Determinação da atividade pró-coagulante de vesículas extracelulares (EV) utilizando o tempo de coagulação ativado por EV (EV-ACT)

Resumo

Este protocolo investiga o uso de plasma rico em vesículas extracelulares (VE) como indicador da capacidade coagulativa da VE. O plasma rico em EV é obtido através de um processo de centrifugação diferencial e subsequente recalcificação.

Resumo

O papel das vesículas extracelulares (VE) em várias doenças vem ganhando atenção crescente, particularmente devido à sua potente atividade pró-coagulante. No entanto, há uma necessidade urgente de um teste à beira do leito para avaliar a atividade pró-coagulante da EV em ambientes clínicos. Este estudo propõe o uso do tempo de ativação da trombina do plasma rico em EV como medida da atividade pró-coagulante da EV. Procedimentos padronizados foram empregados para obtenção de sangue total citrato de sódio, seguido de centrifugação diferencial para obtenção de plasma rico em EV. O plasma rico em EV e o cloreto de cálcio foram adicionados à ventosa, e as mudanças na viscoelasticidade foram monitoradas em tempo real usando um analisador. O tempo natural de coagulação do plasma rico em EV, referido como EV-ACT, foi determinado. Os resultados revelaram um aumento significativo no EV-ACT quando EV foi removido do plasma obtido de voluntários saudáveis, enquanto diminuiu significativamente quando EV foi enriquecido. Além disso, EV-ACT foi consideravelmente encurtado em amostras humanas de pré-eclâmpsia, fratura de quadril e câncer de pulmão, indicando níveis elevados de EV plasmático e promoção de hipercoagulação sanguínea. Com seu procedimento simples e rápido, o EV-ACT mostra-se promissor como um teste à beira do leito para avaliar a função da coagulação em pacientes com altos níveis plasmáticos de EV.

Introdução

A trombose, causada pela hipercoagulabilidade, desempenha um papel significativo em várias doenças, incluindo traumatismo cranioencefálico¹, pré-eclâmpsia², tumores³ e pacientes fraturados⁴. O mecanismo subjacente à hipercoagulabilidade é complexo, e ênfase recente tem sido dada ao papel das vesículas extracelulares (VE) nos distúrbios de coagulação. EVs são corpos vesiculares com uma estrutura bicamada que se desprendem da membrana celular, variando em diâmetro de 10 nm a 1000 nm. Estão associados a uma variedade de processos patológicos, particularmente distúrbios de coagulação⁵. Vários estudos identificaram os EVs como um preditor promissor do risco de trombose ^6,7. A atividade pró-coagulante dos EVs depende da expressão de fatores de coagulação, principalmente fator tecidual (FT) e fosfatidilserina (PS). EVs com atividade pró-coagulante robusta aumentam significativamente a eficiência catalítica da tenase e do complexo protrombina, promovendo fibrinogênio mediado por trombina e trombose local⁸. Níveis elevados de EV e sua relação causal com a hipercoagulabilidade têm sido observados em inúmeras doenças⁹. Consequentemente, padronizar a detecção de EVs e relatar sua atividade pró-coagulante é uma importante área de investigação¹⁰.

Até o momento, apenas alguns kits comerciais estão disponíveis para detectar a atividade pró-coagulante dos EVs. O ensaio MP-Atividade e o ensaio MP-TF, produzidos por uma empresa comercial, são ensaios funcionais utilizados para medir a atividade pró-coagulante da EV no plasma¹¹. Esses ensaios empregam um princípio semelhante ao dos ensaios imunoenzimáticos para detectar PS e FT em EVs. No entanto, esses kits são caros e limitados a algumas instituições de pesquisa de alto nível. O processo é complexo e demorado, tornando desafiador implementá-los em ambientes clínicos. Além disso, um ensaio de fosfolipídios pró-coagulantes (PPL) desenvolvido comercialmente mistura plasma livre de PS com plasma teste, medindo o tempo de coagulação para detectar quantitativamente os níveis de EVs PS-positivos¹². No entanto, esses ensaios se concentram principalmente em PS e TF em EVs, ignorando outras vias de coagulação nas quais os EVs circulantes podem estar envolvidos¹².

O sistema de coagulação do plasma é intrincado e compreende componentes "invisíveis" e "visíveis", incluindo coagulantes, anticoagulantes, sistemas fibrinolíticos e EVs suspensos no plasma. Fisiologicamente, esses componentes mantêm um equilíbrio dinâmico. Em condições patológicas, o aumento significativo dos VE na circulação contribui para a hipercoagulabilidade, particularmente em pacientes com traumatismo cranioencefálico, pré-eclâmpsia, fraturas e vários tipos de câncer¹³. Atualmente, a avaliação do estado de coagulação em laboratórios clínicos envolve principalmente a avaliação do sistema de coagulação, sistema de anticoagulação e fibrinólise 14,15,16,17. O tempo de protrombina, o tempo de tromboplastina parcial ativada, o tempo de trombina e a razão normalizada internacional são comumente utilizados para avaliar os níveis de fatores de coagulação no sistema de coagulação¹⁸. No entanto, estudos recentes têm revelado que esses testes não refletem totalmente a hipercoagulabilidade de certas doenças¹⁹. Outros métodos de ensaio, como a tromboelastometria (TEG), o TEG rotacional e a análise de sonoclots, medem as alterações viscoelásticas do sangue total^20,21. Uma vez que as amostras de sangue total contêm numerosas células sanguíneas e plaquetas, estes testes são mais susceptíveis de indicar o estado de coagulação da amostra como um todo. Alguns pesquisadores têm relatado o papel das células sanguíneas e plaquetas na atividade pró-coagulante^22,23. Um estudo recente também descobriu que testes prévios de função da coagulação enfrentam dificuldades em detectar alterações na atividade pró-coagulante das micropartículas²⁴. Portanto, foi proposta a hipótese de que a função pró-coagulante dos EVs pode ser avaliada por medidas viscoelásticas do tempo de coagulação ativado (TCA) em plasma rico em EV.

Protocolo

A coleta de amostras humanas foi aprovada pelo Comitê de Ética Médica do Tianjin Medical University General Hospital. A coleta de sangue venoso humano seguiu rigorosamente a diretriz emitida pela Comissão Nacional de Saúde da China, ou seja, a Diretriz WS/T 661-2020 para Coleta de Amostras de Sangue Venoso. Resumidamente, o sangue foi coletado de indivíduos sadios com consentimento informado da veia da região anterior do braço, e as amostras foram misturadas com anticoagulante citrato de sódio a 3,2% na proporção de 1:9. Quando apenas espécimes de anticoagulante citrato de sódio foram coletados, o primeiro vaso de coleta foi descartado. O fluxo de processamento foi iniciado em até 0,5 h após a coleta das amostras. Indivíduos adultos saudáveis foram recrutados para coleta de amostras após a obtenção do consentimento informado. Os critérios de exclusão dos pacientes foram: (1) trombose intravascular recente, (2) comprometimento da função hepática e renal, (3) hipertensão, hiperlipidemia, diabetes e outras doenças crônicas, (4) tratamento com aspirina ou anticoagulante, (5) menstruação e gravidez.

1. Isolamento de plasma rico em EV

1. Centrifugar as amostras a 120 x g durante 20 minutos à temperatura ambiente para remover as células sanguíneas. O sobrenadante é o plasma rico em plaquetas. Em seguida, transfira o 1/2 superior do sobrenadante para um novo tubo de centrífuga com uma pipeta.
2. Centrifugar o plasma rico em plaquetas a 1500 x g durante 20 minutos à temperatura ambiente para remover as plaquetas. O sobrenadante é o plasma pobre em plaquetas. Em seguida, transfira o 1/2 superior do sobrenadante para um novo tubo de centrífuga.
3. Centrifugar o plasma pobre em plaquetas a 13000 x g durante 2 minutos à temperatura ambiente para remover os detritos celulares. O sobrenadante é o plasma rico em EV. Em seguida, transfira o 1/2 superior do sobrenadante para um novo tubo de centrífuga para testes subsequentes.

2. Detecção de EV-ACT da amostra pelo analisador

1. Ligue o analisador de coágulos (consulte a Tabela de Materiais) e pré-aqueça o instrumento a 37 °C. Instale a sonda descartável e o copo de teste e, em seguida, inicie o procedimento de controle de qualidade da máquina.
   NOTA: Quando o valor do sinal de resistência viscosa na tela é exibido como uma linha reta, isso significa que a detecção não é interferida e o controle de qualidade do status do analisador é qualificado. O procedimento de teste pode ser iniciado após a qualificação do autoteste.
2. Insira informações de exemplo no sistema. Em seguida, transferir 200 μL de plasma rico em EV para a xícara teste, seguido por 20 mM 170 μL de cloreto de cálcio. Clique no botão Iniciar. A haste de agitação magnética no copo de teste misturará totalmente a amostra e o cloreto de cálcio. Feche a tampa e a sonda começará a detectar a mudança na resistência da amostra.
   NOTA: Depois que o teste for concluído, o analisador solicitará automaticamente "teste concluído". O tempo de EV-ACT é exibido e registrado pelo sistema. O resultado é expresso na unidade de tempo "segundo". Descarte a sonda e teste o copo.

3. Controle de qualidade baseado em citometria de fluxo da amostra de plasma rico em EV

1. Os EVs foram primeiramente identificados por seu tamanho (0,1-1 μm). Ajustar os parâmetros do citômetro de fluxo com antecedência e ajustar o "gate" do EV usando esferas de poliestireno disponíveis comercialmente (0,5, 0,9 e 3,0 μm) (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: A mistura de esferas consiste em esferas fluorescentes de diferentes diâmetros cobrindo a faixa de tamanho de microvesículas (0,5 e 0,9 μm) e plaquetas (0,9 μm e 3 μm).
2. Ajuste a tensão do Forward Scatter e do Side Scatter e certifique-se de que as microesferas de 0,9 μm caiam na região apropriada. A região do VE pode ser desenhada de acordo com o diâmetro da microesfera.
3. Transferir 50 μL de plasma rico em EV para o tubo de fluxo, seguido por 450 μL de solução salina tampão fosfato filtrado. Misture bem o líquido no tubo de fluxo. Finalmente, detectar as amostras por citometria de fluxo²⁵.
4. Use partículas fluorescentes Ultra Rainbow (ver Tabela de Materiais) para quantificar o número de EVs.In breve, adicionar 10 μL das partículas à amostra antes da detecção do fluxo e calcular a concentração de EV usando a seguinte fórmula após a detecção da amostra estar completa: 10.120 * EV (#) / (microesferas * volume) * fator de diluição²⁶.

Resultados

O tempo de ativação da trombina do plasma rico em EV foi medido usando um analisador de método viscoelástico para medir o tempo de coagulação do plasma. A máquina é composta por quatro componentes principais: um conversor eletrônico de sinais, uma sonda, um tanque de detecção e um elemento de aquecimento (Figura 1A,B). A sonda utiliza oscilações de alta frequência e baixa amplitude para detectar mudanças na viscosidade do plasma. O controle de qualidade diári...

Discussão

Neste estudo, a preparação de plasma rico em EV foi descrita, e a racionalidade do método foi verificada por citometria de fluxo. Posteriormente, as amostras de plasma recalcificadas foram analisadas quanto ao tempo de TCA utilizando um analisador de coágulos baseado nos princípios de viscoelasticidade²⁴. Como mostrado na Figura 3A, a concentração de EVs obtidos por ultracentrifugação encurtou o tempo de EV-ACT, enquanto o sobrenadante após ultracentrifugaç...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.