JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, EV'nin pıhtılaşma yeteneğinin bir göstergesi olarak hücre dışı vezikülden (EV) zengin plazmanın kullanımını araştırır. EV'den zengin plazma, diferansiyel santrifüjleme ve ardından yeniden kalsifikasyon işlemi ile elde edilir.

Özet

Hücre dışı veziküllerin (EV) çeşitli hastalıklardaki rolü, özellikle güçlü prokoagülan aktiviteleri nedeniyle artan bir ilgi görmektedir. Bununla birlikte, klinik ortamlarda EV'nin prokoagülan aktivitesini değerlendirmek için acil bir yatak başı testine ihtiyaç vardır. Bu çalışma, EV'nin prokoagülan aktivitesinin bir ölçüsü olarak EV'den zengin plazmanın trombin aktivasyon zamanının kullanılmasını önermektedir. Sodyum sitratlı tam kan elde etmek için standartlaştırılmış prosedürler kullanıldı, ardından EV'den zengin plazma elde etmek için diferansiyel santrifüjleme yapıldı. EV bakımından zengin plazma ve kalsiyum klorür test kabına eklendi ve viskoelastisitedeki değişiklikler bir analizör kullanılarak gerçek zamanlı olarak izlendi. EV-ACT olarak adlandırılan EV'den zengin plazmanın doğal pıhtılaşma süresi belirlendi. Sonuçlar, sağlıklı gönüllülerden elde edilen plazmadan EV çıkarıldığında EV-ACT'de önemli bir artış olduğunu ortaya koyarken, EV zenginleştirildiğinde önemli ölçüde azaldığını ortaya koydu. Ayrıca, preeklampsi, kalça kırığı ve akciğer kanserinden alınan insan örneklerinde EV-ACT önemli ölçüde kısaldı, bu da plazma EV seviyelerinin yükseldiğini ve kan hiperkoagülasyonunun desteklendiğini gösterdi. Basit ve hızlı prosedürü ile EV-ACT, yüksek plazma EV düzeyleri olan hastalarda pıhtılaşma fonksiyonunu değerlendirmek için bir yatak başı testi olarak umut vaat etmektedir.

Giriş

Hiper pıhtılaşmanın neden olduğu tromboz, beyin travması1, preeklampsi2, tümörler3 ve kırık hastaları4 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda önemli bir rol oynar. Hiper pıhtılaşmanın altında yatan mekanizma karmaşıktır ve son zamanlarda pıhtılaşma bozukluklarında hücre dışı veziküllerin (EV) rolüne vurgu yapılmıştır. EV'ler, çapı 10 nm ila 1000 nm arasında değişen, hücre zarından ayrılan iki katmanlı bir yapıya sahip vezikül benzeri cisimlerdir. Başta pıhtılaşma bozuklukları olmak üzere çeşitli hastalık süreçleriyle ilişkilidirler5. Birkaç çalışma, EV'leri tromboz riskinin umut verici bir belirleyicisi olarak tanımlamıştır 6,7. EV'lerin prokoagülan aktivitesi, başta doku faktörü (TF) ve fosfatidilserin (PS) olmak üzere pıhtılaşma faktörlerinin ekspresyonuna bağlıdır. Güçlü prokoagülan aktiviteye sahip EV'ler, tenaz ve protrombin kompleksinin katalitik etkinliğini önemli ölçüde arttırır, böylece trombin aracılı fibrinojen ve lokal trombozuteşvik eder 8. Çok sayıda hastalıkta yüksek EV seviyeleri ve bunların hiper pıhtılaşma ile nedensel ilişkisi gözlenmiştir9. Sonuç olarak, EV'lerin tespitinin standartlaştırılması ve prokoagülan aktivitelerinin raporlanması önemli bir araştırma alanıdır10.

Bugüne kadar, EV'lerin prokoagülan aktivitesini tespit etmek için sadece birkaç ticari kit mevcuttur. Ticari bir şirket tarafından üretilen MP-Aktivite testi ve MP-TF testi, EV'nin plazma11'deki prokoagülan aktivitesini ölçmek için kullanılan fonksiyonel testlerdir. Bu testler, EV'lerde PS ve TF'yi tespit etmek için enzime bağlı immünosorbent testlerine benzer bir prensip kullanır. Bununla birlikte, bu kitler pahalıdır ve birkaç üst düzey araştırma kurumuyla sınırlıdır. Süreç karmaşık ve zaman alıcıdır, bu da bunları klinik ortamlarda uygulamayı zorlaştırır. Ek olarak, ticari olarak geliştirilmiş bir prokoagülan fosfolipid (PPL) testi, PS pozitif EV'lerin12 seviyelerini kantitatif olarak tespit etmek için pıhtılaşma süresini ölçerek, PS içermeyen plazmayı test plazması ile karıştırır. Bununla birlikte, bu tahliller öncelikle EV'lerde PS ve TF'ye odaklanır ve dolaşımdaki EV'lerin12'de yer alabileceği diğer pıhtılaşma yollarını gözden kaçırır.

Plazma pıhtılaşma sistemi karmaşıktır ve pıhtılaştırıcılar, antikoagülanlar, fibrinolitik sistemler ve plazmada asılı EV'ler dahil olmak üzere hem "görünmez" hem de "görünür" bileşenleri içerir. Fizyolojik olarak, bu bileşenler dinamik bir denge sağlar. Patolojik durumlarda, dolaşımdaki önemli ölçüde artmış EV'ler, özellikle beyin travması, preeklampsi, kırık ve çeşitli kanser türleri olan hastalarda hiper pıhtılaşmaya katkıda bulunur13. Günümüzde klinik laboratuvarlarda pıhtılaşma durumunun değerlendirilmesi öncelikle pıhtılaşma sisteminin, antikoagülasyon sisteminin ve fibrinolizin değerlendirilmesini içermektedir 14,15,16,17. Protrombin zamanı, aktive parsiyel tromboplastin zamanı, trombin zamanı ve uluslararası normalleştirilmiş oran, pıhtılaşma sistemindeki pıhtılaşma faktörü düzeylerini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır18. Ancak son zamanlarda yapılan çalışmalar, bu testlerin bazı hastalıkların hiper pıhtılaşabilirliğini tam olarak yansıtmadığını ortaya koymuştur19. Tromboelastometri (TEG), rotasyonel TEG ve Sonoklot analizi gibi diğer tahlil yöntemleri, tam kan viskoelastik değişikliklerini ölçer20,21. Tam kan örnekleri çok sayıda kan hücresi ve trombosit içerdiğinden, bu testlerin bir bütün olarak numunenin pıhtılaşma durumunu gösterme olasılığı daha yüksektir. Bazı araştırmacılar prokoagülan aktivitede kan hücrelerinin ve trombositlerin rolü hakkında rapor vermişlerdir 22,23. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, önceki pıhtılaşma fonksiyon testlerinin mikropartiküllerin prokoagülan aktivitesindeki değişiklikleri tespit etmede zorluklarla karşılaştığını da keşfetti24. Bu nedenle, EV'lerin prokoagülan fonksiyonunun, EV'den zengin plazmada aktive edilmiş pıhtılaşma süresinin (ACT) viskoelastik ölçümleri ile değerlendirilebileceğine dair bir hipotez öne sürülmüştür.

Protokol

İnsan örneklerinin toplanması, Tianjin Tıp Üniversitesi Genel Hastanesi Tıbbi Etik Komitesi tarafından onaylandı. İnsan venöz kanının toplanması, Çin Ulusal Sağlık Komisyonu tarafından yayınlanan kılavuzu, yani WS/T 661-2020 Venöz Kan Örneklerinin Toplanması Kılavuzunu sıkı bir şekilde takip etti. Kısaca, sağlıklı bireylerden bilgilendirilmiş onam ile anterior brakiyal bölge veninden kan alındı ve örnekler 1:9 oranında %3.2'lik sodyum sitrat antikoagülan kullanılarak karıştırıldı. Sadece sodyum sitrat antikoagülan örnekleri toplandığında, ilk toplama kabı atıldı. İşleme akışı, numune alındıktan sonraki 0,5 saat içinde başlatıldı. Yetişkin sağlıklı denekler, bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra numune toplama için işe alındı. Hasta dışlama kriterleri şunlardı: (1) yakın zamanda intravasküler tromboz, (2) karaciğer ve böbrek fonksiyon bozukluğu, (3) hipertansiyon, hiperlipidemi, diyabet ve diğer kronik hastalıklar, (4) aspirin veya antikoagülan tedavi, (5) menstrüasyon ve gebelik.

1. EV'den zengin plazmanın izolasyonu

  1. Kan hücrelerini çıkarmak için numuneleri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 120 x g'da santrifüjleyin. Süpernatant, trombositten zengin plazmadır. Ardından, süpernatantın üst 1/2'sini bir pipetle yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
  2. Trombositleri çıkarmak için trombositten zengin plazmayı oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1500 x g'da santrifüjleyin. Süpernatant, trombositten fakir plazmadır. Ardından süpernatantın üst 1/2'sini yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
  3. Hücre kalıntılarını gidermek için trombositten fakir plazmayı oda sıcaklığında 2 dakika boyunca 13000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatant, EV açısından zengin plazmadır. Ardından, süpernatantın üst 1/2'sini sonraki testler için yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.

2. Analizör tarafından numunenin EV-ACT'sinin tespiti

  1. Pıhtı analizörünü açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve cihazı önceden 37 °C'ye ısıtın. Tek kullanımlık probu ve test kabını takın, ardından makinenin kalite kontrol prosedürünü başlatın.
    NOT: Ekrandaki viskoz direnç sinyal değeri düz bir çizgi olarak görüntülendiğinde, algılamaya müdahale edilmediği ve analizör durumunun kalite kontrolünün kalifiye olduğu anlamına gelir. Test prosedürü, kendi kendine test onaylandıktan sonra başlatılabilir.
  2. Örnek bilgileri sisteme girin. Ardından, 200 μL EV açısından zengin plazmayı test kabına aktarın, ardından 20 mM 170 μL kalsiyum klorür ekleyin. Başlat düğmesine tıklayın. Test kabındaki manyetik karıştırma çubuğu, numuneyi ve kalsiyum klorürü tamamen karıştıracaktır. Kapağı kapatın ve prob numune direncindeki değişikliği algılamaya başlayacaktır.
    NOT: Test bittikten sonra, analizör otomatik olarak "test tamamlandı" uyarısı verecektir. EV-ACT'nin zamanı sistem tarafından görüntülenir ve kaydedilir. Sonuç, "saniye" zaman birimi cinsinden ifade edilir. Probu atın ve kabı test edin.

3. EV'den zengin plazma numunesinin akış sitometrisine dayalı kalite kontrolü

  1. EV'ler ilk olarak boyutlarına göre tanımlandı (0.1-1 μm). Akış sitometresinin parametrelerini önceden ayarlayın ve piyasada bulunan polistiren boncukları (0.5, 0.9 ve 3.0 μm) kullanarak EV'nin " kapısını" ayarlayın (bkz.
    NOT: Boncuk karışımı, mikro-parçacıkların (0,5 ve 0,9 μm) ve trombositlerin (0,9 μm ve 3 μm) boyut aralığını kapsayan farklı çaplarda floresan kürelerden oluşur.
  2. İleri Saçılma ve Yan Saçılma voltajını ayarlayın ve 0,9 μm mikro küreciklerin uygun bölgeye düştüğünden emin olun. EV bölgesi, mikrokürenin çapına göre çizilebilir.
  3. 50 μL EV bakımından zengin plazmayı akış tüpüne aktarın, ardından 450 μL filtrelenmiş fosfat tampon salin ekleyin. Sıvıyı akış borusunda iyice karıştırın. Son olarak, akış sitometrisi25 kullanarak örnekleri tespit edin.
  4. Kısa EVs.In sayısını ölçmek için Ultra Gökkuşağı Floresan Parçacıklarını ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın, akış algılamadan önce numuneye 10 μL partikül ekleyin ve numune tespiti tamamlandıktan sonra aşağıdaki formülü kullanarak EV konsantrasyonunu hesaplayın: 10,120 * EV (#) / (mikro boncuklar * hacim) * seyreltme faktörü26.

Sonuçlar

EV'den zengin plazmanın trombin aktivasyon süresi, plazma pıhtılaşma süresi ölçümü için viskoelastik yöntem analizörü kullanılarak ölçüldü. Makine dört ana bileşenden oluşur: bir elektronik sinyal dönüştürücü, bir prob, bir algılama tankı ve bir ısıtma elemanı (Şekil 1A,B). Prob, plazma viskozitesindeki değişiklikleri tespit etmek için yüksek frekanslı ve düşük genlikli salınımlar kullanır. Günlük kalite kontrolü, öncelikle te...

Tartışmalar

Bu çalışmada, EV'den zengin plazmanın hazırlanması tarif edildi ve yöntemin rasyonalitesi akış sitometrisi kullanılarak doğrulandı. Daha sonra, rekalsifiye plazma örnekleri, viskoelastisite ilkelerine dayalı bir pıhtı analizörü kullanılarak ACT süresi için analiz edildi24. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, ultrasantrifüjleme yoluyla elde edilen EV'lerin konsantrasyonunun EV-ACT süresini kısalttığı, ultrasantrifüjlemeden sonra EV seviyelerin...

Açıklamalar

Tüm yazarlar potansiyel bir çıkar çatışması olmadığını beyan etmişlerdir.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı, hibe no. 81930031, 81901525. Ayrıca, bize makine ve teknik rehberlik sağladığı için Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd.'ye teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USAFor quantitative detection of MP
Calcium chlorideWerfen (china)002000680020 mM
Century Clot analyzerTianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., LtdThe principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cupTianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometerBD, USAUsed to detect MP
Megamix polystyrene beadsBiocytex, Marseille, France7801The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.

Referanslar

  1. Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury. Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).
  2. Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. Prothrombotic state associated with preeclampsia. Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).
  3. Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Best Practice & Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346 (2022).
  4. You, D., et al. Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis. Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).
  5. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).
  6. Zang, X., et al. Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400 (2023).
  7. Chen, Y., et al. Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty. Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).
  8. Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505 (2021).
  9. Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).
  10. Cointe, S., et al. Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).
  11. Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348 (2014).
  12. Mooberry, M. J., et al. Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).
  13. Zhao, Z., et al. Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury. Protein & Cell. 8 (11), 801-810 (2017).
  14. Bolliger, D., Tanaka, K. A. Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).
  15. Ganter, M. T., Hofer, C. K. Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices. Anesthesia & Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).
  16. Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review. Chest. 151 (1), 127-138 (2017).
  17. Maier, C. L., Sniecinski, R. M. Anticoagulation monitoring for perioperative physicians. Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).
  18. Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics. Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).
  19. Tsantes, A. G., et al. Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry. International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).
  20. Premkumar, M., et al. COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study. BMJ Open. 12 (5), e051971 (2022).
  21. Sakai, T. Comparison between thromboelastography and thromboelastometry. Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).
  22. Yan, M., et al. TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia. Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666 (2022).
  23. Yu, H., et al. Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release. The FASEB Journal. 35 (9), e21808 (2021).
  24. Gao, Y., et al. MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374 (2023).
  25. Wang, J., et al. Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice. Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).
  26. Tan, J., et al. Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282 (2021).
  27. Kubo, H. Extracellular vesicles in lung disease. Chest. 153 (1), 210-216 (2018).
  28. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and Extracellular Vesicles. Current Hypertension Reports. 18 (9), 68 (2016).
  29. Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis. Life Science. 236, 116861 (2019).
  30. Shi, J., Gilbert, G. E. Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites. Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).
  31. Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium. Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).
  32. Frey, B., Gaipl, U. S. The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles. Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).
  33. Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. Platelet removal by single-step centrifugation. Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).
  34. Chen, Y., et al. Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study. BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).
  35. Liu, Y., et al. The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404 (2022).
  36. Piwkham, D., et al. The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis. Heliyon. 9 (1), e12714 (2023).
  37. Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 198EV ile Aktive Olan P ht la ma S resiYatak Ba TestiTrombin Aktivasyon S resiSodyum Sitasyonlu Tam KanDiferansiyel Santrif jEV den Zengin PlazmaViskoelastisiteKalsiyum Klor rAnaliz CihazDo al P ht la ma S resiEV ACTSa l kl G n ll lerPreeklampsiKal a K rAkci er KanseriKan Hiperkoag lasyonuP ht la ma Fonksiyonu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır