Determinación de la actividad procoagulante de la vesícula extracelular (VE) mediante el tiempo de coagulación activado por EV (EV-ACT)

Resumen

Este protocolo investiga el uso de plasma rico en vesículas extracelulares (VE) como indicador de la capacidad coagulativa de la VE. El plasma rico en EV se obtiene mediante un proceso de centrifugación diferencial y posterior recalcificación.

Resumen

El papel de las vesículas extracelulares (VE) en diversas enfermedades está ganando cada vez más atención, particularmente debido a su potente actividad procoagulante. Sin embargo, existe una necesidad urgente de una prueba a pie de cama para evaluar la actividad procoagulante de la VE en entornos clínicos. Este estudio propone el uso del tiempo de activación de la trombina del plasma rico en EV como medida de la actividad procoagulante de EV. Se emplearon procedimientos estandarizados para obtener sangre entera cirada de sodio, seguida de centrifugación diferencial para obtener plasma rico en EV. El plasma rico en EV y el cloruro de calcio se añadieron a la copa de prueba, y los cambios en la viscoelasticidad se monitorizaron en tiempo real utilizando un analizador. Se determinó el tiempo de coagulación natural del plasma rico en EV, denominado EV-ACT. Los resultados revelaron un aumento significativo de EV-ACT cuando se eliminó EV del plasma obtenido de voluntarios sanos, mientras que disminuyó significativamente cuando se enriqueció EV. Además, el EV-ACT se acortó considerablemente en muestras humanas de preeclampsia, fractura de cadera y cáncer de pulmón, lo que indica niveles elevados de EV plasmático y promoción de la hipercoagulación sanguínea. Con su procedimiento simple y rápido, EV-ACT se muestra prometedor como una prueba a pie de cama para evaluar la función de la coagulación en pacientes con niveles altos de EV en plasma.

Introducción

La trombosis, causada por la hipercoagulabilidad, desempeña un papel importante en diversas enfermedades, como el traumatismo cerebral¹, la preeclampsia², los tumores³ y las pacientes con fracturas⁴. El mecanismo subyacente a la hipercoagulabilidad es complejo, y recientemente se ha puesto énfasis en el papel de las vesículas extracelulares (VE) en los trastornos de la coagulación. Los VE son cuerpos en forma de vesícula con una estructura de dos capas que se desprenden de la membrana celular, con un diámetro que varía de 10 nm a 1000 nm. Se asocian con una variedad de proc....

Protocolo

La recolección de muestras humanas fue aprobada por el Comité de Ética Médica del Hospital General de la Universidad Médica de Tianjin. La recolección de sangre venosa humana siguió estrictamente la pauta emitida por la Comisión Nacional de Salud de China, a saber, la Guía WS/T 661-2020 para la recolección de muestras de sangre venosa. Brevemente, se recolectó sangre de individuos sanos con consentimiento informado de la vena del área braquial anterior, y las muestras se mezclaron con anticoagulante citrato de sodio al 3,2% en una proporción de 1:9. Cuando solo se recolectaron muestras de anticoagulante de citrato de sodio, se descartó el primer recipiente de recolecc....

Resultados

El tiempo de activación de la trombina del plasma rico en EV se midió utilizando un analizador de método viscoelástico para la medición del tiempo de coagulación del plasma. La máquina consta de cuatro componentes principales: un convertidor electrónico de señal, una sonda, un tanque de detección y un elemento calefactor (Figura 1A, B). La sonda utiliza oscilaciones de alta frecuencia y baja amplitud para detectar cambios en la viscosidad del plasma. El control de .......

Discusión

En este estudio, se describió la preparación de plasma rico en EV y se verificó la racionalidad del método mediante citometría de flujo. Posteriormente, las muestras de plasma recalcificado se analizaron para el tiempo de ACT utilizando un analizador de coágulos basado en los principios de viscoelasticidad²⁴. Como se muestra en la Figura 3A, se encontró que la concentración de EV obtenida a través de la ultracentrifugación acortó el tiempo EV-ACT, mientras .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.