EV ile Aktive Edilen Pıhtılaşma Süresi (EV-ACT) Kullanılarak Hücre Dışı Vezikülün (EV) Prokoagülan Aktivitesinin Belirlenmesi

Özet

Bu protokol, EV'nin pıhtılaşma yeteneğinin bir göstergesi olarak hücre dışı vezikülden (EV) zengin plazmanın kullanımını araştırır. EV'den zengin plazma, diferansiyel santrifüjleme ve ardından yeniden kalsifikasyon işlemi ile elde edilir.

Özet

Hücre dışı veziküllerin (EV) çeşitli hastalıklardaki rolü, özellikle güçlü prokoagülan aktiviteleri nedeniyle artan bir ilgi görmektedir. Bununla birlikte, klinik ortamlarda EV'nin prokoagülan aktivitesini değerlendirmek için acil bir yatak başı testine ihtiyaç vardır. Bu çalışma, EV'nin prokoagülan aktivitesinin bir ölçüsü olarak EV'den zengin plazmanın trombin aktivasyon zamanının kullanılmasını önermektedir. Sodyum sitratlı tam kan elde etmek için standartlaştırılmış prosedürler kullanıldı, ardından EV'den zengin plazma elde etmek için diferansiyel santrifüjleme yapıldı. EV bakımından zengin plazma ve kalsiyum klorür test kabına eklendi ve viskoelastisitedeki değişiklikler bir analizör kullanılarak gerçek zamanlı olarak izlendi. EV-ACT olarak adlandırılan EV'den zengin plazmanın doğal pıhtılaşma süresi belirlendi. Sonuçlar, sağlıklı gönüllülerden elde edilen plazmadan EV çıkarıldığında EV-ACT'de önemli bir artış olduğunu ortaya koyarken, EV zenginleştirildiğinde önemli ölçüde azaldığını ortaya koydu. Ayrıca, preeklampsi, kalça kırığı ve akciğer kanserinden alınan insan örneklerinde EV-ACT önemli ölçüde kısaldı, bu da plazma EV seviyelerinin yükseldiğini ve kan hiperkoagülasyonunun desteklendiğini gösterdi. Basit ve hızlı prosedürü ile EV-ACT, yüksek plazma EV düzeyleri olan hastalarda pıhtılaşma fonksiyonunu değerlendirmek için bir yatak başı testi olarak umut vaat etmektedir.

Giriş

Hiper pıhtılaşmanın neden olduğu tromboz, beyin travması¹, preeklampsi², tümörler³ ve kırık hastaları⁴ dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda önemli bir rol oynar. Hiper pıhtılaşmanın altında yatan mekanizma karmaşıktır ve son zamanlarda pıhtılaşma bozukluklarında hücre dışı veziküllerin (EV) rolüne vurgu yapılmıştır. EV'ler, çapı 10 nm ila 1000 nm arasında değişen, hücre zarından ayrılan iki katmanlı bir yapıya sahip vezikül benzeri cisimlerdir. Başta pıhtılaşma bozuklukları olmak üzere çeşitli hastalık süreçleriyle ilişkilidirler⁵. Birkaç çalışma,....

Protokol

İnsan örneklerinin toplanması, Tianjin Tıp Üniversitesi Genel Hastanesi Tıbbi Etik Komitesi tarafından onaylandı. İnsan venöz kanının toplanması, Çin Ulusal Sağlık Komisyonu tarafından yayınlanan kılavuzu, yani WS/T 661-2020 Venöz Kan Örneklerinin Toplanması Kılavuzunu sıkı bir şekilde takip etti. Kısaca, sağlıklı bireylerden bilgilendirilmiş onam ile anterior brakiyal bölge veninden kan alındı ve örnekler 1:9 oranında %3.2'lik sodyum sitrat antikoagülan kullanılarak karıştırıldı. Sadece sodyum sitrat antikoagülan örnekleri toplandığında, ilk toplama kabı atıldı. İşleme akışı, numune alındıktan sonraki 0,5 saat içinde başlatıldı. Yetişkin sağlıklı denekler, bilgilendi....

Tartışmalar

Bu çalışmada, EV'den zengin plazmanın hazırlanması tarif edildi ve yöntemin rasyonalitesi akış sitometrisi kullanılarak doğrulandı. Daha sonra, rekalsifiye plazma örnekleri, viskoelastisite ilkelerine dayalı bir pıhtı analizörü kullanılarak ACT süresi için analiz edildi²⁴. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, ultrasantrifüjleme yoluyla elde edilen EV'lerin konsantrasyonunun EV-ACT süresini kısalttığı, ultrasantrifüjlemeden sonra EV seviyelerin.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.