Bestimmung der gerinnungsfördernden Aktivität extrazellulärer Vesikel (EV) mittels EV-aktivierter Gerinnungszeit (EV-ACT)

Zusammenfassung

Dieses Protokoll untersucht die Verwendung von extrazellulärem Vesikel (EV)-reichem Plasma als Indikator für die Gerinnungsfähigkeit von EV. EV-reiches Plasma wird durch einen Prozess der Differenzzentrifugation und anschließenden Rekalkifizierung gewonnen.

Zusammenfassung

Die Rolle extrazellulärer Vesikel (EV) bei verschiedenen Erkrankungen gewinnt zunehmend an Aufmerksamkeit, insbesondere aufgrund ihrer starken gerinnungsfördernden Wirkung. Es besteht jedoch ein dringender Bedarf an einem Test am Krankenbett, um die gerinnungsfördernde Aktivität von EV im klinischen Umfeld zu bewerten. In dieser Studie wird die Verwendung der Thrombinaktivierungszeit von EV-reichem Plasma als Maß für die prokoagulanziale Aktivität von EV vorgeschlagen. Standardisierte Verfahren wurden verwendet, um Natriumcitrat-Vollblut zu erhalten, gefolgt von einer Differenzzentrifugation, um EV-reiches Plasma zu erhalten. Das EV-reiche Plasma und Calciumchlorid wurden in den Testbecher gegeben, und die Änderungen der Viskoelastizität wurden in Echtzeit mit einem Analysator überwacht. Die natürliche Gerinnungszeit von EV-reichem Plasma, bezeichnet als EV-ACT, wurde bestimmt. Die Ergebnisse zeigten einen signifikanten Anstieg des EV-ACT, wenn EV aus dem Plasma gesunder Freiwilliger entfernt wurde, während es signifikant abnahm, wenn EV angereichert wurde. Darüber hinaus war EV-ACT in humanen Proben von Präeklampsie, Hüftfrakturen und Lungenkrebs erheblich verkürzt, was auf erhöhte Plasma-EV-Spiegel und die Förderung der Bluthyperkoagulation hindeutet. Mit seinem einfachen und schnellen Verfahren ist der EV-ACT ein vielversprechender Test am Krankenbett zur Beurteilung der Gerinnungsfunktion bei Patienten mit hohen EV-Plasmaspiegeln.

Einleitung

Thrombosen, die durch Hyperkoagulabilität verursacht werden, spielen eine bedeutende Rolle bei verschiedenen Erkrankungen, darunter Hirntrauma¹, Präeklampsie², Tumore³ und Frakturpatienten⁴. Der Mechanismus, der der Hyperkoagulabilität zugrunde liegt, ist komplex, und in jüngster Zeit wurde der Schwerpunkt auf die Rolle extrazellulärer Vesikel (EV) bei Gerinnungsstörungen gelegt. EVs sind vesikelartige Körper mit einer Doppelschichtstruktur, die sich von der Zellmembran lösen und einen Durchmesser von 10 nm bis 1000 nm haben. Sie sind mit einer Vielzahl von Krankheitsprozes....

Protokoll

Die Entnahme menschlicher Proben wurde von der medizinischen Ethikkommission des Allgemeinen Krankenhauses der Medizinischen Universität Tianjin genehmigt. Die Entnahme von menschlichem venösem Blut folgte streng der von der Nationalen Gesundheitskommission Chinas herausgegebenen Richtlinie, nämlich WS/T 661-2020 Guideline for Collection of Venous Blood Specimens. Kurz gesagt, Blut wurde von gesunden Personen mit informierter Zustimmung aus der vorderen Armvene entnommen, und die Proben wurden mit 3,2% Natriumcitrat-Antikoagulans in einem Verhältnis von 1:9 gemischt. Als nur Proben von Natriumcitrat-Antikoagulanzien gesammelt wurden, wurde das erste Sammelgefäß verwor....

Diskussion

In dieser Studie wurde die Herstellung von EV-reichem Plasma beschrieben und die Rationalität der Methode mittels Durchflusszytometrie überprüft. Anschließend wurden die rekalzifizierten Plasmaproben für die ACT-Zeit unter Verwendung eines Gerinnselanalysators analysiert, der auf Viskoelastizitätsprinzipien²⁴ basiert. Wie in Abbildung 3A gezeigt, wurde festgestellt, dass die Konzentration von EVs, die durch Ultrazentrifugation erhalten wurden, die EV-ACT-Zeit ve.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.