Determinación de la actividad procoagulante de la vesícula extracelular (VE) mediante el tiempo de coagulación activado por EV (EV-ACT)

Resumen

Este protocolo investiga el uso de plasma rico en vesículas extracelulares (VE) como indicador de la capacidad coagulativa de la VE. El plasma rico en EV se obtiene mediante un proceso de centrifugación diferencial y posterior recalcificación.

Resumen

El papel de las vesículas extracelulares (VE) en diversas enfermedades está ganando cada vez más atención, particularmente debido a su potente actividad procoagulante. Sin embargo, existe una necesidad urgente de una prueba a pie de cama para evaluar la actividad procoagulante de la VE en entornos clínicos. Este estudio propone el uso del tiempo de activación de la trombina del plasma rico en EV como medida de la actividad procoagulante de EV. Se emplearon procedimientos estandarizados para obtener sangre entera cirada de sodio, seguida de centrifugación diferencial para obtener plasma rico en EV. El plasma rico en EV y el cloruro de calcio se añadieron a la copa de prueba, y los cambios en la viscoelasticidad se monitorizaron en tiempo real utilizando un analizador. Se determinó el tiempo de coagulación natural del plasma rico en EV, denominado EV-ACT. Los resultados revelaron un aumento significativo de EV-ACT cuando se eliminó EV del plasma obtenido de voluntarios sanos, mientras que disminuyó significativamente cuando se enriqueció EV. Además, el EV-ACT se acortó considerablemente en muestras humanas de preeclampsia, fractura de cadera y cáncer de pulmón, lo que indica niveles elevados de EV plasmático y promoción de la hipercoagulación sanguínea. Con su procedimiento simple y rápido, EV-ACT se muestra prometedor como una prueba a pie de cama para evaluar la función de la coagulación en pacientes con niveles altos de EV en plasma.

Introducción

La trombosis, causada por la hipercoagulabilidad, desempeña un papel importante en diversas enfermedades, como el traumatismo cerebral¹, la preeclampsia², los tumores³ y las pacientes con fracturas⁴. El mecanismo subyacente a la hipercoagulabilidad es complejo, y recientemente se ha puesto énfasis en el papel de las vesículas extracelulares (VE) en los trastornos de la coagulación. Los VE son cuerpos en forma de vesícula con una estructura de dos capas que se desprenden de la membrana celular, con un diámetro que varía de 10 nm a 1000 nm. Se asocian con una variedad de procesos patológicos, particularmente trastornos de la coagulación⁵. Varios estudios han identificado las VE como un predictor prometedor del riesgo de trombosis ^6,7. La actividad procoagulante de las VE depende de la expresión de los factores de coagulación, principalmente el factor tisular (TF) y la fosfatidilserina (PS). Los VE con actividad procoagulante robusta mejoran significativamente la eficiencia catalítica de la tenasa y el complejo de protrombina, promoviendo así el fibrinógeno mediado por trombina y la trombosis local⁸. Se han observado niveles elevados de VE y su relación causal con la hipercoagulabilidad en numerosas enfermedades⁹. En consecuencia, la estandarización de la detección de VE y el reporte de su actividad procoagulante es un área importante de investigación¹⁰.

Hasta la fecha, solo se dispone de unos pocos kits comerciales para detectar la actividad procoagulante de los vehículos eléctricos. El ensayo MP-Activity y el ensayo MP-TF, producidos por una empresa comercial, son ensayos funcionales utilizados para medir la actividad procoagulante de EV en plasma¹¹. Estos ensayos emplean un principio similar al de los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas para detectar PS y TF en EV. Sin embargo, estos kits son caros y están limitados a unas pocas instituciones de investigación de alto nivel. El proceso es complejo y requiere mucho tiempo, lo que dificulta su implementación en entornos clínicos. Además, un ensayo de fosfolípidos procoagulantes (PPL) desarrollado comercialmente mezcla plasma libre de PS con plasma de prueba, midiendo el tiempo de coagulación para detectar cuantitativamente los niveles de EV PS positivos¹². Sin embargo, estos ensayos se centran principalmente en PS y TF en los vehículos eléctricos, pasando por alto otras vías de coagulación en las que los vehículos eléctricos circulantes pueden estar implicados¹².

El sistema de coagulación del plasma es intrincado y comprende componentes "invisibles" y "visibles", incluidos coagulantes, anticoagulantes, sistemas fibrinolíticos y EV suspendidos en el plasma. Fisiológicamente, estos componentes mantienen un equilibrio dinámico. En condiciones patológicas, el aumento significativo de las VE en circulación contribuye a la hipercoagulabilidad, particularmente en pacientes con traumatismo craneoencefálico, preeclampsia, fracturas y varios tipos de cáncer¹³. Actualmente, la evaluación del estado de coagulación en los laboratorios clínicos implica principalmente la evaluación del sistema de coagulación, el sistema de anticoagulación y la fibrinólisis 14,15,16,17. El tiempo de protrombina, el tiempo de tromboplastina parcial activada, el tiempo de trombina y el cociente normalizado internacional se utilizan comúnmente para evaluar los niveles de factor de coagulación en el sistema de coagulación¹⁸. Sin embargo, estudios recientes han revelado que estas pruebas no reflejan completamente la hipercoagulabilidad de ciertas enfermedades¹⁹. Otros métodos de ensayo, como la tromboelastometría (TEG), la TEG rotacional y el análisis de sonoclot, miden los cambios viscoelásticos en sangre total^20,21. Dado que las muestras de sangre entera contienen numerosas células sanguíneas y plaquetas, es más probable que estas pruebas indiquen el estado de coagulación de la muestra en su conjunto. Algunos investigadores han reportado sobre el papel de las células sanguíneas y las plaquetas en la actividad procoagulante^22,23. Un estudio reciente también descubrió que las pruebas previas de la función de la coagulación enfrentan dificultades para detectar cambios en la actividad procoagulante de las micropartículas²⁴. Por lo tanto, se ha propuesto la hipótesis de que la función procoagulante de las VE puede evaluarse mediante mediciones viscoelásticas del tiempo de coagulación activado (ACT) en plasma rico en EV.

Protocolo

La recolección de muestras humanas fue aprobada por el Comité de Ética Médica del Hospital General de la Universidad Médica de Tianjin. La recolección de sangre venosa humana siguió estrictamente la pauta emitida por la Comisión Nacional de Salud de China, a saber, la Guía WS/T 661-2020 para la recolección de muestras de sangre venosa. Brevemente, se recolectó sangre de individuos sanos con consentimiento informado de la vena del área braquial anterior, y las muestras se mezclaron con anticoagulante citrato de sodio al 3,2% en una proporción de 1:9. Cuando solo se recolectaron muestras de anticoagulante de citrato de sodio, se descartó el primer recipiente de recolección. El flujo de procesamiento se inició dentro de las 0,5 h posteriores a la recolección de la muestra. Se reclutaron sujetos adultos sanos para la recolección de muestras después de obtener el consentimiento informado. Los criterios de exclusión de los pacientes fueron: (1) trombosis intravascular reciente, (2) deterioro de la función hepática y renal, (3) hipertensión, hiperlipidemia, diabetes y otras enfermedades crónicas, (4) aspirina o tratamiento anticoagulante, (5) menstruación y embarazo.

1. Aislamiento de plasma rico en VE

1. Centrifugar las muestras a 120 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente para eliminar las células sanguíneas. El sobrenadante es plasma rico en plaquetas. Luego, transfiera la mitad superior del sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga con una pipeta.
2. Centrifugar el plasma rico en plaquetas a 1500 x g durante 20 min a temperatura ambiente para eliminar las plaquetas. El sobrenadante es plasma pobre en plaquetas. A continuación, transfiera la mitad superior del sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga.
3. Centrifugar el plasma pobre en plaquetas a 13000 x g durante 2 minutos a temperatura ambiente para eliminar los restos celulares. El sobrenadante es plasma rico en EV. Luego, transfiera la mitad superior del sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga para pruebas posteriores.

2. Detección de EV-ACT de la muestra por parte del analizador

1. Encienda el analizador de coágulos (consulte la tabla de materiales) y precaliente el instrumento a 37 °C. Instale la sonda desechable y la taza de prueba, luego inicie el procedimiento de control de calidad de la máquina.
   NOTA: Cuando el valor de la señal de resistencia viscosa en la pantalla se muestra como una línea recta, significa que no se interfiere con la detección y se califica el control de calidad del estado del analizador. El procedimiento de prueba se puede iniciar después de que se califique la autoprueba.
2. Introduzca la información de muestra en el sistema. A continuación, transfiera 200 μL de plasma rico en EV al vaso de prueba, seguido de 20 mM y 170 μL de cloruro de calcio. Haga clic en el botón de inicio. La varilla de agitación magnética en la taza de prueba mezclará completamente la muestra y el cloruro de calcio. Cierre la tapa y la sonda comenzará a detectar el cambio en la resistencia de la muestra.
   NOTA: Una vez finalizada la prueba, el analizador indicará automáticamente "prueba completada". El sistema visualiza y registra la hora de EV-ACT. El resultado se expresa en la unidad de tiempo "segundo". Deseche la sonda y pruebe la copa.

3. Control de calidad basado en citometría de flujo de la muestra de plasma rica en EV

1. Los VE se identificaron por primera vez por su tamaño (0,1-1 μm). Ajuste los parámetros del citómetro de flujo con anticipación y configure la "puerta" de EV utilizando perlas de poliestireno disponibles comercialmente (0,5, 0,9 y 3,0 μm) (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: La mezcla de perlas consiste en esferas fluorescentes de diferentes diámetros que cubren el rango de tamaño de microvesículas (0,5 y 0,9 μm) y plaquetas (0,9 μm y 3 μm).
2. Ajuste el voltaje de la dispersión directa y la dispersión lateral, y asegúrese de que las microesferas de 0,9 μm caigan en la región adecuada. La región EV se puede dibujar de acuerdo con el diámetro de la microesfera.
3. Transfiera 50 μL de plasma rico en EV al tubo de flujo, seguido de 450 μL de solución salina tamón fosfato filtrado. Mezcle bien el líquido en el tubo de flujo. Por último, detectar las muestras mediante citometría de flujo²⁵.
4. Utilice partículas fluorescentes Ultra Rainbow (consulte la Tabla de materiales) para cuantificar el número de EVs.In breve, agregue 10 μL de las partículas a la muestra antes de la detección de flujo y calcule la concentración de EV utilizando la siguiente fórmula después de que se complete la detección de la muestra: 10,120 * EV (#) / (microperlas * volumen) * factor de dilución²⁶.

Resultados

El tiempo de activación de la trombina del plasma rico en EV se midió utilizando un analizador de método viscoelástico para la medición del tiempo de coagulación del plasma. La máquina consta de cuatro componentes principales: un convertidor electrónico de señal, una sonda, un tanque de detección y un elemento calefactor (Figura 1A, B). La sonda utiliza oscilaciones de alta frecuencia y baja amplitud para detectar cambios en la viscosidad del plasma. El control de ...

Discusión

En este estudio, se describió la preparación de plasma rico en EV y se verificó la racionalidad del método mediante citometría de flujo. Posteriormente, las muestras de plasma recalcificado se analizaron para el tiempo de ACT utilizando un analizador de coágulos basado en los principios de viscoelasticidad²⁴. Como se muestra en la Figura 3A, se encontró que la concentración de EV obtenida a través de la ultracentrifugación acortó el tiempo EV-ACT, mientras ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.