抗凝治疗，（5）月经和怀孕。

1. 分离富含EV的等离子体

1. 在室温下以120× g 离心样品20分钟以除去血细胞。上清液是富含血小板的血浆。然后，将上清液的上部1/2转移到带有移液管的新离心管中。
2. 在室温下以1500× g 离心富含血小板的血浆20分钟以除去血小板。上清液是贫血小板血浆。然后将上清液的上部1/2转移到新的离心管中。
3. 在室温下以13000× g 离心血小板贫血浆2分钟以除去细胞碎片。上清液是富含EV的等离子体。然后，将上清液的上部1/2转移到新的离心管中进行后续测试。

2. 分析仪检测样品的EV-ACT

讨论

本研究阐述了富EV血浆的制备方法，并采用流式细胞术验证了该方法的合理性。随后，使用基于粘弹性^{原理 24} 的凝块分析仪对再钙化的血浆样品进行 ACT 时间分析。如图3A所示，发现通过超速离心获得的EV浓度缩短了EV-ACT时间，而超速离心后的上清液降低了EV-ACT时间，表现出更长的EV-ACT时间。这些发现表明 EV-ACT 结果与 EV 水平之间存在密切关系。在

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.