使用 EV 激活凝血时间 （EV-ACT） 测定细胞外囊泡 （EV） 的促凝血活性

摘要

该方案研究了使用富含细胞囊泡（EV）的血浆作为EV凝血能力的指标。通过差速离心和随后的再钙化过程获得富含EV的血浆。

摘要

细胞外囊泡 （EV） 在各种疾病中的作用越来越受到关注，特别是由于其强大的促凝血活性。然而，迫切需要床边测试来评估 EV 在临床环境中的促凝血活性。本研究建议使用富含 EV 的血浆的凝血酶激活时间作为 EV 促凝血活性的量度。采用标准化程序获得枸橼酸钠全血，然后进行差速离心以获得富含 EV 的血浆。将富含EV的血浆和氯化钙加入测试杯中，并使用分析仪实时监测粘弹性的变化。测定富含 EV 的血浆（称为 EV-ACT）的自然凝固时间。结果显示，当从健康志愿者获得的血浆中去除EV时，EV-ACT显着增加，而当EV富集时，EV-ACT显着降低。此外，子痫前期、髋部骨折和肺癌的人类样本中的 EV-ACT 显着缩短，表明血浆 EV 水平升高并促进血液高凝。凭借其简单快速的程序，EV-ACT有望作为评估高血浆EV水平患者凝血功能的床边测试。

引言

血栓形成是由高凝状态引起的，在脑外伤¹、先兆子痫²、肿瘤³和骨折患者⁴等多种疾病中起着重要作用。高凝状态的潜在机制很复杂，最近重点放在细胞外囊泡 （EV） 在凝血障碍中的作用。EV 是具有双层结构的囊泡状体，与细胞膜分离，直径范围为 10 nm 至 1000 nm。它们与多种疾病过程有关，尤其是凝血障碍⁵。几项研究已将 EV 确定为血栓形成风险的有希望的预测因子 ^6,7。EV的促凝血活性取决于凝血因子的表达，主要是组织因子（TF）和磷脂酰丝氨酸（PS）。具有强大促凝血活性的EV显著增强了腱蛋白酶和凝血酶原复合物的催化效率，从而促进凝血酶介导的纤维蛋白原和局部血栓形成⁸。在许多疾病中已观察到 EV 水平升高及其与高凝状态的因果关系⁹。因此，标准化 EV 的检测并报告其促凝血活性是研究的一个重要领域¹⁰。

迄今为止，只有少数商业试剂盒可用于检测电动汽车的促凝血活性。MP-Activity 测定和 MP-TF 测定由一家商业公司生产，是用于测量 EV 在血浆中促凝血活性的功能测定¹¹。这些检测采用与酶联免疫吸附检测相似的原理来检测 EV 上的 PS 和 TF。然而，这些试剂盒价格昂贵，并且仅限于少数高级研究机构。该过程复杂且耗时，因此在临床环境中实施它们具有挑战性。此外，商业开发的促凝血磷脂 （PPL） 检测将无 PS 血浆与测试血浆混合，测量凝血时间以定量检测 PS 阳性 EV^{的水平 12}。然而，这些测定主要集中在 EV 上的 PS 和 TF，忽略了循环 EV 可能参与的其他凝血途径¹².

血浆凝血系统错综复杂，包括“看不见”和“看得见”的成分，包括凝血剂、抗凝剂、纤溶系统和悬浮在血浆中的 EV。在生理上，这些成分保持动态平衡。在病理条件下，循环中 EV 的显着增加会导致高凝状态，尤其是在脑外伤、先兆子痫、骨折和各种癌症患者^{中 13}。目前，临床实验室对凝血状态的评估主要涉及对凝血系统、抗凝系统和纤蛋白溶解的评估14,15,16,17。凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间和国际标准化比值通常用于评估凝血系统中的凝血因子水平¹⁸。然而，最近的研究表明，这些测试并不能完全反映某些疾病的高凝状态¹⁹。其他测定方法，如血栓弹力测定法 （TEG）、旋转 TEG 和声凝块分析，可测量全血粘弹性变化^20,21。由于全血样本含有大量血细胞和血小板，因此这些测试更有可能表明整个样本的凝血状态。一些研究人员报道了血细胞和血小板在促凝血活性中的作用^22,23。最近的一项研究还发现，以前的凝血功能测试在检测微粒促凝血活性的变化方面面临困难²⁴。因此，提出了一个假设，即可以通过对富含 EV 的血浆中活化凝血时间 （ACT） 的粘弹性测量来评估 EV 的促凝血功能。

研究方案

人体样本采集经天津医科大学总医院医学伦理委员会批准。人静脉血采集严格按照中国国家卫生健康委员会发布的指南，即WS/T 661-2020《静脉血标本采集指南》。简而言之，从肱前静脉知情同意的健康个体中采集血液，并使用 3.2% 柠檬酸钠抗凝剂以 1：9 的比例混合样本。当仅收集柠檬酸钠抗凝剂标本时，丢弃第一个收集容器。在样品采集后 0.5 小时内启动处理流程。在获得知情同意后招募成年健康受试者进行样本采集。患者排除标准为：（1）近期血管内血栓形成，（2）肝肾功能损害，（3）高血压，高脂血症，糖尿病和其他慢性疾病，（4）阿司匹林或抗凝治疗，（5）月经和怀孕。

1. 分离富含EV的等离子体

1. 在室温下以120× g 离心样品20分钟以除去血细胞。上清液是富含血小板的血浆。然后，将上清液的上部1/2转移到带有移液管的新离心管中。
2. 在室温下以1500× g 离心富含血小板的血浆20分钟以除去血小板。上清液是贫血小板血浆。然后将上清液的上部1/2转移到新的离心管中。
3. 在室温下以13000× g 离心血小板贫血浆2分钟以除去细胞碎片。上清液是富含EV的等离子体。然后，将上清液的上部1/2转移到新的离心管中进行后续测试。

2. 分析仪检测样品的EV-ACT

1. 打开凝块分析仪（见 材料表）并将仪器预热至37°C。 安装一次性探头和测试杯，然后启动机器的质量控制程序。
   注意： 当屏幕上的粘性电阻信号值显示为直线时，表示检测不受干扰，分析仪状态的质量控制合格。自检合格后即可启动测试程序。
2. 将样品信息输入系统。然后，将 200 μL 富含 EV 的血浆转移到测试杯中，然后转移 20 mM 170 μL 氯化钙。单击“开始”按钮。测试杯中的磁力搅拌棒将样品和氯化钙充分混合。关闭盖子，探头将开始检测样品电阻的变化。
   注意： 测试完成后，分析仪会自动提示“测试完成”。EV-ACT的时间由系统显示和记录。结果以时间单位“秒”表示。丢弃探头并测试杯子。

3. 基于流式细胞术的富EV血浆样品质量控制

1. EV首先通过其大小（0.1-1μm）进行识别。提前调整流式细胞仪的参数，并使用市售的聚苯乙烯珠（0.5、0.9和3.0μm）设置EV的“门”（参见 材料表）。
   注意：珠混合物由不同直径的荧光球组成，覆盖微囊泡（0.5和0.9μm）和血小板（0.9μm和3μm）的尺寸范围。
2. 调整正向散射和侧向散射的电压，并确保0.9μm微球落在适当的区域。EV区域可以根据微球的直径绘制。
3. 将 50 μL 富含 EV 的血浆转移到流管中，然后转移 450 μL 过滤的磷酸盐缓冲盐水。将流管中的液体彻底混合。最后，使用流式细胞术²⁵检测样品。
4. 使用Ultra Rainbow荧光颗粒（见 材料表）量化 EVs.In 简略的数量，在流量检测前向样品中加入10μL颗粒，并在样品检测完成后使用以下公式计算EV浓度：10,120 * EV （#） / （微珠 * 体积）* 稀释因子²⁶。

结果

使用粘弹性法分析仪测量富含EV的血浆的凝血酶活化时间，用于血浆凝血时间测量。该机器由四个主要部件组成：电子信号转换器、探头、检测罐和加热元件（图 1A、B）。该探头利用高频和低振幅振荡来检测等离子体粘度的变化。日常质量控制主要涉及空气质量控制，以评估测试平台的稳定性并识别对探头的任何物理干扰。性能质量控制包括使用标准粘度油进?...

讨论

本研究阐述了富EV血浆的制备方法，并采用流式细胞术验证了该方法的合理性。随后，使用基于粘弹性^{原理 24} 的凝块分析仪对再钙化的血浆样品进行 ACT 时间分析。如图3A所示，发现通过超速离心获得的EV浓度缩短了EV-ACT时间，而超速离心后的上清液降低了EV-ACT时间，表现出更长的EV-ACT时间。这些发现表明 EV-ACT 结果与 EV 水平之间存在密切关系。在

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.